微小電極アレイを用いたsiRNAの付着細胞への高効率、サイト固有のトランス体（MEA）

Summary

記事の詳細は微小電極アレイ（MEA）を使用して付着した哺乳動物細胞培養におけるsiRNAのスクランブル配列の部位特異的なトランスフェクションするためのプロトコル。

Abstract

このようなsiRNAおよびshRNAなどの真核生物とRNAi剤のその後の開発におけるRNAi経路の発見は、機能ゲノミクスおよび治療 ​​のための特定の遺伝子の^1-8を黙らせる強力な方法を実現しました。 RNAiに基づく研究に関与する主な課題は、標的細胞へのRNAiの薬剤の送達である。このようなバルクエレクトロポレーションおよび化学的トランスフェクション法のような従来の非ウイルス送達技術は、多くの場合、配達上必要な空間的制御を欠いており^、9月12日貧弱トランスフェクション効率を与える。このようなカチオン性脂質、カチオン性ポリマーとナノ粒子のような化学的トランスフェクション法の最近の進歩は非常に強化されたトランスフェクション効率が¹³をもたらしました。しかしながら、これらの技術は、まだ非常に小型化されたハイスループット技術、単一細胞研究と細胞間相互作用の調査を受けることができます配信を正確に空間的制御を提供するために失敗する。

ntは"遺伝子送達で>最近の技術の進歩は。接着細胞のハイスループットトランスフェクションの^{14から23、}マイクロエレクトロポレーションを使用しているかの過半数を有効にしたマイクロスケールエレクトロポレーション（最大単セルまで）配達を正確に時空間制御を提供しており、示されている^{24から26まで}の高効率^19を達成する。さらに、エレクトロポレーションベースのアプローチは、化学ベースのトランスフェクションの方法で必要に応じて、siRNAやDNA複合体とのインキュベーションの長時間（通常4時間）を必要とし、裸の​​siRNAやDNAの直接エントリにつながらない細胞質への分子。結果遺伝子の発現としては、トランスフェクション²⁷後6時間、早ければ達成することができます。私たちのラボは、以前に付着哺乳動物細胞培養^17-19にサイト固有のトランスフェクションのための微小電極アレイの使用（MEA）を実証してきました。 MEAベースのアプローチでは、遺伝的ペイロードの配信は、ローカライズされたマイクロスケールelectroporatiを介して実現されるセルの上に。選択された電極への電気パルスの印加は、刺激電極の領域に存在する細胞のエレクトロポレーションにつながる局所的な電界を発生させる。微小電極を独立して制御するには、トランスフェクションオーバー空間的、時間的な制御を提供し、また、同一の培養実験のスループットを向上させ、文化·ツー·文化の変動を減少させる上で実行される複数のトランスフェクションベースの実験を可能にします。

ここでは、実験装置やエレクトロポレーションを用いて蛍光標識スクランブル配列のsiRNAを用いて接着したHeLa細胞の標的とトランスフェクションのためのプロトコルを記述します。同じプロトコルはまた、プラスミドベクターのトランスフェクションのために使用することができます。また、ここで説明されたプロトコルは、簡単にマイナーな修正と哺乳動物細胞株の多様性に拡張することができます。事前定義されたおよびカスタムの両方の電極パターンとMEAの商業的利用は、この手法アクセシブルトンを作る基本的な細胞培養用器材のoほとんどの研究室。

Protocol

1。 MEAの準備

1. 以前は¹⁸またはそのようなマルチチャンネルシステムとして、MEAメーカーのベンダーから直接購入し説明されているようにエレクトロポレーション実験で使用するためのMEAは、標準のフォトリソグラフィ技術を用いて製造することができる（http:/www.multichannelsystems.com/）とAlpha MED科学株式会社（ http://www.MED64.com） 。実験に用いたMEAは固体エレクトロニクス研究所（CSSER）のためのセンターによって運営されてアリゾナ州立大学のクリーンルーム施設で社内で作製した。実験に用いたMEAはよく1センチメートル内径50〜200μmのガラスの中から電極径サイズが4の配列で8で32インジウムスズ酸化物電極を持っていた。ガラスはよくポリジメチルシロキサン（PDMS）を使用して、MEAに接着した。
2. セルの前にオートクレーブでMEAを殺菌するeeding。彼らはMEAの完全性を損​​なわない限り、このような70％エタノールに浸漬するように殺菌するための他の方法、別の場所で説明されているようにUV処理及び熱水処理を使用することもできます。
3. 層流フードにオートクレーブしたMEAを転送し、標準ポリスチレン滅菌シャーレに入れてください。 MEAに細胞を播種する前に、20分間紫外線をオンにすることにより、層流フードを殺菌。場合MEAは流フードはUV照射下にある間、無菌アルミ箔を使用したMEAを含むペトリ皿をカバーするUV光に敏感です。

