Mit Hilfe eines Cranial Fenster, um den Nahen Cerebral Artery Während Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Visualisieren

Summary

Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Visualisierung rat Hirnarterien durch ein Schädel-Fenster mit zeitlicher Kraniektomie um proximalen Abschnitte der mittleren Hirnarterie anzusehen (

Abstract

Erstellung eines Schädel-Fenster ist eine Methode, die eine direkte Visualisierung der Strukturen ermöglicht auf der kortikalen Oberfläche des Gehirns ^1-3. Diese Technik kann an verschiedenen Orten, die über der Ratte Cerebrum durchgeführt werden, sondern ist am einfachsten durch die Schaffung eines Kraniektomie über den leicht zugänglichen frontalen oder Scheitelbeine durchgeführt. Am häufigsten haben wir diese Technik in Kombination mit dem Endothelin-1 cerebri Arterienverschluss Modell eines ischämischen Schlaganfalls, um die Änderungen in der mittleren zerebralen Arterie Gefäßdurchmesser, der mit Einspritzung von Endothelin-1 treten in das Hirnparenchym angrenzend an das proximale MCA quantifizieren ^{4, 5.} Um den proximalen Abschnitt des MCA während Endothelin induzierten -1 MCAO visualisieren, verwenden wir eine Technik, um ein Fenster durch die kraniale Schläfenbein auf der lateralen Seite des Schädels Ratte (Abbildung 1) zu schaffen. Hirnarterien können entweder mit der Dura intakt oder mit der Dura eingeschnitten und retra visualisiert werdenCTED. Am häufigsten, verlassen wir die Dura intakt während der Visualisierung, da Endothelin-1-induzierten MCAO beinhaltet Lieferung der gefäßverengende Peptids in das Hirnparenchym. Dies umgeht die Notwendigkeit, die Dura direkt über einzuschneiden visualisierter Behältern zur Medikamentenabgabe. Dieses Protokoll wird beschrieben, wie ein Schädel Fenster Hirnarterien in einer stufenweisen Weise visualisieren, und wie viele der möglichen Gefahren im Zusammenhang mit dieser Methode zu vermeiden erstellen.

Protocol

Dieses Protokoll wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) an der University of Florida zugelassen und ist in Übereinstimmung mit dem "Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren" (achte Auflage National Academy of Sciences, 2011).

Materialien

1. Tiere: Acht-Wochen-alt, männlich, Sprague Dawley Ratten (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) mit einem Gewicht von 250-300 g zum Zeitpunkt der Operation.
2. Anästhesie
   1. Inhalationsanästhesie System (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
   2. Isofluran Narkose (Baxter Pharmazie, Deerfield, IL, USA)
3. Stereotaktische System (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA)
   1. Kleintier stereotaktischen Systems
   2. Non-Ruptur Ohr Bars für Ratten
   3. Gas Anästhesie Kopfhalter für Ratten
4. Temperatur-Regelung
   1. BAT-12 Mikrosonde Thermometer (WorldPrecision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. T / PUMP, TP600 Thermal Decke (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
5. Chirurgische Instrumente
   1. Metzenbaumschere, Iris Pinzette, bulldog clamp Retraktoren, 10 ul Spritze mit 26 Gauge abgeschrägte Nadel, Bovie Kauter Kit (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
   2. Mikromotor Bohrer (Stoelting, Wood Dale, IL, USA)
   3. 0,8 mm Rosenbohrer bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
   4. STORZ Bonn Naht-Zange (Bausch und Lomb, Inc., Rochester, NY, USA)
6. Surgical Supplies
   1. 3,0 Nylonnaht (Oasis, Mettawa, IL, USA)
   2. Wattestäbchen, Puralube Augensalbe (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA)
   3. Chirurgische Punkte und Streifen (Medtronic Xomed, Inc., Jacksonville, FL, USA)
   4. Haarschneidemaschine (Oster, Providence, RI, USA)
   Chemicals
   1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
   2. Chlorhexidin 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
7. Visualisierung Ausrüstung
   1. Operationsmikroskop (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA)
   2. Sony Handycam HDR-SR12 (Sony, Minato, Tokio, Japan)
   3. Fiber Optic Illuminator (TechniQuip Corp, Livermore, CA, USA)
8. Messung der Gefäßdurchmesser
   1. VLC media player (Paris, Frankreich)
   2. Image J Software (ImageJ 1.42q Software, US National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

