Summary
Bu makalede, orta serebral arterin proksimal bölümlerini görüntülemek için temporal kraniektomi kullanılarak kranyal pencereden sıçan serebral arterlerin görüntülenmesi için bir yöntem açıklanır (
Abstract
Kranyal pencere oluşturulması 1-3 beyin kortikal yüzey üzerinde doğrudan görüntüleme yapılarının sağlayan bir yöntem. Bu teknik, sıçan beyin örten çok noktadan yapılabilir, ancak, en kolay şekilde kolayca ulaşılabilir ya da ön parietal kemik üzerinde bir kraniektomi oluşturarak gerçekleştirilir. En sık, biz proksimal MCA bitişik beyin parankimi içine endotelin-1 enjeksiyonu ile meydana orta serebral arter damar çapı değişiklikleri ölçmek için iskemik inme endotelin-1 orta serebral arter oklüzyon modeli ile birlikte bu tekniği kullanmış 4, 5. Endotelin -1 indüklenen MCAO sırasında MCA proksimalinden görselleştirmek için, biz sıçan kafatası (Şekil 1) lateralinde temporal kemik yoluyla kraniyal pencere oluşturmak için bir teknik kullanır. Serebral arterlerin dura bozulmamış veya dura kazıma ve RETRA ile ya görsellenebilircted. En sık, biz beyin parankimi içine vazokonstriktör peptid teslimini içerir endotelin-1 ile indüklenen MCAO yana görselleştirme sırasında dura olduğu gibi bırakabilirsiniz. Bu ilaç teslim görüntülenmiştir damarları üzerinde doğrudan dura kesilirken ihtiyaç atlar. Bu protokol de bu yöntem ile ilgili potansiyel tuzaklar birçok önlemek için ne gibi, adım adım moda serebral arterlerin görselleştirmek için bir kraniyal pencere oluşturmak nasıl anlatacağız.
Protocol
Bu protokol Florida Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu (IACUC) tarafından onaylanmış ve uygun olduğunu "Bakım Rehberi ve Laboratuvar Hayvanlarının Kullanımı" (sekizinci baskı, Ulusal Bilimler Akademisi, 2011) oldu.
Malzemeler
- Hayvanlar: Ameliyat sırasında 250-300 g Sekiz haftalık, erkek, Sprague Dawley sıçan (Charles River Çiftlikler, Wilmington, ABD MA).
- Anestezi
- İnhalasyon anestezi sistemi (VetEquip A.Ş., Pleasanton, CA, USA)
- Izofluran anestezi (Baxter İlaç sanayii, Deerfield, IL, ABD)
- Stereotaksik sistemi (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
- Küçük hayvan stereotaksik sistemi
- Sıçanlarda Non-rüptürü kulak çubukları
- Sıçanlar için gaz anestezi kafa tutucu
- Sıcaklık ayarı
- BAT-12 mikroprob termometre (DünyaHassas Instruments, Inc, Sarasota, FL, ABD)
- T / POMPA, TP600 Termal battaniye (Gaymar Industries, Inc, Orchard Park, NY, ABD)
- Cerrahi aletler
- Metzenbaum makas, iris forseps, bulldog klemp Retraktörler, 26 ayar eğimli iğne, Bovie koter kiti (Dünya Precision Instruments, Inc, Sarasota, FL, USA) 10 ul şırınga
- Mikromotor matkap (Stoelting, Wood Dale, IL, ABD)
- 0,8 mm yuvarlak matkap frez (Roboz Cerrahi Instrument Co, Inc, Gaithersburg, MD, USA)
- STORZ Bonn kardioraphie Forseps (Bausch ve Lomb, Inc, Rochester, NY, ABD)
- Cerrahi Malzemeleri
- 3,0 naylon sütür (Oasis, Mettawa, IL, ABD)
- Pamuklu çubuklar, Puralube göz merhemi (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
- Cerrahi noktaları ve şeritler (Medtronic Xomed, Inc, Jacksonville, FL, ABD)
- Elektrikli saç kesme makineleri (Oster, Providence, RI, ABD)
- Endotelin-1 (Amerikan Peptid, Sunnyvale, CA, USA)
- Klorheksidin% 2 (Agrilabs, Joseph, MO, ABD)
- Görselleştirme Ekipmanları
- Cerrahi mikroskop (Seiler Instrument ve Üretim; St Louis, MO, USA)
- Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokyo, Japonya)
- Fiber Optik aydınlatıcı (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
- Damar çapı ölçümü
- VLC media player (Paris, Fransa)
- Image J yazılımı (ImageJ 1.42q yazılım, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri, Bethesda, MA, ABD)
1. Ön cerrahi Adımlar
- Ameliyat öncesinde, sıçanlar su ve kemirgen chow ücretsiz erişim ile 00:12 aydınlık / karanlık döngüsü altında yer alır.
