Summary
microelectrode 배열 (MEA)를 사용하여 자기편 포유류의 세포 배양에 siRNA의 스크램블 시퀀스의 특정 사이트 transfection에 대한 기사 내용은 프로토콜.
Abstract
eukaryotes 및 siRNA와 shRNA 등의 RNAi 요원의 후속 개발에 RNAi 경로의 발견, 기능 유전체학 및 치료학에 대한 특정 유전자에게 1-8 입을위한 강력한 방법을 달성했습니다. RNAi 기반 연구에 참여하고있는 주요 과제는 대상 셀에 대한 RNAi 요원의 전달입니다. 이러한 대량 electroporation 및 화학 transfection 방법 등의 전통 비 바이러스 성 전달 기술은 종종 배달을 통해 필요한 공간 컨트롤을 결여하고 9-12 가난한 transfection 효율 여유. 이러한 양이온 지질, 양이온 폴리머와 나노 입자 등의 화학 transfection 방법의 최근 발전은 매우 향상된 transfection 효율 13 결과했습니다. 그러나 이러한 기술은 아직 상당히 높은 처리량 기술, 단일 세포 연구 및 세포 세포의 상호 작용 조사를 소형화 혜택을 누릴 수 있습니다 전달 이상 정확한 공간 제어를 제공하기 위해 실패합니다.
NT는 "유전자 전달에> 최근 기술 진보. 자기편 세포의 높은 처리량 transfection 14-23, microscale electroporation을 사용하는 대부분을 사용하도록 설정 한 Microscale electroporation은 (최대 단일 셀에) 전달 이상 정확한 spatio - 시간적 제어를 제공하며, 표시되었습니다 또한 높은 효율성 19 24-26을. 달성하기 위해, electroporation 기반의 접근 방식은 화학 기반의 transfection 방법에 필요한 siRNA와 DNA 단지와 부화의 연장 기간을 (일반적으로 4 시간)이 필요하고 벌거 벗은 siRNA와 DNA의 직접 항목으로 이어지지 않는 세포 세포질에 분자. 결과 유전자 발현으로는 transfection 27 후 육시간 초부터 달성 될 수있다. 우리 연구소는 이전에 다음 ID로 자기편 포유류의 세포 배양 17-19에서 특정 사이트 transfection에 대한 microelectrode 배열의 사용 (MEA)를 보여주었습니다. MEA 기반의 접근 방식에서, 유전자 페이로드의 전송이 지역화 된 마이크로 스케일 electroporati를 통해 이루어집니다세포의 있습니다. 선택한 전극에 전기 펄스의 응용 프로그램은 자극 전극의 지역에 존재하는 세포의 electroporation로 연결 지역 전기장을 생성합니다. 마이크로 전극의 독립적 인 제어 transfection 이상의 공간과 측두엽 제어 기능을 제공하고 또한 실험 처리량을 증가와 문화 - 투 - 문화 다양성을 감소 같은 문화에 수행 할 여러 transfection 기반의 실험을 할 수 있습니다.여기 우리는 실험 설정 및 electroporation을 사용하여 휘황 태그 불가능한 시퀀스 siRNA와 자기편 헬러 전지의 대상 transfection에 대한 프로토콜을 설명합니다. 동일한 프로토콜은 또한 플라스미드 벡터의 transfection에 사용하실 수 있습니다. 또한 여기에 기술 된 프로토콜은 쉽게 약간의 수정을 포유류의 세포 라인의 다양한 확장 할 수 있습니다. 사전 정의 및 사용자 정의 모두 전극 패턴과 MEAs의 상용 여부는이 기술 접근 할 수 t를기본 세포 배양 장비와 O 대부분의 연구 실험실.
Protocol
1. MEA 준비
- 이전 18 설명 또는 멀티 채널 시스템과 같은 MEA 제조 업체의 공급 업체에서 직접 구입으로 electroporation 실험에 사용 MEAs는 두 표준 석판 술 기술을 사용하여 제조 될 수있다 (http:/www.multichannelsystems.com/) 및 알파 MED 과학 주식회사 ( http://www.MED64.com)가 . 우리 실험에 사용 된 MEAs는 고체 전자 연구 (CSSER)의 센터에서 관리 애리조나 주립 대학의 클린 룸 시설에서 - 집에서 제조되었습니다. 우리 실험에 사용 된 MEAs가 잘 1cm 내경 유리 내의 50-200 μm의 전극 직경 크기 4 배열하여 8 32 인듐 틴 산화물 전극했다. 유리는 잘 MEA를 사용 polydimethylsiloxane (PDMS)에 접합되었다.
- 셀의 이전 압력솥에 MEA를 검사eeding. 그들은 MEA의 무결성을 손상하지 않는 한, 이러한 70 %의 에탄올에 몸을 담글 수로 살균의 다른 방법, 다른 곳에서 설명 된 바와 같이 UV 치료 및 온수 치료도 사용할 수 있습니다.
