Summary
Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello: l'iniezione di una sospensione di cellule tumorali nella parete del cieco o il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Questo modello è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.
Abstract
Il tradizionale modello di tumore sottocutaneo è proprio l'ideale per lo studio del cancro del colon-retto. Ortotopico modelli murini di cancro del colon-retto, che presentano le cellule tumorali in crescita nella loro posizione naturale, replicare malattia umana con l'alta fedeltà. Due tecniche possono essere usate per stabilire questo modello. Entrambe le tecniche sono simili e richiedono l'anestesia del mouse e laparotomia per l'esposizione del cieco. Una tecnica prevede l'iniezione di una sospensione di cellule di cancro del colon-retto nella parete del cieco. Le cellule cancerose vengono prima crescere in coltura, raccolto quando subconfluent e pronta come una sospensione di cellule singole. Una piccola quantità di cellule viene iniettato lentamente per evitare perdite. L'altra tecnica prevede il trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo sul cieco. Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia e il tumore è stato rimosso con tecnica sterile. Il pezzo tumore è diviso in piccoli pezzi per il trapianto di un altro mouse. Prima del trapianto, la parete del cieco è leggermente danneggiato per facilitare l'infiltrazione delle cellule tumorali. Il tempo per lo sviluppo di tumori primari e delle metastasi epatiche varia a seconda della tecnica, linea cellulare, e le specie utilizzate il mouse. Questo modello murino ortotopico è utile per studiare la naturale progressione del tumore del colon-retto e test nuovi agenti terapeutici contro il cancro del colon-retto.
Protocol
I. Preparazione cellulare
- Le cellule tumorali del colon-retto sono cresciuti in coltura e raccolta quando subconfluent.
- Una sospensione singola cella viene preparato in tampone fosfato e tenuta in ghiaccio.
II. Preparazione del tumore
- Un mouse con un precostituito tumore del colon-retto per via sottocutanea è eutanasia.
- Il tumore sottocutaneo viene rimosso utilizzando una tecnica sterile e diviso in 2-3 pezzi millimetri
- I pezzi del tumore sono tenuti in tampone fosfato salino sul ghiaccio.
III. Preparazione del mouse
Nota: Nel nostro laboratorio usiamo per via inalatoria isoflurano per anestetizzare il mouse, in alternativa, si può usare anestetici iniettabili per ottenere lo stesso effetto
- La profondità di anestesia viene valutata usando un pizzico piedi. Non ci dovrebbero essere ritirarsi reflex con un pizzico punta.
- Gli antibiotici può essere somministrato a questo punto.
- Il mouse anestetizzato, che in precedenza era rasata, sia posizionata correttamente.
- L'addome viene preparato con una soluzione di Betadine.
- Dell'addome e del sito chirurgico sono drappeggiati in modo sterile.
IV. Laparotomia
- Un piccolo nick è realizzata in pelle
- La muscolatura della parete addominale è colto ed elevato
- La cavità addominale è entrato e una singola lama delle forbici è usato per spingere l'intra-addominale contenuti via
- L'incisione è estesa a 2-3 cm
L'esposizione V. del cieco
- Il cieco con il suo sacchetto finale cieco è identificato e esteriorizzato
- Il cieco è isolato dal resto del mouse utilizzando un pre-taglio, garza sterile
- Salina calda viene utilizzata per mantenere umido il cieco
VI. L'iniezione di cellule nella parete del cieco
- A 27 G o un ago sottile viene usato per iniettare un volume di 50 ml di cellule nella parete del cieco
- L'ago viene rimosso
- Il sito di iniezione è controllato per garantire l'assenza di perdite
- Il cieco è tornato alla cavità addominale
VII. Il trapianto di Tumore sulla Cieco
Nota: oltre a iniettare le cellule nel muro del cieco, un approccio alternativo consiste nel trapianto di tumore sul cieco
- Una figura di 8 punti è posizionato sul cieco utilizzando 6-0 o 7-0 sutura dimensioni
- La parete del cieco è leggermente danneggiato
- Poi, il pezzo tumorale è posizionata
- Il punto è legato
- Il cieco è tornato alla cavità addominale
VIII. Chiusura del mouse parete addominale e di recupero
- La parete addominale del mouse è chiuso con tre punti di sutura interrotta utilizzando 3-0 o 4-0 sutura dimensioni
- In alternativa, si può usare un punto semplice esecuzione
- Post-operatorio analgesici e un bolo fluido può essere data a questo punto
- Il mouse è permesso di recuperare l'anestesia.
Nota: con anestetici inalatori questo richiede in genere 30 secondi
IX. Risultati - tumore primitivo e metastasi epatiche
Tumore primario - mostrato in situ (A) e con evidenza di neovascolarizzazione (B); alla colorazione H & E, i tumori localmente invasivi (C)
Metastasi al fegato - mostrato ex vivo (D)
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Discussion
Anche se il mouse modelli di tumore sottocutaneo sono facili da stabilire e controllare, è chiaro che questo modello non può replicare il sito originale anatomica del tumore colorettale. A causa della differenza di microambiente, le cellule del cancro colorettale in crescita sotto la pelle hanno dimostrato di cambiare il loro fenotipo e quasi sempre non riescono a progredire e metastasi 1,2. In realtà, la risposta del tumore alla terapia può variare notevolmente a seconda che le cellule tumorali sono impiantate in un ectopica (sottocutaneo) rispetto posizione ortotopica 3. Ortotopico modelli murini di cancro del colon-retto, che presentano le cellule tumorali in crescita nella loro posizione naturale, replicare malattia umana con l'alta fedeltà. Le due tecniche per stabilire questo modello ha vantaggi e svantaggi. L'iniezione di una sospensione di cellule nella parete del cieco presenta cellule tumorali del colon-retto, che sono stati precedentemente crescere in un ambiente in vitro e sono probabilmente omogeneo. Cellule possono aver ridotto potenziale invasivo e metastatico, dopo diversi passaggi in coltura. Trapianto di un pezzo di tumore sottocutaneo introduce una popolazione più eterogenea di cellule tumorali che sono stati stabiliti in vivo. Tuttavia, i tumori contengono cellule stromali e spesso hanno parti necrotiche che possono incidere sulla consistenza di questo modello (comunicazione personale, I. Fidler, MD Anderson). Dal punto di vista tecnico, il nostro laboratorio ha trovato che l'iniezione di una sospensione di cellule nella parete del cieco è più difficile e comporta il rischio di iniezione intraluminale e perdite post-iniezione. È interessante notare che un modello di topo ortotopico di tumore del retto è stato descritto che non necessita di laparotomia del mouse 4. I topi vengono anestetizzati e la mucosa rettale è prolasso con pressione digitale. Una piccola quantità di cellule del cancro colorettale in sospensione singola cella viene iniettato submucosally. Primario, tumori invasivi rettale nei topi sviluppano già una settimana dopo l'iniezione, tuttavia, nessuno dei topi sviluppano metastasi al fegato e gli autori non ha commentato la frequenza di metasases polmone.
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Acknowledgments
Dipartimento di Chirurgia, Università di California, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