- Anestezi indüksiyon odasında% 100 O 2 gaz karışımı içinde izofluran% 4 ile indüklenir.
- Karga baş n elektrikli saç makasları ile traş edilir.
- Sıçan sıcaklık kontrollü bir çalışma yüzeyi (termal paket) ve baş gaz anestetik yüz maskesi yerleştirilmesi ile başlayarak stereotaksik alet yerleştirilir yatan emici bir ped üzerinde bir yüzüstü konur.
- Sonraki, kulak çubukları yerleştirilir ve sıkılır.
- Prosedür anestezi sırasında% 100 O 2 gaz karışımı içinde izofluran% 2 ile korunur.
- Oftalmoloji yağ merhemi hem gözlere uygulanır ve göz kapaklarının cerrahi prosedür sırasında göz kuruma önlemek için kapatılır.
- Rektal sıcaklık probu ± 0.5 ° C sıcaklıkta 37 sabit bir hayvansal çekirdek sıcaklığı korumak için eklenir
- Stereotaksik cihazı sıkıca tutulan anestezi sıçan baş ile cerrahi alan klorheksidin ve tuzlu üç kez dönüşümlü olarak temizlenir.
2. Ön kranial Pencere Hazırlama
ontent "> Önce bir kraniyal pencere oluşturmak için, sıçan diğer gerekli donanım implantasyonu herhangi deneyler için hazırlanmalı ve gerekli cerrahi almalıdır. Bu protokolü için, biz daha önce endotelin-1 (ET-için bir kılavuz kanül implante oylandı 1) indüklenen MCAO başlıklı bir arkadaşı yayında gösterilen "Rat Lazer Doppler Flowmetri Rehberlik ile İskemik İnme için Endotelin-1 Bağlı Orta Serebral Arter Tıkanıklığı Modeli."3. Kranial Pencere Oluşturma
Bir kılavuz kanül ve deneyler için gerekli olan ekipmanların yerleştirilmesinden sonra, bir kranyal pencere doğrudan bir vuruş prosedürü sırasında orta serebral arterin proksimal kısımları görselleştirmek için oluşturulur.
- İlk olarak, makas medial başlangıç ve yanal olarak çalışan temporal kas örten cilt kesilirken için kullanılır.
- Temporal kas elektrokoter kullanılarak örtülmüş ve sonra visua ila 3,0 naylon sütür kullanılarak geri çekilir temporal kemiğin skuamöz kısmı lize.
- Bu temporal kemik dışına yansıtır gibi bir yaklaşık 3-4 mm kare yörüngesine kaudal ve elmacık sürecinin temel üstün temporal kemiğin skuamöz kısmı çizilir.
- Bir matkap kademeli olarak temporal kemik serbest kemik anahat parça kesmek için kullanılmaktadır. Bakım bu dura veya serebral kortekse zarar mümkün olduğundan matkap çok fazla baskı uygulamaktan kaçının için alınmalıdır.
- Steril serum fizyolojik ile sık durular cerrahi alanın görselleştirme geliştirmek ve kafatası aşırı ısınmayı önlemek için yapılmaktadır.
- Gevşek bir köşeden başlayarak, temoporal kemik parça özenle dura ile ilişkili herhangi bir gemi gözyaşı değil emin yaparken ince sıçan dişli forseps kullanılarak kaldırılır.
- Dura değişmeden kalır ve enkaz steril serum fizyolojik kullanılarak uzak durulanır.