- 층류 흐름 후드에 autoclaved MEA를 전송하고 표준 멸균 폴리스티렌 페트리 접시에 배치합니다. 이전 MEA에 셀을 퍼 뜨리고하기 20 분에 UV 빛을 설정하여 판상 흐름 후드를 소독. MEA는 UV 빛 흐름 후드가 UV 조명되는 동안 멸균 알루미늄 호일로 MEA를 포함하는 페트리 접시를 커버에 민감합니다.
2. MEA에 심는 세포
- 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 및 도금 1 ML 셀 미디어에서 100-200 셀 / μl의 농도로 높이를 사용하여 점착성의 포유류 세포에서 실행중인 셀 줄에서 수확 세포. 우리 실험에서는 배양 NIH 3T3 섬유 아세포 세포 라인, HELA 세포 라인과 MEA에 대한 기본 대뇌 피질과 hippocampal 뉴런에 성공했습니다.
- 세포가 층류 후드에 보육에서 MEA와 페트리 접시를 전송하고 부드럽게 잘 MEA에 사전 예열 미디어 400-500 μl (37 ° C)을 추가 퍼 뜨리고 후 2 시간. 그 세포가 여전히 부착 고르게 MEA 표면에 확산되도록하기 위해 현미경으로 확인합니다. 보육에 MEA을 다시 전송합니다. 미디어를 추가하기 전에 2 시간의 대기 기간은 세포가 MEA 표면을 준수 할 충분한 시간을 보장합니다. 너무 일찍 셀을 퍼 뜨리고 후 세포 미디어의 추가는 세포를 씻어 수 있습니다. 세포가 MEA에 잘 준수하지 않을 경우, 그 표면은 세포 접착을 향상시키기 위해 세포 부착 요인 등 aspolylysine, fibronectin과 laminin으로 처리 할 수 있습니다. 우리 HELA 세포 실험에서 우리는 일반적으로 fibronecti과 MEA 표면 처리1-2 시간을위한 N (10 μg / ML).
- 셀을 퍼 뜨리고 후 8-12 시간은 모든 죽은 세포를 제거하는 PBS로 1-2 세차를 수행합니다. 필요에 따라 셀 매체는 모든 24-48 시간을 대체 할 수 있습니다. 전형적인 실험에서 세포는 시딩 후 보통 transfection 24-48 시간에 대한 준비가되어 있습니다. electroporation 효율의 일관성을 유지하려면 그것은 문화가 electroporation 전에 합류 최소한 80 % 될 때까지 기다리는 것이 좋습니다.
3. siRNA의 특정 사이트 Transfection
- 핵산 솔루션을 준비합니다. siRNA의 transfection를 들어, 200-400 μl의 최종 볼륨을 달성하기 위해 얼음 차가운 electroporation 버퍼에 1-2 μM의 siRNA의 electroporation 솔루션을 준비합니다. 이 동영상 글에서 우리는 siRNA의 알렉사 488 복합 불가능한 시퀀스를 HELA 세포의 transfection을 보여줍니다.
- 보육의 무균 층류 후드에 셀로 MEA를 전송합니다. MEA에서 세포 미디어를 제거하고 PBS로 세척을 수행합니다. 이후 나는의 200-400 μl를 추가합니다잘에 CE 추운 1 μM의 siRNA의 electroporation 솔루션입니다.
- 대상 전극 (전기 펄스의 최적의 매개 변수를 결정하기위한 4 단계로 참조)에 양극 평방 전기 펄스를 적용 할 수 있습니다. 우리 실험에서는 전기 펄스와 MEA 본드 패드와 접촉을 할 듀얼 인라인 패키지 (DIP) 16 핀 클립을 생성하는 실용적인 악기주세요 2414A 파형 발생기를 사용했습니다. 파형 발생기는 각 전극의 선택성을 제공 할 수 demultiplexor 인쇄 회로 기판을 통해 DIP 클립에 연결 할 수 있습니다. 참조 전극은 세포 미디어에서 스틸 음극을 배치합니다. 미디어의 강 참조 전극을 낮추는 동안은 MEA 표면과 접촉하지 않도록 매우 중요합니다. 접촉되면, 그것은 세포와 MEA에 손상을 일으킬 수 있습니다. 그것은 세포 위의 1 mm의 위치에 대한 참조 전극을 낮출 것을 권장합니다. 1mm의 높이 스페이서는 심판의 위치에서 도움을 잘에 배치 할 수 있습니다erence 전극. 외부 참조 전극을 사용하는 다른 접근 방식은 음극 - 양극 쌍으로 주변 전극을 사용하는 것입니다.
