Hoog rendement, Site-specific Transfectie van adherente cellen met siRNA Met behulp van micro-elektrode arrays (MEA)

Summary

Het artikel beschrijft de protocol voor plaatsspecifieke transfectie van gecodeerde sequentie van siRNA in een hechtende zoogdiercelkweek met een micro-elektrode array (MEA).

Abstract

De ontdekking van RNAi pathway in eukaryoten en de daaropvolgende ontwikkeling van RNAi middelen, zoals siRNA en shRNA, hebben een krachtige werkwijze voor silencing specifieke genen ^1-8 voor functional genomics and therapeutics. Een belangrijke uitdaging die betrokken zijn bij RNAi gebaseerde studies is de levering van RNAi agenten gerichte cellen. Traditionele niet-virale aflevering technieken, zoals elektroporatie bulk en chemische transfectie methoden vaak niet de vereiste ruimtelijke controle productietijd en ^9-12 veroorloven slechte transfectie-efficiëntie. Recente vooruitgang in chemische transfectiewerkwijzen zoals kationische lipiden, kationische polymeren en nanodeeltjes hebben geresulteerd in sterk verbeterde transfectie-efficiëntie ^13. Echter, deze technieken nog steeds niet precies ruimtelijke controle over de levering die enorm kunnen profiteren miniatuur high-throughput technologieën, enkele cel studies en onderzoeken van cel-cel interacties aan te bieden.

nt "> Recente technologische ontwikkelingen in gentherapie hebben ingeschakeld high-throughput transfectie van hechtende cellen ^{14 tot 23,} waarvan een meerderheid te gebruiken microschaal elektroporatie. Microscale elektroporatie biedt nauwkeurige spatio-temporele controle over de levering (tot enkele cellen) en is aangetoond Bovendien te bereiken hoge rendementen ^{19, 24-26.,} kan elektroporatie benaderingen vereisen een langere incubatietijd (gewoonlijk 4 uur) met siRNA en DNA complexen als noodzakelijk chemische basis transfectiewerkwijzen en leiden tot directe invoer van naakt DNA en siRNA moleculen in de cel cytoplasma. Bijgevolg genexpressie kan worden bereikt al zes uur na transfectie ^27. Onze lab eerder het gebruik van micro-elektrode arrays (MEA) voor plaatsspecifieke transfectie in zoogdiercellen hechtende celkweken ^17-19 aangetoond. In de MEA aanpak, wordt de levering van genetische lading bereikt via lokale micro-schaal electroporatiop cellen. Een toepassing van elektrische puls om geselecteerde elektroden genereert lokaal elektrisch veld dat leidt tot elektroporatie van cellen in de regio van de gestimuleerde elektrodes. De onafhankelijke controle van de micro-elektroden biedt ruimtelijke en temporele controle transfectie en kunnen meerdere transfectie gebaseerde experimenten worden uitgevoerd op dezelfde cultuur verhogen van de doorvoer en experimentele verminderen cultuur naar cultuur variabiliteit.

Hier beschrijven we de experimentele opstelling en het protocol voor gerichte transfectie van het aanklevende HeLa cellen met een fluorescent gelabeld gecodeerde volgorde siRNA met behulp van elektroporatie. Hetzelfde protocol kan ook gebruikt worden voor transfectie van plasmide vectoren. Daarnaast kan de hier beschreven protocol eenvoudig worden uitgebreid om verschillende zoogdiercellijnen met kleine modificaties. Commerciële beschikbaarheid van MEA's met zowel vooraf gedefinieerde en aangepaste elektrode patronen te maken van deze techniek toegankelijk to meest onderzoekslaboratoria met basis celkweek apparatuur.