4. Serebral Arter Konstriksiyon kaydedilmesi
gerçek zamanlı, ET-1 ile indüklenen MCAO geçiyor bir sıçan görüntüleri yakalamak için nasıl göstermek için çadır "> Bu protokol için kullanılır.- Vazoaktif bileşiklerin uygulamasından önce, bir temel video en az 1 dakika süreyle kaydedilmelidir. Iğne önceki ET-1, enjeksiyon ile beyin parankima içine indirilir fakat edildikten sonra, ET-1 indüklenmiş MCAO için, taban kayıt yapılır.
- Şırınga pompası enjeksiyon için başladı ve 1 saat süre ile ya da arzu edilen son nokta kadar kaydedilir. İğne odak düzlemi bozuklukları önlemek için video kaydı sırasında yerinde bırakılır.
- Sıçan bu prosedürü izleyerek onaylanmış protokole göre derin anestezi ve ötenazi olmalıdır.
5. Görüntü Analizi
Gemi çapı görüntülenmiştir MCA herhangi bir kısmı için tespit edilebilir. Bir örnek olarak, ET-1 enjeksiyon öncesi ve sonrası zaman noktalarında damar çapını ölçmek için MCA bir dal kullanır. Stivideo ll kare VLC media player (VideoLAN) kullanarak 1 dakika aralıklarla yakalanır.
- VLC player yüklü ve açılır.
- Araçları ve daha sonra tercihlerini seçerek ayar altında "All" olarak değiştirildi "Ayarları göster."
- "Video menüsü" sol kenar çubuğundaki genişletilir ve "çıkış modülleri" sonra genişletilir. "Sahne filtreleri" sahnesi video filtresi menüyü getirmek için seçilir.
- "Sahne" dosya adı öneki için kutunun içine yazılır.
- Bir dizin yolu öneki tanımlanır. Hareketsiz kareleri kaydedilir yerdir.
- Bir kayıt oranının karesi yakalama istenilen oranı esas alınarak seçilir. Bir video saniyede 29 kare, sonra da "1749" (29 kare / sn x 60 sn / dk) yakalandı Eğer hala her 1 dakikada çerçeveye kaydetmek kutusuna girilmelidir. Tüm değişiklikler sonra kaydedilir.
- İstediğiniz video sonra otomatik olarak her 1 dakikada bir kez yine kare kaydetmek için VLC player açıldı.
- Damar çapı daha sonra bu kullanılarak ölçülürgörüntüler. Birincisi, ImageJ yazılım (NIH) açıldı.
- Sonra ölçmek olacağı hala çerçeveleri ImageJ açıldı.
- "Analiz" menüsünü seçerek, "ölçümler set" sonra açılır ve tüm kutuları işaretlemeyin vardır.
- Sonraki, düz bir çizgi aracı seçilir.
- Klavye kısayolu "Ctrl +" gerektiği gibi yakınlaştırmak için kullanılır ve bir çizgi damar çapı ölçmek için geminin yoluna dik yerleştirilir.
- Son olarak, damar uzunluk damar uzunluğu elde etmek için "önlemi" (CTRL + M) sonra "analiz" menü seçimi ile elde edilir.
- Bu işlem, en azından üç kez tekrarlandı ve yine de her bir kare cinsinden ölçülen her bir ölçülü bir kap için ortalaması alınmıştır.