- 바로 MEA의 대상 전극에 전기 펄스를 적용한 후에, 보육에 MEA을 다시 전송합니다. 5 분의 잠복기 후, 부드럽게 사전 예열 (37 ° C) 셀 미디어와 electroporation 버퍼의 75 %를 교체하십시오. 그 후, 형광 이미징은 세포에 휘황 태그 siRNA의 전달을 확인 할 수 있습니다.
4. Electroporation 매개 변수 최적화
- 펄스 진폭, 펄스 기간, 그리고 펄스의 수의 값의 범위에 대한 electroporation, 디자인 electroporation 실험을위한 최적의 전기 펄스 매개 변수를 결정합니다. 헬러 세포와 우리의 경험에서 우리는 관찰 그 미를 성공적으로 electroporation으로 이어 100 μm의 전극 크기에 대한 단일 전압 3 V 9 V에서 진폭의 펄스 및 밀리 초 (1 ~ 10) 밀리 초까지 기간nimal 세포의 죽음. 그것은 하나의 매개 변수가 한 번에 다양 할 수 있으며 다른 사람들이 지속적으로 유지하고있는 것으로 추천합니다. 펄스 매개 변수 각각에 대해 electroporation 효율을 quantitate하기 위해, 우리는 단계 4.2-4.5에서 설명 propidium 요오드화물 (PI), 셀 impermeant을 염색이 얼룩 핵산 물질, 라이브 분석 기반의 방법론을 사용합니다.
- 1 단계와 2 단계에 설명 된 지침에 따라 MEA에 세포 배양을 설정합니다.
- 이전 electroporation은 얼음 차가운 electroporation 버퍼에서 30 μg / ML PI 솔루션의 300-500 μl와 calcien는 PBS의 솔루션을 오전 4 μm의 400 μl를 준비합니다.
- 보육의 층류 후드에 MEA를 전송합니다. MEA에서 세포 미디어를 제거하고 PBS로 세척을 수행합니다. 이후 PI과 함께 얼음 차가운 electroporation 버퍼의 300-500 μl를 추가합니다.
- 대상 전극 (elec을 생성하고 적용하는 우리의 실험에 사용 된 장비에 원하는 펄스 진폭 및 기간과 전기 펄스를 적용MEA에 tric 펄스 단계 3.3)에 설명되어 있습니다. 참조 전극의 경우도 잘 MEA의 electroporation 버퍼에 강 전극을 낮추거나 참조로 인근에 전극을 사용합니다. 선택적으로 다른 전극으로 다양한 진폭 또는 기간의 펄스를 적용하여 여러 실험 같은 장치에서 수행 할 수 있습니다. 예를 들어, 32 전극 MEA에, 8 실험은 8 그룹, 4 전극으로 구성된 각 분할에 의해 32 전극을 수행 할 수 있습니다. 8 그룹의 각 다음 컨트롤로 사용할 수 있습니다 0.5 V 단위와 한 그룹에서 3 V-6 V 범위에서 다양한 진폭과 지속 시간 5 밀리 초의 단일 직사각형 전압 펄스에 의해 자극 될 수 있습니다.
- 즉시 신청 후 전압 펄스가 5 분의 보육에 MEA를 전송합니다. 그 후, 부드럽게 잘 MEA의 electroporation 버퍼의 75 %를 제거하고 따뜻한 휴대 미디어로 교체. 보육에 MEA을 다시 전송합니다.
- 2-4 시간의 잠복기 후4 μm의 300-500 μl 잘 MEA의 셀 미디어를 대체이 Calcein PBS의 솔루션입니다. 또 다른 30 분을 위해 보육에 MEA을 다시 전송합니다.
- Calcein AM과 세포 배양 후, PBS있는 두 개의 세차 후 PBS로 잘 MEA에 솔루션을 Calcein 오전 바꿉니다. 그리고 Calcein AM (여기 / 방출 - 490 nm/520 NM) - PI (535 nm/617 nm의 여기 / 방출)에 대한 필터를 광학 현미경으로 사용하는 세포의 형광 이미지를 얻을 수 있습니다. electroporation에 의한 PI의 이해는,에 세포가 빨간색 형광 및 Calcein AM 녹색 형광을 살아있는 세포의 원인이됩니다. 관찰 할 수 있습니다 세 가지 시나리오)) 살아 세포 electroporated하고 살아 (적색과 녹색을 모두 형광 것), 2) 세포 1아르하지만 electroporated (단지 녹색 형광합니다), 3하지 electroporation에 의한 죽은 세포는 (단지 빨간색 형광됩니다) . 세포 생존 능력은 전극에 살아 세포의 총 수의 퍼센트 electroporation의 EFF로 계산iciency는 PI / siRNA와로드 셀의 총 수의 비율로 계산되었다.
