Høj effektivitet, Site-specifik Transfektion af adhærente celler med siRNA Brug mikroelektrode Arrays (MEA)

Summary

Artiklen indeholder oplysninger om protokollen for stedspecifik transfektion af krypterede sekvens af siRNA i en adhærent pattedyrcellekultur ved hjælp af en mikroelektrode array (MEA).

Abstract

Opdagelsen af RNAi vej i eukaryoter og den efterfølgende udvikling af RNAi midler, såsom siRNA og shRNA, har opnået en potent metode til tavshed specifikke gener ^1-8 for funktionel genomforskning og sygdomsbehandling. En stor udfordring er involveret i RNAi baserede studier er levering af RNAi midler til målrettede celler. Traditionelle ikke-virale leveringsteknikker, såsom bulk-elektroporering og kemiske transfektionsfremgangsmåder mangler ofte den nødvendige rumlige kontrol med levering og give dårlige transfektionseffektiviteter ^9-12. Nylige fremskridt inden for kemiske transfektionsfremgangsmåder, såsom kationiske lipider, kationiske polymerer og nanopartikler har ført til en meget forbedret transfektionseffektiviteter ^13. Men disse teknikker stadig undlader at tilbyde præcis rumlig kontrol over leveringen, der kan uhyre gavne miniaturiserede high-throughput teknologier, encellede undersøgelser og efterforskning af celle-celle-interaktioner.

nt "> Seneste teknologiske fremskridt inden for gen-levering har gjort det muligt high-throughput transfektion af adhærente celler ^14-23, hvoraf størstedelen bruger mikroskala elektroporation. Individuel elektroporation giver præcise spatio-temporale kontrol over levering (op til enkelte celler), og har vist sig at opnå høje virkningsgrader ^{19, 24-26.} Derudover reagerer elektroporering tilgange ikke kræver en lang periode med inkubation (typisk 4 timer) siRNA og DNA-komplekser som nødvendigt kemisk baserede transfektionsfremgangsmåder og føre til direkte optagelse af nøgent siRNA og DNA molekyler ind i cellecytoplasmaet. Som følge genekspression kan opnås så tidligt som seks timer efter transfektion ^27. Vores laboratorium har tidligere vist, at anvendelse af mikroelektrode-arrays (MEA) til stedspecifik transfektion i adhærente mammale cellekulturer ^17-19. I MEA tilgang, er levering af genetisk nyttelast opnås via lokaliseret mikroskala electroporatiden af ​​celler. En anvendelse af elektrisk puls til udvalgte elektroder skaber lokale elektriske felt der fører til elektroporation af celler, der forefindes i området af de stimulerede elektroder. Den uafhængige kontrol af mikro-elektroder giver rumlige og tidsmæssige kontrol over transfektion og også giver flere transfektionsforsøg baserede eksperimenter, der skal udføres på den samme kultur øger den eksperimentelle gennemløb og reducere kultur-til-kultur variabilitet.

Her beskriver vi forsøgsopstillingen og protokollen for målrettet transfektion af adhærente HeLa-celler med en fluorescens mærket kodet sekvens siRNA anvendelse af elektroporation. Den samme protokol kan også anvendes til transfektion af plasmidvektorer. Endvidere kan protokollen beskrevet her kan let udvides til flere forskellige mammale cellelinier med mindre modifikationer. Kommercielle tilgængelighed af multilaterale miljøaftaler med både prædefinerede og custom elektrodemønstre gør denne teknik tilgængelig to fleste forskningslaboratorier med grundlæggende cellekultur udstyr.