2。 MEAの播種細胞

1. トリプシン/ EDTAおよびメッキ用1mlの細胞培地中で100から200細胞/μlの濃度になるようにそれらを上げるを使用して付着した哺乳動物細胞の稼働細胞株から細胞を回収する。私たちの実験では、培養したNIH3T3線維芽細胞株HeLa細胞株及びMEA上の一次皮質と海馬ニューロンに成功しています。
2. 細胞が層流フードへのインキュベーターからMEAとペトリ皿を移し、優しくよくMEAにあらかじめ温めメディアのμlを400から500まで（37℃）を追加播種後2時間。細胞がまだ取り付けられており、均等にMEA表面に広がっていることを保証するために、顕微鏡下で確認してください。インキュベーターにMEAの背中を転送します。メディアの添加前に2時間の待機期間は、細胞がMEA表面に付着するのに十分な時間を確保します。早すぎると細胞を播種後、細胞培地の添加は、細胞を洗い流すことができます。細胞は、MEAによく接着しない場合は、その表面には、細胞接着性を改善するために細胞接着因子などaspolylysine、フィブロネクチン、およびラミニンで治療することができます。私たちのHeLa細胞実験では、一般的にfibronectiとMEAの表面を処理1〜2時間のためのn（10μg/ ml）を。
3. 細胞を播種した後、8月12日時間は、任意の死んだ細胞を除去し、PBSで1から2回の洗浄を行います。必要に応じて細胞培地ごとに24〜48時間を交換することができます。典型的な実験では、細胞は、通常、播種後24〜48時間トランスフェクションのための準備が整いました。エレクトロポレーション効率の一貫性を維持するためには、文化はエレクトロポレーション前に、少なくとも80％コンフルエントになるまで待つことをお勧めします。

3。 siRNAの部位特異的なトランスフェクション

1. 核酸溶液を調製します。 siRNAトランスフェクションは、200から400μlの最終容量を達成するために氷冷エレクトロポレーション緩衝液で1〜2μMのsiRNAのエレクトロポレーション溶液を調製します。このビデオの記事では、siRNAのアレクサ488共役スクランブル配列でHeLa細胞のトランスフェクションを実証している。
2. インキュベータから無菌層流フードへの細胞とMEAを転送します。 MEAから細胞培地を取り除き、PBSで洗浄を行います。その後、私の200から400μlを加えるウェルへのCE冷たい1μMのsiRNAのエレクトロポレーション·ソリューションを提供します。
3. ターゲット電極（電気パルスの最適なパラメータを決定するための手順4を参照してください）​​に陽極平方電気パルスを印加して下さい。私たちの実験では、MEAのボンドパッドと接触するように電気パルスとデュアル·インライン·パッケージ（DIP）16ピンクリップを生成するために実用的な楽器2414A波形発生器を使用していました。波形発生器は、個々の電極の選択性を提供するために、デマルチプレクサ、プリント回路基板を介して、DIPクリップに接続することができます。参照電極、セルメディアに鋼陰極を配置します。メディアの鉄鋼参照電極を削減しながら、それはそれはMEA表面に接触しないことを保証するために非常に重要です。接触すると、それは、細胞及びMEAへの損傷を引き起こす可能性があります。それは細胞上記1ミリメートルの位置に基準電極を下げることをお勧めします。 1ミリメートルの高さのスペーサーは、refの配置を支援するために十分に配置することができますレンス電極。外部参照電極を使用する別の方法は、カソード·アノードのペアとして隣接する電極を使用することです。
4. 直ちに、MEAを対象電極に電気パルスを印加した後、インキュベーターにMEAの背中を転送します。 5分の潜伏期間の後、静かにあらかじめ温めておいた（37℃）細胞培地でエレクトロポレーション緩衝液の75％を交換してください。その後、蛍光イメージングは​​、細胞に蛍光標識されたsiRNAの配信を確認するために行うことができます。