Protocol

1. MEA Voorbereiding

1. MMO voor gebruik in elektroporatie experimenten kan worden vervaardigd met behulp van standaard fotolithografie techniek zoals eerder beschreven ¹⁸ of gekocht rechtstreeks van leveranciers van MEA fabrikanten zoals Multi Channel Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) en Alpha MED Scientific, Inc ( http://www.MED64.com) . De MEA gebruikt in onze experimenten werden gefabriceerd in-house bij de clean room faciliteit in Arizona State University, dat wordt beheerd door het Centrum voor Solid State Electronics Research (CSSER). De MEA gebruikt in onze experimenten 32 indium tin oxide elektrodes had in een 8 bij 4 array met elektrode diameter maten 50 tot 200 micrometer binnen een 1 cm binnendiameter glas goed. Het glas was goed gebonden aan de MEA behulp polydimethylsiloxaan (PDMS).
2. Steriliseer het MEA in een autoclaaf voor cel seeding. Andere sterilisatiemethoden zoals onderdompelen in 70% ethanol, UV behandeling en warmwaterbehandeling zoals elders worden gebruikt zolang zij niet de integriteit van de MEA.
3. Breng de geautoclaveerde MEA naar een laminaire stroming kap en plaats deze in een standaard steriele polystyreen petrischaal. Voorafgaand aan zaaien cellen op de MEA, steriliseren laminaire stroming kap door het inschakelen van het UV-licht gedurende 20 minuten. Als het MEA gevoelig is voor UV licht dekking van de petrischaal met het MEA met steriele aluminiumfolie terwijl de stroomkap onder UV-belichting.

2. Zaaien Cellen op de MEA

1. Oogst cellen van een lopende hechtende cellijn van zoogdiercellen met trypsine / EDTA en heffen tot een concentratie van 100-200 cellen / ul in 1 ml celmedium voor plating. In onze experimenten hebben we succesvol kweken NIH 3T3 fibroblasten cellijn HeLa cellijn en primaire corticale en hippocampusneuronen de MEA.
2. 2 uur na uitzetten van de cellen de Petri schaal met de MEA overdracht van de incubator met laminaire stroming kap voorzichtig 400-500 pi pre verwarmd media (37 ° C) en aan de MEA. Controleer onder de microscoop te waarborgen dat cellen nog aan en gelijkmatig op het oppervlak MEA. Breng de MEA terug naar de incubator. De 2 uur wachttijd vóór de toevoeging van media verzekert voldoende om de cellen te hechten aan het oppervlak MEA. Toevoeging van celmedium te snel na het zaaien de cellen kan wegspoelen de cellen. Als cellen niet goed hecht aan de MEA, kan het oppervlak worden behandeld met celhechting factoren aspolylysine, fibronectine en laminine om celhechting te verbeteren. In onze HeLa cel experimenten hebben we meestal de behandeling van de MEA oppervlak met fibronectin (10 ug / ml) gedurende 1-2 uur.
3. 8 tot 12 uur na het zaaien van de cellen, voert u 1 tot 2 wasbeurten met PBS om alle dode cellen te verwijderen. Cell medium kan vervangen elke 24-48 uur als dat nodig is. In een typisch experiment worden de cellen gewoonlijk klaar voor transfectie 24-48 uur na uitzaaien. Om consistentie in elektroporatie efficiëntie te handhaven is het raadzaam om te wachten tot de cultuur ten minste 80% confluente voor elektroporatie.

3. Plaatsspecifieke Transfectie van siRNA

1. Bereid nucleïnezuur oplossing. Voor siRNA transfectie bereid een 1-2 uM siRNA elektroporatie oplossing in ijskoude elektroporatie buffer tot een eindvolume van 200-400 ul bereiken. In deze video artikel tonen we de transfectie van HeLa cellen met Alexa 488 geconjugeerde gecodeerde sequentie van siRNA.
2. Breng de MEA met cellen van de incubator steriele laminaire stroming kap. Verwijder de cel media uit de MEA en het uitvoeren van een wassen met PBS. Daarna voeg 200-400 ui van de ice koude 1 uM siRNA elektroporatie oplossing van het goed.
3. Breng anodische vierkante elektrische pulsen om de beoogde elektroden (zie stap 4 voor het bepalen van optimale parameters van de elektrische puls). In onze experimenten hebben we gebruik gemaakt van een Pragmatische Instruments 2414A golfvorm generator om elektrische pulsen en een dual-inline-pakket (DIP) 16 pin clip om contact te maken met de MEA band pads genereren. De golfvorm generator kan worden aangesloten op de DIP clip via een demultiplexor printplaat om de selectiviteit van afzonderlijke elektroden leveren. Voor de referentie-elektrode Plaats een stalen kathode in de cel media. Terwijl het verlagen van de stalen referentie-elektrode in de media is het uiterst belangrijk dat het geen contact maakt met het oppervlak MEA. Bij contact kan schade aan de cellen en de MEA. Het wordt aanbevolen om de referentie-elektrode verlagen tot een positie van 1 mm boven de cellen. Een spacer met een hoogte van 1 mm worden geplaatst in de put te helpen bij de plaatsing van reference elektrode. Een alternatieve benadering voor een externe referentie-elektrode is liggende elektroden als kathode-anode paren.
4. Onmiddellijk na het aanbrengen van de elektrische pulsen om de beoogde elektroden op de MEA, overdragen MEA naar de incubator. Na een incubatieperiode van 5 minuten voorzichtig vervangen 75% van de elektroporatie buffer met voorverwarmde (37 ° C) cell media. Later kunnen fluorescerende beeldvorming worden gedaan om de levering van fluorescent gelabeld siRNA aan de cellen te bevestigen.

