Summary
이 문서는 중간 대뇌 동맥의 근위 부분을보기 위해 시간적 craniectomy를 사용하여 두개의 창문을 통해 쥐 대뇌 동맥을 시각화하는 방법을 설명합니다 (
Abstract
두개골 창 창조 1-3 뇌의 대뇌 피질의 표면에 구조를 직접 시각화 할 수있는 방법입니다. 이 기술은 쥐의 뇌를 놓인 여러 지역에서 수행 할 수 있지만, 대부분의 쉽게 쉽게 접근 정면 또는 정수리 뼈를 통해 craniectomy을 생성하여 수행됩니다. 대부분의 자주, 우리는 근위 MCA에 인접한 뇌 실질에 엔도 테린-1의 주입 발생할 중간 대뇌 동맥 혈관 직경의 변화를 정할 허혈성 뇌졸중의 엔도 테린-1 중간 대뇌 동맥 폐색 모델과 함께이 기술을 사용한 4, 5. 엔도 텔린 -1 유도 MCAO 동안 MCA의 가까운 부분을 시각화하기 위해, 우리는 쥐 두개골 (그림 1)의 측면 측면에서 관자놀이 뼈를 두개골 창을 만들 수있는 기술을 사용합니다. 뇌동맥은 경질 그대로 사용하거나 경질 칼에 베인과 retra있는 중 시각화 할 수 있습니다cted. 가장 일반적으로, 우리는 뇌 실질에 vasoconstricting 펩타이드의 전달을 포함 엔도 테린-1 유도 MCAO 이후 시각화 동안 경질 그대로 둡니다. 이 약물 투여에 대한 시각화 혈관을 통해 직접 경질를 절개 할 필요가 우회한다. 이 프로토콜은 물론이 방법에 관한 잠재적 인 함정의 많은 부분을 방지하는 방법으로, 단계 - 현명한 방식으로 뇌성 동맥을 시각화 할 수있는 두개의 창을 만드는 방법을 설명합니다.
Protocol
이 프로토콜은 플로리다 대학 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되고 준수는 "케어에 대한 가이드 및 실험실 동물의 사용"(여덟째 판, 과학 국립 아카데미, 2011)되었다.
자료
- 동물 : 수술시 250~300그램 무게 여덟 주 된, 남성, Sprague Dawley 쥐 (찰스 강 (Charles River)의 농장, 윌 밍턴, 미국 MA,).
- 마취
- 흡입 마취 시스템 (VetEquip 주식회사, Pleasanton, CA, USA)
- Isoflurane 마취 (박스터의 조제, 디어 필드, IL, USA)
- Stereotaxic 시스템 (데이비드 Kopf 기기, Tujunga, CA, USA)
- 작은 동물 stereotaxic 시스템
- 쥐에 대한 비 파열 귀 바
- 쥐에 대한 가스 마취 헤드 홀더
- 온도 조절
- BAT-12 microprobe 온도계 (세계정밀 기기 주식회사, 사라 소타, FL, USA)
- T / PUMP, TP600 열 담요 (Gaymar 산업 주식회사, 오차드 파크, NY, USA)
- 수술기구
- Metzenbaum 가위, 아이리스 포셉, 겸자의 견인기, 26 게이지 beveled 바늘, Bovie 소작 키트 (세계 정밀 계측기, 주식회사, 사라 소타, FL, USA)을 갖춘 10 μl 주사기
- Micromotor 드릴 (Stoelting, 우드 데일, IL, USA)
- 0.8 mm 원형 드릴 버 (Roboz 외과 인스트루먼트 (주), 주식회사, 게이스 버그, MD, USA)
- STORZ 본 Suturing 집게 (Bausch Lomb과 주식회사, 로체스터, NY, USA)
- 외과 용품
- 3.0 나일론 봉합 (오아시스 (Oasis), Mettawa, IL, USA)
- 면봉, Puralube 눈 연고 (피셔 과학, 피츠버그, PA, USA)
- 외과 포인트와 스트립 (Medtronic Xomed 주식회사, 잭슨빌, FL, USA)
- 전기 헤어 가위 (Oster, 섭리, RI, USA)
- 엔도 테린-1 (미국 펩타이드, 서니 베일, CA, USA)
- Chlorhexidine 2% (Agrilabs, 세인트 조셉, MO, USA)
- 시각화 장비
- 수술 현미경 (Seiler 악기 및 제조, 세인트 루이스, MO, USA)
- 소니 Handycam HDR-SR12 (소니, 미나토, 도쿄, 일본)
- 광섬유 조명기 (TechniQuip 공사, 리버모어, CA, USA)
- 선박 직경의 측정
- VLC 미디어 플레이어 (파리, 프랑스)
- 이미지 J 소프트웨어 (ImageJ 1.42q 소프트웨어, 건강의 미국 국립 연구소, 베데스다, MA, USA)
1. 사전 수술 단계
- 수술에 앞서, 쥐가 물과 쥐 수유에 무료로 액세스 할 수있는 12시 12분 어두운 / 밝은주기에 따라 자리 잡고 있습니다.