4。エレクトロポレーションパラメータの最適化

1. パルス振幅、パルス持続時間、パルス数の値の範囲については、エレクトロポレーション、デザインのエレクトロポレーション実験のために最適な電気パルスパラメータを決定する。 HeLa細胞を持つ私たちの経験では、我々は観察さマイルで成功したエレクトロポレーションにつながっ100μmの電極サイズの単一電圧3 V〜9 Vから振幅のパルス、ミリ秒、1〜10ミリまでの期間nimal細胞死。これは、1つのパラメータを同時に変化させることなどが一定に保たれていることを私たちの推薦である。パルス·パラメータのそれぞれについて、エレクトロポレーション効率を定量化するために、我々はステップ4.2から4.5に記載されてヨウ化プロピジウム（PI）は、細胞透過性色素その汚れ核酸材料、およびライブアッセイベースの手法を使用しています。
2. ステップ1とステップ2で概説指示に従って、MEAで細胞培養を確立します。
3. 事前のエレクトロポレーションは、氷冷エレクトロポレーション緩衝液中で30μg/ mlのPI溶液の300から500μlとcalcienがPBSで溶液AM4μMの400μlを調製した。
4. インキュベーターから層流フードへのMEAを転送します。 MEAから細胞培地を取り除き、PBSで洗浄を行います。その後、PIの氷冷エレクトロポレーション緩衝液の300から500μlを添加する。
5. 標的電極（電気を生成して適用するための我々の実験で使用する機器に必要なパルス振幅と持続時間との電気パルスを印加MEAにTRICパルスは、ステップ3.3）で説明されています。参照電極のどちらかだけでなく、MEAにおけるエレクトロポレーションバッファーに鋼電極を低くしたり、参考資料として隣接する電極を使用しています。選択的に異なる電極で変化する振幅または持続時間のパルスを印加することにより、複数の実験は、同じデバイス上で実行することができます。たとえば、32極、MEAに、8実験は8基、4電極から成るそれぞれに分割することにより、電極32を実行することができます。 8基の各々は、コントロールとして使用することができます0.5 Vの刻みと1グループに3 V型6 Vの範囲で変化する振幅の持続時間5ミリ秒の単一矩形電圧パルスで刺激することができる。
6. すぐに適用した後に電圧パルスを5分間インキュベーターにMEAを転送します。その後、静かによくMEAからエレクトロポレーション緩衝液の75％を除去し、温かい細胞培地に交換してください。インキュベーターにMEAの背中を転送します。
7. 2〜4時間の潜伏期間の後カルセインPBS中のソリューション午前4μMの300から500μlでよくMEAに細胞培地を交換してください。さらに30分間インキュベーターにMEAの背中を転送します。
8. カルセインAMでの細胞のインキュベーション後、PBSで2回洗浄した後、PBSでよくMEAにソリューションをカルセインAMを交換してください。とカルセインAM（励起/発光 - 490 nm/520 nm）の - PI（535 nm/617 nmの励起/発光）用フィルター付き光学顕微鏡で用いた細胞の蛍光画像を取得します。エレクトロポレーションのために、PIの取り込みは、細胞が赤色蛍光を発するとカルセインAMが緑色蛍光を発するために生きている細胞を引き起こす原因となる。観察することができる3つの可能なシナリオは、1）、エレクトロポレーション、生き細胞（赤と緑の両方を発するでしょう）、2）細胞が生きているが、エレクトロポレーション（ちょうど緑色蛍光を発する）と3ではありません）細胞は死んによるエレクトロポレーション（ちょうど赤い蛍光を発するでしょう。） 。細胞生存率は電極上に生きている細胞の総数のパーセント、エレクトロポレーションEFFのように計算したiciencyはPI / siRNAでロードされたセルの総数のパーセントとして計算した。