4. Elektroporatie Parameter Optimization

1. Om de optimale elektrische stroom parameters bepalen voor elektroporatie, design elektroporatie experimenten voor verschillende waarden van pulsamplitude, pulsduur en het aantal pulsen. In onze ervaring met HeLa-cellen, stellen we vast dat een spanningspuls van amplitude van 3 V 9 V en duur van 1 msec tot 10 msec een elektrode van 100 urn tot succesvolle elektroporatie met miNimal celdood. Het is onze aanbeveling dat een parameter worden gevarieerd tijd en anderen constant gehouden. Om de electroporatie efficiency te kwantificeren voor elk van de pulsparameters gebruiken we propidiumjodide (PI), een cel impermeant kleurstof die vlekken nucleic materiaal en levende assay gebaseerde methode, zoals beschreven in stappen 4.2-4.5.
2. Opzet van een celkweek op de MEA volgens de instructies beschreven in stappen 1 en 2.
3. Vóór elektroporatie bereiden een 300-500 pl van 30 ug / ml PI oplossing in ijskoude elektroporatiebuffer en 400 ul van 4 uM calcien uur in PBS.
4. Breng de MEA van de incubator de laminaire stroming kap. Verwijder de cel media uit de MEA en het uitvoeren van een wassen met PBS. Daarna voeg 300-500 ui van de ijskoude elektroporatiebuffer met PI.
5. Breng elektrische pulsen met de gewenste puls amplitude en duur om de beoogde elektroden (De apparatuur die wordt gebruikt in onze experimenten voor het genereren en toepassen van de elektronischesche puls de MEA wordt beschreven in stap 3.3). Voor de referentie-elektrode, hetzij een stalen elektrode goed zakken in de elektroporatie buffer in de MEA of gebruik de naburige elektrode als referentie. Door selectief impulsen van veranderlijke amplitude of duur om verschillende elektroden meerdere experimenten worden uitgevoerd op hetzelfde apparaat. Bijvoorbeeld op een 32 electrode MEA kan 8 experimenten worden uitgevoerd door het splitsen van de 32 elektroden in 8 groepen, elk bestaande uit 4 elektroden. Elk van de 8 groepen kunnen vervolgens worden gestimuleerd door een rechthoekige spanningspuls van 5 msec duur met amplitudes variërend 3 V-6 V bereik van 0,5 V stappen en een groep kan worden gebruikt als een controle.
6. Onmiddellijk na het aanbrengen van de spanningspulsen overdragen MEA de incubator gedurende 5 minuten. Daarna voorzichtig en verwijder 75% van de elektroporatie buffer van de MEA en vervang deze door warme cel media. Breng de MEA terug naar de incubator.
7. Na een incubatietijd van 2-4 uuren vervangen celmedia in de MEA met 3-500 pl van 4 uM calceïne AM oplossing in PBS. Breng de MEA naar incubator gedurende 30 minuten.
8. Na de incubatie van de cellen met Calcein AM, vervangen Calcein AM oplossing in de MEA goed met PBS na twee wassen met PBS. Verkrijgen fluorescerende beelden van cellen met behulp van een optische microscoop met filters voor PI (excitatie / emissie - 535 nm/617 nm) en Calcein AM (excitatie / emissie - 490 nm/520 nm). De opname van PI, als gevolg van elektroporatie, zorgt ervoor dat cellen in rood fluoresceren en de calceïne AM zorgt ervoor dat cellen die in leven zijn te fluoresceren groen. Drie mogelijke scenario's die kunnen worden waargenomen zijn: 1) cel geëlektroporeerde en levend (zal fluoresceren zowel rood en groen), 2) cellen in leven, maar niet geëlektroporeerd (zal fluoresceren enkel groen) en 3) Cellen doden als gevolg van elektroporatie (zal fluoresceren alleen rood) . De levensvatbaarheid van de cellen werd berekend als percentage van het totale aantal cellen in leven op de elektrode en de elektroporatie efficiency werd berekend als percentage van het totale aantal cellen geladen met PI / siRNA.