- 마취는 유도 챔버 100 % O 2 기체 혼합물에서 isoflurane 4%을 유도하고 있습니다.
- 까마귀 머리 N은 전기 헤어 가위로 면도 있습니다.
- 쥐가 온도 조절 운영면 (열 담요)과 머리는 가스 마취 얼굴 마스크의 위치로 시작 stereotactic 장치에 배치됩니다에 누워 흡수 패드에 발생하기 쉬운 위치에 배치됩니다.
- 다음으로 귀 바는 삽입 강화하고 있습니다.
- 절차 마취 동안 백퍼센트 O 2 기체 혼합물에서 isoflurane 2퍼센트로 유지됩니다.
- Opthalmic 윤활유 연고는 양쪽 눈에 적용되며, 눈꺼풀이 수술하는 동안 눈 건조를 방지하기 위해 폐쇄됩니다.
- 직장 온도 프로브는 ± 0.5은 ° C. 37 일정한 동물 코어 온도를 유지하기 위해 삽입
- stereotaxic 장치에 단단히 개최 anesthetized 쥐의 머리와 외과 영역은 chlorhexidine과 염분을 세 번 교대로 세안합니다.
2. 사전 두개골 창 준비
ontent "> 전에 두개골 창을 만들려면, 쥐은 다른 필요한 하드웨어 주입하여 실험을 준비해야하고 필요한 수술 절차를 받아야합니다.이 프로토콜의 경우, 우리는 이전에 엔도 테린-1 (동부 표준시 -에 대한 가이드 캐뉼라를 이식 한 1) 유도 MCAO는 제목 동반자 간행물에 표시되는 "쥐의 레이저 도플러 Flowmetry 안내와 허혈성 뇌졸중에 대한 엔도 테린-1 유도 중간 뇌 동맥 폐색 모델."3. 두개골 창 창조
가이드 캐뉼라 또는 실험에 필요한 장비의 배치 후, 두개골 창이 직접 행정 절차를 수행하는 동안 중간 대뇌 동맥의 근위 부분을 시각화 생성됩니다.
- 첫째, 가위는 medially 시작하여 측면 작업 temporalis 근육 위에 놓인 피부를 절개하는 데 사용됩니다.
- temporalis 근육이 electrocautery를 사용하여 bisected하고 visua 3.0 나일론 봉합사를 사용하여 철회 관자놀이 뼈의 편평 부분을 lize.
- 이 관자놀이 뼈 오프 반영으로 약 3~4mm 광장은 궤도에 꼬리와 광대뼈 프로세스의베이스에 뛰어난 관자놀이 뼈의 편평 부분에 그려집니다.
- 훈련은 점차적으로 관자놀이 뼈에서 무료로 뼈의 설명 부분을 잘라하는 데 사용됩니다. 주의가 경질 또는 대뇌 피질에 손상을 할수 있기 때문에 훈련에 너무 많은 압력을 적용하지 않도록주의해야한다.