5。代表的な結果

図1は、PIのHeLa細胞の部位特異的な荷重を示します。これは、電極上の細胞のみがPI（ 図1B）の取り込みを示すことを観察することができます。ライブアッセイを行っポストエレクトロポレーションは、細胞（ 図1A）の実行可能性を評価するために使用された。 図1に示すように、例えばエレクトロポレーション効率と細胞生存率は、それぞれ81.8パーセントと96.1パーセントです。高い細胞生存率とエレクトロポレーション効率はエレクトロポレーションパルス·パラメータを最適化することによって達成することができます。最適化されたエレクトロポレーションパルス（8 V、1ミリ秒）のための蛍光標識siRNAを用いてHeLa細胞の部位特異的なトランスフェクションは、 図2に示されている。 8 VでsiRNAのエレクトロポレーションの効率は、1ミリ秒は74.4であることが判明した±16.0％、細胞生存率は87.9±8.4％（すべてのデータは平均値±標準偏差、N = 5のように表されている）であることが判明した。

図 200μmの電極（6 V、5ミリ秒）でHeLa細胞におけるPIの1部位特異的送達。 A）はCalcienベースのライブアッセイは2時間後にエレクトロポレーションを行った。生きている細胞が緑色蛍光で示されます。 B）は赤の蛍光は、電極上の細胞によるPIの取り込みを示しています。 C）は、AとBの重畳画像の白い矢印は、エレクトロポレーションと生きている細胞を示す。黒い矢印は死んでいる細胞を示す。 A、BおよびCの白丸は電極の概略を示します。

図2蛍光標識scrambl HeLa細胞のトランスフェクションsiRNAのE配列。 A）が100μmの電極上のHeLa細胞のイメージは、Alexa 488タグ付けたsiRNA（8 V、1ミリ秒）でトランスフェクションした。 B）は、細胞核のイメージは、DAPIで染色した。白丸は電極のエッジをマークします。

Discussion

このビデオの記事では、siRNAのスクランブル配列とHeLa細胞の部位特異的なトランスフェクションのためのMEAの使用例を示します。この技術の利点の一つは、主要な細胞株を含む種々の細胞株への適用である。私たちの研究室では以前にE18の日齢のラットおよびスクランブルsiRNA配列とGFPプラスミド^18,19とNIH-3T3細胞から主海馬ニューロン培養の部位特異的なトランスフェクションのために、この技術の使用を実証しています。我々はまた、HeLa細胞における内因性標的（未発表データ）に対して機能的なsiRNAを提供する上での成功を収めている。典型的な市販のMEAは、蛍光免疫染色の技法を用いて、遺伝子サイレンシングの機能的影響の定量的評価を可能にする、光学イメージング（正立顕微鏡）と互換性があります。さらに、MEAにおいて微小電極は、遺伝的摂動に応答して、このような一次神経細胞などの細胞の電気的活動を監視するために使用することができます。ザMEAのユニークな性質は、それによって実験的なスループットを向上させ、単一の細胞培養での同時複数の実験を可能にします。現在、MEAベースのシステムとの主な制限は、高い従来の化学的トランスフェクションベースのアプローチに比べてトランスフェクション（1μMsiRNAの400μlの）ために必要なsiRNAの大量であるため、システムの費用対効果を制限します。これは、部分的に数マイクロリットル未満にsiRNAのエレクトロポレーション溶液の総量を減少させるために、MEAベースのシステムでmircofluidicsを組み込むことによって克服することができる。さらに、マイクロフルイディクスは、異なるsiRNA分子のシリアル配信をイネーブルにすることはできますが大幅MEAベースの技術のスループットを向上させる。あるいは、siRNA分子は、細胞播種の前に微小電極上にスポットすることができますし、siRNA分子は逆エレクトロ^15,23によって細胞にトランスフェクトすることができる。この技術の今後の発展には、新規な高-tを提供していますhroughput、遺伝子操作研究のための効率的かつ低コストの方法。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell media: Advanced MEM L-Glutamine 200 mM Penicillin/Streptomycin Fetal bovine serum	Gibco/Invitrogen Himedia Laboratories/VWR Lonza group Ltd. Gibco/Invitrogen	12492-013 95057-448 09-757F 16000-044	Cell media composition: 2% FBS, 2%L-glutamine and 2% Pennstrep in Advance MEM
Trypsin EDTA	Mediatech, Inc.	25-053-CL
PBS	Mediatech, Inc.	21-040-CV
Alexa 488 and rhodamine tagged scrambled sequence siRNA	Qiagen, Inc.	1027292
Electroporation buffer	Biorad Laboratories	165-2677
Waveform generator	Pragmatic	2414A	Any waveform/pulse generator that can deliver the desired pulses can be used.