5. Representatieve resultaten

Figuur 1 toont de plaatsspecifieke laden van HeLa cellen met PI. Kan worden waargenomen dat alleen cellen op de elektrode een opname van PI (Figuur 1B) tonen. Een live assay uitgevoerd na elektroporatie werd gebruikt om de levensvatbaarheid van cellen (Figuur 1A) beoordelen. De elektroporatie efficiency en cellevensvatbaarheid voor het voorbeeld in figuur 1 is 81,8% en 96,1% respectievelijk. Hoge cellevensvatbaarheid en elektroporatie efficiency kan worden bereikt door het optimaliseren van de elektroporatie pulsparameters. Plaatsspecifieke transfectie van HeLa cellen met fluorescent gelabeld siRNA voor een optimale elektroporatie puls (8 V, 1 msec) wordt getoond in figuur 2. De efficiëntie voor de elektroporatie siRNA op 8 V, 1 msec bleek 74,4 ± 16,0% encellevensvatbaarheid bleek 87,9 ± 8,4% (gegevens weergegeven als gemiddelde ± standaarddeviatie, N = 5).

Figuur 1. Site-specifieke aflevering van PI in HeLa cellen een 200 urn elektrode (6 V, 5 msec). A) Calcien gebaseerd levende assay uitgevoerd 2 uur na elektroporatie. Levende cellen worden aangegeven door groene fluorescentie. B) rode fluorescentie toont de opname van PI door cellen op de elektrode. C) Een gesuperponeerd beeld van A en B. De witte pijlen geven aan cellen die zijn geëlektroporeerde en levend. De zwarte pijlen geven cellen die dood zijn. De witte cirkel in A, B en C geeft de omtrek van de elektrode.

Figuur 2. Transfectie van HeLa cellen met fluorescent gelabeld scramble sequentie van siRNA. A) Afbeelding van HeLa cellen op een 100 urn elektrode getransfecteerd met Alexa 488 gelabeld siRNA (8 V, 1 msec). B) Afbeelding van celkernen gekleurd met DAPI. De witte cirkel geeft de rand van de elektrode.

Discussion

In deze video artikel tonen we het gebruik van MEA voor plaatsspecifieke transfectie van HeLa cellen met scrambled siRNA sequentie van. Een van de voordelen van deze technologie is de toepasbaarheid van verschillende cellijnen waaronder primaire cellijnen. Onze lab eerder aangetoond dat het gebruik van deze technologie voor plaatsspecifieke transfectie van primaire hippocampale neuronale kweken van E18 dagen oude ratten en NIH-3T3 cellen met scrambled siRNA sequenties en GFP plasmide ^{18, 19.} We hebben ook succes in het leveren functioneel siRNA tegen een endogene target in HeLa cellen (ongepubliceerde gegevens). Een typisch commercieel beschikbare MEA Geschikt optische beeldvorming (rechtop microscoop), waardoor kwantitatieve beoordeling van functionele gevolgen van gene silencing, met fluorescent immunokleuring technieken. Bovendien kan de micro-elektroden in MEA worden gebruikt om elektrische activiteit van cellen, zoals primaire neuronen volgen in reactie op genetische verstoring. Deunieke karakter van MEA maakt gelijktijdige meerdere experimenten op een celkweek, waardoor de experimentele doorvoer. Momenteel een grote beperking van de MEA gebaseerd systeem de grote hoeveelheid siRNA nodig voor transfectie (400 ul 1 uM siRNA) die hoog is in vergelijking met conventionele chemische transfectie benaderingen, hetgeen de rentabiliteit van het systeem. Dit kan gedeeltelijk worden ondervangen door het opnemen mircofluidics het MEA systeem gebruiken om de totale hoeveelheid siRNA elektroporatie oplossing af tot minder dan een paar microliter. Bovendien kan de microfluidics toestaat seriële levering van verschillende siRNA moleculen, om zodoende sterk verbeteren van de doorvoer van de MEA gebaseerde technologie. Als alternatief kan siRNA moleculen worden gespot op de micro-elektroden vóór cel enten en de siRNA moleculen kunnen worden getransfecteerd in cellen door elektroporatie reverse ^{15, 23.} De verdere ontwikkeling van deze technologie biedt een nieuwe high-throughput, efficiënte en goedkope manier voor genetische manipulatie studies.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.