Protocol

1. MEA Forberedelse

1. MMA til brug i elektroporation eksperimenter kan enten fremstilles ved anvendelse af standard fotolitografiske teknik som tidligere beskrevet ¹⁸ eller købes direkte fra leverandører af MEA fabrikanter såsom Multi Channel Systems (http:/www.multichannelsystems.com/) og Alpha MED Scientific, Inc. ( http://www.MED64.com) . De MMA anvendes i vore eksperimenter blev fremstillet in-house på rentrumsfacilitet i Arizona State University, der administreres af Center for Solid State Electronics Research (CSSER). De MMA, der anvendes i vores eksperimenter havde 32 indiumtinoxid elektroder i en 8 med 4-array med elektrode diameterstørrelser 50 til 200 um inden for en 1 cm indvendig diameter glas godt. Glasset blev godt bundet på MEA hjælp polydimethylsiloxan (PDMS).
2. Sterilisere MEA i en autoklav inden celle seeding. Andre fremgangsmåder til sterilisering såsom en neddypning i 70% ethanol, kan UV-behandling og varmt vand behandling som beskrevet andetsteds også anvendes, så længe de ikke bringer integriteten af ​​MEA.
3. Overfør autoklaverede MEA til en laminar flow hætte og læg den i en standard steril polystyren petriskål. Forud for podning celler på MEA, sterilisere laminar strømningshætte ved at tænde for UV-lys i 20 minutter. Hvis MEA er følsomt over for UV-lys dækker petriskålen indeholdende MEA med sterilt aluminiumsfolie, mens strømmen hætten er under UV-belysning.

2. Seeder Celler i MEA

1. Høst celler fra en kørende cellelinie af adhærente mammale celler under anvendelse af trypsin / EDTA og løfte dem til en koncentration på 100 til 200 celler / gl i 1 ml cellemedier til galvanisering. I vore forsøg har vi haft succes med dyrkning af NIH 3T3 fibroblaster cellelinie, HeLa-cellelinje og primære corticale og hippocampale neuroner på MEA.
2. 2 timer efter podning af cellerne overføre petriskål med MEA fra inkubatoren til laminar strømningshætte og forsigtigt tilsættes 400 til 500 pi præ opvarmede media (37 ° C) til MEA godt. Check under mikroskop for at sikre, at cellerne stadig er fastgjort og jævnt fordelt på MEA overfladen. Overfør MEA tilbage til inkubatoren. The 2 hr venteperiode før tilsætningen af ​​medier sikrer tilstrækkelig tid for cellerne til at klæbe til MEA overflade. Tilsætning af cellemedier for hurtigt efter podning af cellerne kan vaskes væk af cellerne. Hvis celler ikke klæber godt på MEA, kan dens overflade behandles med cellevedhæftningsfaktorer sådan aspolylysine, fibronectin og laminin til at forbedre celleadhæsion. I vores HeLa celle eksperimenter vi typisk behandle MEA overflade med fibronectin (10 ug / ml) i 1-2 timer.
3. 8-12 timer efter podning af cellerne, udføres 1-2 gange vask med PBS for at fjerne alle døde celler. Cellemedium kan erstattes hver 24 til 48 timer efter behov. I et typisk forsøg er cellerne normalt klar til transfektion 24-48 timer efter podning. At bevare sammenhængen i elektroporation effektivitet anbefales det at vente, indtil kulturen er mindst 80% sammenflydende før elektroporation.

3. Stedspecifik Transfektion af siRNA

1. Fremstille nucleinsyre opløsning. For siRNA transfektion fremstille en 1-2 pM siRNA elektroporering opløsning i iskold elektroporation buffer for at opnå et slutvolumen på 200 til 400 ul. I denne video artikel vil vi demonstrere transfektion af HeLa-celler med Alexa 488 konjugeret kodet sekvens af siRNA.
2. Overfør MEA med celler fra inkubatoren til sterile laminar strøm-hætte. Fjern cellemediet fra MEA og udføre en vask med PBS. Derefter tilsættes 200-400 pi af den ice kold 1 uM siRNA elektroporation løsning til brønden.
3. Anvend anodiske firkantede elektriske impulser til de målrettede elektroder (Se trin 4 for at bestemme optimale parametre af den elektriske impuls). I vores eksperimenter har vi brugt en pragmatisk Instruments 2414A waveform generator til at generere elektriske impulser og en dual-inline-pakke (DIP) 16 pin clip til at tage kontakt med de MEA obligation puder. Når bølgeformgeneratoren kan forbindes med DIP klippet via en demultiplekser printkort at tilvejebringe selektivitet individuelle elektroder. For referenceelektroden, placere en stål katode i cellemediet. Samtidig sænke jern-og referenceelektroden i medierne er det meget vigtigt at sikre, at den ikke får kontakt med MEA overflade. Ved kontakt, kan det forårsage skade på cellerne og MEA. Det anbefales at sænke referenceelektroden til en position på 1 mm over cellerne. En spacer med en højde på 1 mm, kan anbringes i brønden for at hjælpe med placeringen af ​​reference elektrode. En alternativ fremgangsmåde til anvendelse af en ekstern referenceelektrode er at anvende tilstødende elektroder som katode-anode par.
4. Umiddelbart efter anvendelsen af ​​de elektriske impulser til de målrettede elektroder på MEA, overføre MEA tilbage til inkubatoren. Efter en inkubationstid på 5 min, udskiftes forsigtigt 75% af elektroporation puffer med foropvarmet (37 ° C) cellemedier. Senere kan fluorescerende billeddannelse gøres for at bekræfte leveringen af ​​fluorescens-mærkede siRNA til cellerne.