- Çoklu karşılaştırmalar sıçan kullanılarak yapılabilir, böylece her bir zaman noktasında damar çapı baz damar çapı ile normalize edilir. Bunu yapmak için, her bir kabın% taban çapı hesaplamak için x% 100 formülüne akım çapı / taban çapı kullanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Hala çekilen video gösterisi alınan görüntülerin bundan sonra serebral arter çapı değişikliği ET-1 enjeksiyonu kolaylıkla bu kraniyal pencere tekniği (Şekil 2) kullanılarak takdir edilebilir. ET-1 enjeksiyonu birkaç dakika içinde, damar daralması ile başlayacak. Sonunda gemiler görselleştirmek için zor olacaktır ve beyin dokusu soluk olacak. Yaklaşık 20 dakika sonra ET-1 etkileri azalacak ve gemilerin giderek yaklaşık 45 dakika sonra bazal çap dönen, dilate başlayacaktır. Gerçekleşir daha belirgin vazokonstriksiyon ek olarak, kortikal yüzey ET-1, uygulamadan sonra soluk hale gelir. Bu, eğer istenirse, kalibre edilmiş bir mikroskop retikül ile damar çapı mutlak değişimi hesaplamak mümkündür. Birden sıçanlar arasında karşılaştırma için bir prosedür sırasında meydana damar çapı içinde göreceli değişiklik hesaplamak. Bu ölçümler ImageJ yazılımı (NIH) kullanarak gerçekleştirilir. Sonra, rel temsil eden bir grafiktirzamanla damar çapında ative değişikliklerin ardından (Şekil 3) inşa edilebilir.
Şekil 1. Zamansal kranyektominin yeri Diyagramı. Bu diyagram sol anterior odaklı ile sıçan kafatası iskelet anatomisi gösteriyor. Temporal kas lateral kafa sırt boyunca onun kaynağı vardır. Bu kas temporal kemiğin skuamöz bölümü görselleştirmek için bu sırt koparılıp ikiye gerekir. Bu temporal kemik dışına yansıtır gibi bir yaklaşık 3-4 mm kranyektominin sadece yörüngesine posterior ve elmacık sürecinin temel üstün bu yerde yapılabilir. Geniş ok kranyektomi gerçekleştirmek için konum göstermektedir. 3 küçük oklar MCA ve dallarını göstermektedir. Tüm arterlerBu konumda MCA ve arterlerin dalları onların olmayan dolambaçlı görünümü ve vazoaktif bileşiklerin duyarlılık hem damarları ayırt edilebilir olacaktır.
Şekil 2. ET-1 enjeksiyonu öncesi, ET-1 enjeksiyonu sonrası ve reperfüzyon sonrası Kraniyal pencere. Sol başlayarak, bir kafatası pencereden bakıldığında MCA şube temsilcisi görüntüsü gösterilir. Arterler morfoloji tarafından tespit edilebilir. Nispeten düz MCA sol alt kısmındaki alana girer ve bu görüntü bir büyük dal noktası vardır. Bu resimlerin Diğer gemilerin derin sesi ve kıvrımlı bir görünüm tarafından tespit edilebilir serebral damarlar vardır. Oklüzyon arterler boyunca hızla damarları ve doku soluk olacak. Yavaşça, arter dilate ve bazal çap dönecektir.
Şekil 3,. Tek bir fare. Yüzde bazal çap için zamanla Temsilcisi damar çapı basit formül, mevcut çapı / taban çapı x% 100 kullanarak zamanla hesaplanabilir. Bu, herhangi bir vazoaktif bileşik ile yapılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu küçük değişiklikler 4, 5 ile birçok deneylerin ihtiyaçlarını karşılamak için değiştirilebilir gibi Özetle, bu kraniyal pencere hazırlama tekniği çok yönlüdür. Örneğin, başarılı bir kraniyal pencere (Mekke AP 2009 ve 2011) ile görselleştirilmiş bir serebral arter doğrudan odaklanmak için lazer Doppler flowmetre kullanarak belirli MCA dallarında serebral kan akımı takip ettik. Buna ek olarak, dura kesik ile benzer bir hazırlama vivo vasküler reaktivite banyo içinde bir 3 oluşturmak için vazoaktif bileşiklerinin topikal uygulaması ile de kullanılabilir. Bu teknik için başarısızlık oranı azaltmak için bir kafatası pencere hazırlarken çeşitli faktörler dikkate alınmalıdır. Bu faktörlerin çoğu serebral arter iyi görselleştirme elde edilmesi ile ilgilidir. Bunu örten dura veya kan damarlarının matkap ile kesintiye değildir böylece kranyektomi oluştururken Öncelikle, dikkatli olunmalıdır. Bu en iyi yapılırsteril serum fizyolojik ile sık sık yıkar tarafından enkaz temizlemek ve kafatası soğutmak için. Çıkartıldığı zaman İkinci olarak, kemik parçası hafifçe kaldırılması gerekmektedir. Fragmanı kolayca çekip değilse, o zaman matkap ucu daha fazla kemik kesip almak için kullanılmalıdır. Son olarak, kan veya BOS küçük miktarlarda kolayca