- 멸균 식염수에 자주 린스는 수술 분야의 시각화를 개선하고 두개골의 과열 방지하기 위해 수행됩니다.
- 느슨한 구석에서 시작하여, temoporal 뼈 조각은주의 깊게 경질과 관련된 혈관을 찢어하지 않도록하는 동시에 미세 쥐 - 톱니 집게를 사용하여 제거됩니다.
- 경질은 그대로 남아 있으며, 잔해가 멸균 생리를 사용하여 거리에 헹구어 있습니다.
4. 뇌 동맥 수축의 기록
실시간, 동부 표준시-1 유도 MCAO를 진행 쥐에서 이미지를 캡처하는 방법을 보여줍니다하려면 십t ">이 프로토콜에 사용됩니다.- vasoactive 화합물의 응용 프로그램에 이전 기준 동영상은 최소한 1 분에 기록해야합니다. 바늘이 전에 동부 표준시-1 주입에 뇌 실질로 낮아 있지만 된 후에 동부 표준시-1 유도 MCAO를 들어, 기본 녹음이 이루어집니다.
- 주사기 펌프는 주입을위한 시작 1 시간 또는 원하는 종점까지 기록됩니다. 바늘은 초점 비행기의 교란을 방지하기 위해 비디오 녹화 중에 장소에 남아 있습니다.
- 쥐가이 절차에 따라 승인 된 프로토콜에 따라 깊이 anesthetized 및 euthanized해야합니다.
5. 이미지 분석
선박 직경은 시각화 MCA의 어떤 부분에 대해 결정 할 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 동부 표준시-1 주입 전후의 시간이 지점에서 선박 직경을 측정 할 수있는 MCA 중 하나 지점을 사용합니다. STI동영상에서 붙인다 프레임은 VLC 미디어 플레이어 (VideoLAN)를 사용하여 1 분 간격으로 캡처됩니다.
- VLC 플레이어가 설치되어 열립니다.
- 도구 및 다음 환경 설정을 선택하면 설정이 아래 "전체"로 변경되어 "표시 설정."
- "비디오 메뉴는"왼쪽 사이드 바에서 확장 및 "출력 모듈은"그때 확장됩니다. "장면 필터는"사고 현장 비디오 필터 메뉴를 표시하려면 선택됩니다.
- "장면"는 파일 이름 접두사에 대한 상자에 입력합니다.
- 디렉토리 경로 접두어가 정의됩니다. 여전히 프레임이 저장된 곳입니다.
- 녹화 비율은 여전히 프레임 캡쳐의 원하는 속도에 따라 선택됩니다. 동영상은 초 당 29 프레임, 다음 "1749"(29 프레임 / 초 X 60 초 / 분)에서 캡쳐 된 경우 하나는 여전히 매일 1 분 프레임 저장 상자에 입력해야합니다. 모든 변경 사항은 다음 저장됩니다.
- 원하는 동영상을 자동으로 매일 1 분에 한 번 계속 프레임을 저장하는 VLC 플레이어에서 열립니다.
- 선박 직경은 다음이를 사용하여 측정된다이미지. 첫째, ImageJ 소프트웨어 (NIH)이 열립니다.
- 그럼 당신은 측정 될 수있는 여전히 프레임은 ImageJ에서 열립니다.
- "분석"메뉴를 선택하면, "측정 설정"를 선택한 후 개설되어 있으며 모든 상자의 선택을 취소합니다.
- 다음, 직선 도구가 선택됩니다.
- 키보드 단축키는 "Ctrl 키를 +는"필요에 따라 확대하는 데 사용되며 라인은 혈관 직경을 측정 할 수있는 선박 경로에 수직 배치됩니다.
- 마지막으로, 선박의 길이는 선박의 길이를 얻기 위해 '측정'(CTRL + M) 후 "분석"메뉴를 선택하고이 얻어진다.