4. Elektroporation Parameter Optimering

1. For at bestemme de optimale elektriske pulsparametre for elektroporering, design elektroporation eksperimenter for en række værdier af impulsamplitude, pulsvarighed, og antallet af pulser. I vores erfaring med HeLa-celler, observerede vi, at en enkelt spændingsimpuls i amplitude fra 3 V til 9 V og varighed fra 1 msek til 10 msek på en elektrode størrelse på 100 um førte til vellykket elektroporering med miNimal celledød. Det er vores anbefaling, at én parameter varieres ad gangen, og andre holdes konstant. Til kvantificering af elektroporation effektiviteten for hver af pulsparametre, bruger vi propidiumiodid (PI), en celle impermeabel farvestof, der farver nucleinsyre materiale og levende assay metode, som beskrevet i trin fra 4,2 til 4,5.
2. Etablere en cellekultur på MEA efter anvisningerne beskrevet i trin 1 og 2.
3. Før elektroporering fremstilling af en 300 til 500 pi af 30 ug / ml PI opløsning i iskold elektroporation puffer og 400 pi af 4 uM calcien AM opløsning i PBS.
4. Overfør MEA fra inkubatoren til laminært stinkskab. Fjern cellemediet fra MEA og udføre en vask med PBS. Derefter tilsættes 300-500 ul af iskold elektroporation buffer med PI.
5. Påfør elektriske impulser med ønsket pulsamplitude og varighed til de målrettede elektroder (Det udstyr, der anvendes i vores eksperimenter til generering og anvendelse af elektrotrisk impuls til MEA er beskrevet i trin 3.3). For referenceelektroden enten sænke en stål elektrode ind i elektroporation buffer i MEA godt eller bruge de tilstødende elektrode som reference. Ved selektivt at anvende pulser af varierende amplituder eller varigheder for forskellige elektroder flere eksperimenter kan udføres på samme enhed. For eksempel, på en 32 elektrode MEA kan otte forsøg udføres ved at opdele de 32 elektroder i 8 grupper, hver bestående af fire elektroder. Hver af de 8 grupper kan derefter stimuleres af et enkelt rektangulært spændingsimpuls af varigheden 5 msek med amplituder varierer i 3 V-6 V området på 0,5 V mellem og en gruppe, kan anvendes som en kontrol.
6. Umiddelbart efter anvendelsen af ​​de spændingsimpulser overføre MEA til inkubatoren i 5 min. Bagefter forsigtigt fjerne 75% af elektroporation buffer fra MEA godt og erstatte den med varme cellemedier. Overfør MEA tilbage til inkubatoren.
7. Efter en inkubationsperiode på 2-4 hrerstatte cellemediet i MEA godt med 300-500 pi af 4 uM Calcein AM opløsning i PBS. Overfør MEA tilbage til inkubatoren i yderligere 30 minutter.
8. Efter inkubering af cellerne med calcein AM, den Calcein erstatte AM opløsning i MEA godt med PBS efter to vaske med PBS. Opnå fluorescerende billeder af celler ved anvendelse med et optisk mikroskop med filtre til PI (Excitation / emission - 535 nm/617 nm) og Calcein AM (Excitation / emission - 490 nm/520 nm). Optagelsen af ​​PI, på grund af elektroporering, forårsager celler til fluorescerer rødt og Calcein AM forårsager celler, der er i live til fluorescerer grønt. Tre mulige scenarier, der kan iagttages, er 1) celle elektroporerede og levende (vil fluorescere både rød og grøn), 2) celler i live, men ikke elektroporeret (vil fluorescere bare grøn) og 3) Celler døde på grund af elektroporation (vil fluorescere bare rød) . The cellelevedygtighed blev beregnet som en procent af det totale antal celler i live på elektroden og elektroporation efficiency blev beregnet som procent af det totale antal celler fyldt med PI / siRNA.