5. 대표 결과
그림 1은 PI와 헬러 세포의 특정 사이트 로딩을 보여줍니다. 이 전극에서만 세포가 PI (그림 1B)의 이해를 보여 관찰 할 수 있습니다. 라이브 검정이 게시물 electroporation은 세포 (그림 1A)의 생존 능력을 평가하는 데 사용 된 수행했습니다. 그림 1에 표시된 예를 들어, electroporation의 효율성과 세포 생존은 각각 81.8 %와 96.1 %입니다. 높은 세포 생존 능력과 electroporation 효율은 electroporation 펄스 매개 변수를 최적화하여 달성 될 수있다. 최적화 된 electroporation 펄스에 대한 휘황 태그 siRNA (8 V, 1 밀리 초)와 헬러 세포의 특정 사이트 transfection은 그림 2에 표시됩니다. 8 V, 1 밀리 초에서 siRNA의 electroporation 효율 ± 74.4이 발견 16.0 %와 한세포 생존 능력은 87.9 ± 8.4 % (평균으로 표시 모든 데이터가 ± 표준 편차, N = 5)으로 발견되었다.
그림 200 μm 전극 (6 V, 5 밀리 초)에 HELA 세포의 PI 1. 사이트 별 제공. A) Calcien 기반으로 실시간 분석은 2 시간 게시물 electroporation을 수행. 살아 셀은 녹색 형광으로 표시됩니다. B) 레드 형광이 전극에서 세포 PI의 이해를 보여줍니다. C) A와 B 흰색 화살표 중 겹쳐 이미지는 electroporated과 살아있는 세포를 나타냅니다. 검은 색 화살표는 죽은 세포를 나타냅니다. A, B 및 C의 흰색 원은 전극의 개요를 나타냅니다.
그림 2. 휘황 태그 scrambl와 헬러 세포의 TransfectionsiRNA의 전자 배열. A) 100 μm 전극에 HELA 세포의 이미지 알렉사 488 태그 siRNA (8 V, 1 밀리 초)와 transfected. B) 세포 핵의 이미지는 DAPI 물들. 흰색 원은 전극의 가장자리를 표시합니다.
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Discussion
이 동영상 글에서 우리는 siRNA의 스크램블 순서와 헬러 세포의 특정 사이트 transfection을위한 MEA의 사용을 보여줍니다. 이 기술의 장점 중 하나는 기본 세포 라인을 포함한 여러 세포 라인에의 적용이다. 우리 연구실은 이전에 E18 일 늙은 쥐와 스크램블 siRNA 시퀀스와 플라스미드 GFP 18, 19와 NIH-3T3 세포에서 기본 hippocampal neuronal 문화의 특정 사이트 transfection이 기술의 사용을 보여주었습니다. 우리는 또한 헬러 세포의 내생 대상 (게시되지 않은 데이터)에 대한 기능 siRNA를 제공 성공을 거두었습니다. 일반적으로 상업적으로 이용 가능한 MEA는 형광 immunostaining 기술을 사용하여, 유전자 입을의 기능 영향을 정량적 평가를 지원, 광학 이미징 (직립 현미경)과 호환됩니다. 또한, MEA의 microelectrodes는 유전자 섭동에 대한 응답으로, 이러한 기본 뉴런과 같은 세포의 전기적 활동을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.MEA의 독특한 특성은이를 실험 처리량을 증가 단일 세포 배양을 동시에 여러 개의 실험을 할 수 있습니다. 현재 MEA 기반 시스템의 주요 제한은 높은 기존의 화학 transfection 기반의 접근 방식에 비해 transfection (1μM siRNA 400 μl)에 필요한 siRNA의 많은 양이며, 따라서 시스템의 비용 효율성을 제한합니다. 이것은 부분적으로 몇 microliters보다 이하로 siRNA의 electroporation 솔루션의 전체 볼륨을 낮추십시오 MEA 기반 시스템 mircofluidics을 도입하여 극복 할 수 있습니다. 또한, microfluidics 다른 siRNA 분자의 일련 전달을 사용하도록 설정할 수 있습니다, 따라서 크게 MEA 기반 기술의 처리량을 향상. 또한 siRNA 분자는 세포 심는 이전 microelectrodes에서 발견 할 수 있으며, 다음 siRNA 분자는 역 electroporation 15, 23에 의해 세포로 transfected 수 있습니다. 이 기술의 추가 개발은 새로운 높은 t을 제공합니다유전자 조작 연구, hroughput 효율적이고 저렴한 비용으로 방법.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum |
Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen |
12492-013 95057-448 09-757F 16000-044 |
Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM |
| Trypsin EDTA | Mediatech, Inc. | 25-053-CL | |
| PBS | Mediatech, Inc. | 21-040-CV | |
| Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA | Qiagen, Inc. | 1027292 | |
| Electroporation buffer | Biorad Laboratories | 165-2677 | |
| Waveform generator | Pragmatic | 2414A | Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used. |
References
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