- 이 과정은 적어도 세 번 반복하고 각 여전히 프레임 단위로 측정 각 측정 용기에 대한 평균입니다.
- 비교 여러 쥐를 사용하여 만들 수 있도록 각 시점에서 선박 지름이 기준 혈관 직경에 표준화되어 있습니다. 이 작업을 수행하려면 각 선박의 %의 기본 직경을 계산 × 100 %가 공식 현재 직경 / 기본 직경을 사용합니다.
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Representative Results
아직 캡처 된 비디오 쇼에서 찍힌 사진 그 후 뇌동맥 직경의 변화 동부 표준시-1 주입은 즉시이 두개의 창 기술을 (그림 2)를 사용하여 평가 할 수 있습니다. 동부 표준시-1 분사의 분 이내에 혈관이 수축되기 시작합니다. 결국 혈관 시각화하기 어려울되며 뇌 조직은 창백 될 것입니다. 20 분 후 동부 표준시-1의 효과가 감소하고 혈관은 점차 약 45 분 후 기본 직경로 돌아, 팽창되기 시작합니다. 발생보다 더 확실한 혈관 수축뿐만 아니라, 대뇌 피질의 표면은 동부 표준시-1 관리 후 창백됩니다. 그것은 원하는 경우 보정 현미경 십자선과 혈관의 직경은 절대 변화를 계산 할 수 있습니다. 여러 쥐 사이의 비교를 위해 우리는 절차를 수행하는 동안 발생하는 혈관 직경의 상대적인 변화를 계산합니다. 이러한 측정은 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 수행됩니다. 그런 다음 REL을 나타내는 그래프시간이 지남에 따라 선박의 직경 ative 변경 사항은 다음 (그림 3) 구성 할 수 있습니다.
1 그림. 시간적 craniectomy의 위치 다이어그램.이 그림은 왼쪽 앞 방향으로 쥐 두개골의 골격 해부학를 도시한다. temporalis 근육의 측면 두개골 능선을 따라 기원이 있습니다. 이 근육은 관자놀이 뼈의 편평 부분을 시각화하기 위해이 봉우리에서 분리하고 bisected해야합니다. 이 관자놀이 뼈 오프 반영으로 약 3~4mm의 craniectomy 막 궤도에 뒤쪽과 광대뼈 과정의 기본에 뛰어난이 위치에서 수행 할 수 있습니다. 큰 화살표는 craniectomy을 수행 할 수있는 위치를 지적했다. 3 작은 화살표는 MCA와 지점을 나타냅니다. 모든 동맥이 위치에 MCA과 동맥의 가지가 자신이 아닌 고통스러운 모양과 vasoactive 화합물에 대한 감도가 모두 정맥 구별 할 수 있습니다.
그림 2. 동부 표준시-1 주입 전, 동부 표준시-1 주입 후, 그리고 reperfusion 후 두개골의 창. 왼쪽에 시작은 두개골 창을 통해 볼로 MCA 지점의 대표 이미지가 표시됩니다. 동맥은 자신의 형태로 식별 할 수 있습니다. 비교적 직선 MCA는 왼쪽 하단에있는 필드를 입력하고 이미지의 한 가지 주요 분기점이 있습니다. 이 사진의 다른 선박들은 깊은 음색 고통스러운 외관으로 식별 할 수 뇌성 정맥 있습니다. 가림 동맥 동안 빠르게 수축하고 조직 창백 될 것입니다. 천천히, 동맥 팽창과 기본 직경으로 돌아갑니다.
그림 3. 하나의 쥐. 비율 기준 직경에 대한 일정 기간 동안의 대표 혈관 직경은 간단한 공식으로, 현재 직경 / 기본 직경 × 100 %를 사용 시간이 지남에 따라 계산 될 수있다. 이것은 어떤 vasoactive 화합물을 수행 할 수 있습니다.