5. Repræsentative resultater

Figur 1 viser den stedspecifikke belastning af HeLa-celler med PI. Det kan konstateres, at kun celler på elektroden viser en optagelse af PI (fig. 1 B). En levende assay udført efter elektroporering blev anvendt til at vurdere levedygtigheden af celler (figur 1A). The elektroporation effektivitet og cellelevedygtighed for eksempel vist i figur 1, er 81,8% og 96,1% hhv. Høj cellelevedygtighed og elektroporation effektivitet kan opnås ved at optimere elektroporering pulsparametre. Stedspecifik transfektion af HeLa-celler med fluorescens-mærkede siRNA for en optimeret elektroporation impuls (8 V, 1 ms) er vist i figur 2. The elektroporation virkningsgrad for siRNA ved 8 V, 1 ms viste sig at være 74,4 ± 16,0% ogcellelevedygtighed blev fundet at være 87,9 ± 8,4% (alle data repræsenteret som middelværdi ± standardafvigelse, n = 5).

Fig. 1. Stedspecifik afgivelse af PI i HeLa-celler på en 200 um elektrode (6 V, 5 ms). A) Calcien baseret levende assay udført to timer efter elektroporering. Levende celler er vist med grøn fluorescens. B) Red fluorescens viser optagelsen af ​​PI af celler på elektroden. C) En overlejrede billede af A og B. De hvide pile angiver celler, der er elektroporerede og levende. De sorte pile angiver celler, der er døde. Den hvide cirkel i A, B og C viser omridset af elektroden.

Figur 2. Transfektion af HeLa-celler med fluorescens-mærkede scramble sekvens af siRNA. A) Billede af HeLa celler på en 100 um elektrode transficeret med Alexa 488 mærkede siRNA (8 V, 1 ms). B) Billede af cellekerner blev farvet med DAPI. Den hvide cirkel markerer kanten af ​​elektroden.

Discussion

I denne video artikel vil vi demonstrere brugen af ​​MEA til stedspecifik transfektion af HeLa-celler med røræg sekvens af siRNA. En af fordelene ved denne teknologi er dens anvendelighed i forskellige cellelinier, herunder primære cellelinjer. Vores laboratorium har tidligere vist, at anvendelsen af denne teknologi til stedspecifik transfektion af primære hippocampale neuronale kultur fra E18 dage gamle rotter og NIH-3T3-celler med scrambled siRNA sekvenser og GFP-plasmid ^{18, 19.} Vi har også haft succes med at levere funktionelle siRNA mod en endogen mål i HeLa-celler (upublicerede data). En typisk kommercielt tilgængelig MEA er kompatibel med optisk afbildning (opretstående mikroskop), muliggør kvantitativ vurdering af funktionelle virkninger gene silencing anvendelse af fluorescerende immunfarvning teknikker. Endvidere kan mikroelektroder i MEA anvendes til at overvåge elektriske aktivitet i celler, såsom primære neuroner som reaktion på genetisk perturbation. Denunikke natur af MEA muliggør samtidige flere eksperimenter på en enkelt cellekultur, hvorved det eksperimentelle gennemløb. Øjeblikket en væsentlig begrænsning med MEA system er den store mængde siRNA nødvendig for transfektion (400 pi 1 uM siRNA), som er høj sammenlignet med traditionelle kemiske transfektion tilgange og begrænser således omkostningseffektiviteten af ​​systemet. Dette kan delvis overvindes ved at inkorporere mircofluidics med MEA system for at reducere det samlede volumen af ​​siRNA elektroporation opløsning til mindre end et par mikroliter. Endvidere kan mikrofluidik muliggøre seriel afgivelse af forskellige siRNA-molekyler, hvilket i høj grad øge throughput af MEA baseret teknologi. Alternativt kan siRNA-molekyler blive opdaget på mikroelektroder før cellepodning og derefter siRNA-molekyler kan transficeres ind i celler ved revers elektroporering ^{15, 23.} Yderligere udvikling af denne teknologi tilbyder en ny high-throughput, effektiv og billig metode til genmanipulation undersøgelser.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.