bu işlem sırasında kraniyal penceresinin görünümünü değiştirebilirsiniz. Gerçekleştirilen kraniektomi görselleştirme için gerekli olandan daha büyük olan kafatası içinde bir açıklık içerir. Bu nedenle, sıvı birikmesini önlemek için cerrahi site bağımlı kısmında birkaç emici süngerler yerleştirmek daha kolaydır. Bu süngerler bakım cerrahi aletler ile pencere engellememek için kullanılırsa, gerektiği gibi değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği Büyükşehir Güneydoğu Ortaklık (09GRNT2060421), Amerikan Tıp Derneği, ve Florida Klinik ve Translational Bilim Enstitüsü Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir. Adam Mekke bir NIH / NINDS, NRSA predoctoral fellow (F30 NS-060335) 'dir. Robert Regenhardt Hipertansiyon Florida Multidisipliner Eğitim Programı Üniversitesi (T32 HL-083810) den predoctoral burs desteğini aldı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Inhalation anesthesia system | VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA | 901806 | |
| Isoflurane anesthetic | Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA | 1001936060 | |
| Small animal stereotaxic system | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 900 | |
| Non-rupture ear bars, rat | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 957 | |
| Rat gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA | 1929 | |
| BAT-12 microprobe thermometer | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | BAT-12 | |
| T/PUMP, Thermal blanket | Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA | T/PUMP, TP600 | |
| Metzenbaum Scissors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 501254 | |
| Iris forceps | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 15915 | |
| Bulldog clamp retractors | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 14119-G | |
| 10 μl syringe 26-gaugue | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | SGE010RNS | |
| Bovie, high temperature cautery kit | World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA | 500392 | |
| Rat tooth forceps 0.12 | Stotz | E1811 | |
| Micromotor drill | Stoelting, Wood Dale, IL, USA | 51449 | |
| 0.8 mm round drill bur | Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA | RS-6280C-1 | |
| STORZ Bonn suturing forceps | Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA | ||
| Nylon Suture, size 3.0 | Oasis, Mettawa, IL, USA | MV-663 | |
| Cotton swabs | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | 22-029-488 | |
| Puralube eye ointment | Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA | NC0138063 | |
| Electric hair clippers | Oster, Providence, RI, USA | 78005-301 | |
| ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS | American Peptide, Sunnyvale, CA, USA | 88-1-10A | |
| Chlorhexidine, 2% | Agrilabs, St. Joseph, MO, USA | 1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322 | |
| Surgical microscope | Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA | Evolution xR6 | |
| Sony Handycam | Sony, Minato, Tokyo, Japan | HDR-SR12 | |
| Fiber optic illuminator | TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA | FO1–150 | |
| VLC media Player | (Paris, France) | ||
| Image J software | U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA |
References
- Levasseur, J. E., Wei, E. P., Raper, A. J., Kontos, A. A., Patterson, J. L. Detailed description of a cranial window technique for acute and chronic experiments. Stroke. 6, 308-317 (1975).
- Baumbach, G. L., Dobrin, P. B., Hart, M. N., Heistad, D. D. Mechanics of cerebral arterioles in hypertensive rats. Circ. Res. 62, 56-64 (1988).
- Regrigny, O., et al. Effects of melatonin on rat pial arteriolar diameter in vivo. Br. J. Pharmacol. 127, 1666-1670 (1999).
- Mecca, A. P., O'Connor, T. E., Katovich, M. J., Sumners, C. Candesartan pretreatment is cerebroprotective in a rat model of endothelin-1-induced middle cerebral artery occlusion. Exp. Physiol. 94, 937-946 (2009).
- Mecca, A. P., et al. Cerebroprotection by angiotensin-(1-7) in endothelin-1-induced ischaemic stroke. Exp. Physiol. 96, 1084-1096 (2011).