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Discussion
이 사소한 수정 4, 5 많은 실험의 요구를 충족하기 위해 변경 될 수 있으므로 요약에서이 두개의 창을 준비 기술은 매우 다양한입니다. 예를 들어, 우리는 성공적으로 두개의 창 (메카 AP 2009 2011)을 통해 시각화 뇌동맥에 직접 초점을 레이저 도플러 flowmetry를 사용하여 특정 MCA 지점에서 뇌성 혈액의 흐름을 모니터링하고 있습니다. 또한, 경질 칼에 베인과 유사한 준비는 생체 혈관 반응성 욕조 3을 만들 vasoactive 화합물의 국소 투여와 함께 사용할 수 있습니다. 이 기법의 실패 속도를 감소하기 위해 두개의 창을 준비 할 때 여러 가지 요인이 고려되어야합니다. 이러한 요소 중 대부분은 뇌동맥의 좋은 시각화를 취득과 관련이 있습니다. 그 위에 놓인 경질이나 혈관이 드릴 비트와 함께 중단되지 않도록 craniectomy를 만들 때 먼저주의가되어야합니다. 이 것이 가장 바람직합니다멸균 식염수에 자주 세차에 의해 파편을 취소하고 두개골을 냉각합니다. 이 제거 될 때 둘째, 뼈 조각이 부드럽게 해제해야합니다. 조각을 쉽게 끌어낼하지 않는 경우, 드릴 비트 더 뼈를 떼어 사용해야합니다. 마지막으로, 혈액 또는 CSF의 작은 금액은 쉽게이 절차를 수행하는 동안 두개골 윈도우의 모양을 변경할 수 있습니다. 수행 craniectomy는 시각화에 필요한보다 큰 두개골에 구멍을 제공합니다. 따라서 축적의 유체를 방지하기 위해 수술 사이트의 종속 부분에 여러 흡수 스폰지를 배치 용이합니다. 이 스폰지는 치료가 수술 도구 창을 방해하지 사용하는 경우 필요에 따라 변경 될 수 있습니다.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 미국 심장 협회 상급 동남아 계열 (09GRNT2060421), 미국 의학 협회에서와 플로리다 임상 병진 과학 연구소의 대학에서 보조금에 의해 지원되었다. 아담 메카는 NIH / NINDS, NRSA predoctoral 동료 (F30 NS-060335)입니다. 로버트 Regenhardt은 고혈압의 플로리다 종합 교육 프로그램의 대학 (T32 HL-083810)에서 predoctoral 교제 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation anesthesia system | VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA | 901806 | |
| Isoflurane anesthetic | Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA | 1001936060 | |
| Small animal stereotaxic system | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 900 | |
| Non-rupture ear bars, rat | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 957 | |
| Rat gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 1929 | |
| BAT-12 microprobe thermometer | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | BAT-12 | |
| T/PUMP, Thermal blanket | Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA | T/PUMP, TP600 | |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 501254 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 15915 | |
| Bulldog clamp retractors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 14119-G | |
| 10 μl syringe 26-gaugue | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | SGE010RNS | |
| Bovie, high temperature cautery kit | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 500392 | |
| Rat tooth forceps 0.12 | Stotz | E1811 | |
| Micromotor drill | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51449 | |
| 0.8 mm round drill bur | Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA | RS-6280C-1 | |
| STORZ Bonn suturing forceps | Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA | ||
| Nylon Suture, size 3.0 | Oasis, Mettawa, IL, USA | MV-663 | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 22-029-488 | |
| Puralube eye ointment | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | NC0138063 | |
| Electric hair clippers | Oster, Providence, RI, USA | 78005-301 | |
| ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS | American Peptide, Sunnyvale, CA, USA | 88-1-10A | |
| Chlorhexidine, 2% | Agrilabs, St. Joseph, MO, USA | 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322 | |
| Surgical microscope | Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA | Evolution xR6 | |
| Sony Handycam | Sony, Minato, Tokyo, Japan | HDR-SR12 | |
| Fiber optic illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–150 | |
| VLC media Player | (Paris, France) | ||
| Image J software | U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA |
References
- Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
- Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
- Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
- Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
- Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).