Ein. Präoperative Steps

1. Vor der Operation werden die Ratten unter einem 12:12 Hell / Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Wasser und Nagetierfutter untergebracht.
2. Narkose mit Isofluran in 4% 100% O _2-Gasgemisch in einer Induktionskammer induziert.
3. Die Krähe n des Kopfes mit elektrischen Haarschneidemaschinen rasiert.
4. Die Ratte wird in einer Bauchlage auf einem saugfähigen Kissen, das auf einer Temperatur-gesteuerten Bedienfläche (Wärmedecke) und der Kopf wird in der stereotaktischen Vorrichtung beginnend mit Plazierung des Gases Anästhetikum Gesichtsmaske platziert.
5. Anschließend werden die Stäbe Ohr eingesetzt und verschlossen.
6. Während des Verfahrens Anästhesie mit 2% Isofluran in 100% O _2-Gasgemisch aufrechterhalten wird.
7. Ophthalmischen Schmiermittels Salbe wird auf beide Augen aufgetragen und die Augenlider geschlossen sind, um Austrocknung Auges während des chirurgischen Verfahrens zu verhindern.
8. Rektale Temperatursonde eingeführt wird, um eine konstante tierischen Kerntemperatur von 37 ± 0,5 ° C zu halten
9. Mit dem Kopf der narkotisierten Ratte fest in der Vorrichtung gehalten stereotaxischen der chirurgische Umgebung gereinigt mit alternierenden Chlorhexidin und Kochsalzlösung dreimal.

2. Pre-kranialen Fenster Vorbereitung

nhalt "> Vor Erstellung einer kranialen Fenster sollte der Ratte für jegliche Experimente durch Implantation von anderen benötigten Hardware hergestellt werden sollten und alle notwendigen chirurgischen Eingriffe erhalten. Aus diesem Protokoll, wir zuvor eine Führungskanüle für Endothelin-1 (ET-implantierten 1) induzierte MCAO wie in einem Begleiter Publikation mit dem Titel angezeigt "Endothelin-1 induzierte Middle Cerebral Artery Occlusion Modell für ischämischen Schlaganfall mit Laser Doppler Flowmetrie Guidance in Ratte."

3. Schaffung des Cranial Fenster

Nach Platzierung einer Führungskanüle oder Einrichtungen für die Experimente erforderlich, wird eine Schädelknochen Fenster erzeugt, um direkt visualisieren proximalen Abschnitte der mittleren zerebralen Arterie während eines Hubes Prozedur.

1. Zunächst werden Schere verwendet, um die Haut über dem M. temporalis ab medial und Arbeitsbedingungen seitlich einschneiden.
2. Der M. temporalis wird halbiert mit Elektrokauter und dann zurückgezogen mit 3,0 Nylonnaht zu visua kristallisieren die Plattenepithelkarzinome Teil des Schläfenbein.
3. Ein ca. 3-4 mm Platz ist auf dem Plattenepithel Teil des Schläfenbein kaudal der Umlaufbahn und überlegen der Basis des Processus zygomaticus gezogen, wie es reflektiert der zeitlichen Knochen.
4. Ein Bohrer wird verwendet, um allmählich schneiden die skizzierten Stück Knochen frei von Schläfenbein. Es ist darauf zu vermeiden, dass zu viel Druck auf die Bohrmaschine da es möglich, die Dura oder Großhirnrinde beschädigen ist.
5. Häufige Spülungen mit steriler Kochsalzlösung durchgeführt werden, um die Visualisierung des OP-Feld zu verbessern und verhindern eine Überhitzung des Schädels.
6. Ab einer losen Ecke wird das Stück temoporal Knochen vorsichtig entfernt mit feinen rat-gezahnten Pinzette gleichzeitig dafür, dass keine Schiffe mit der Dura verbunden reißen.
7. Die Dura intakt bleibt und Schutt weg mit steriler Kochsalzlösung gespült.

4. Aufzeichnung von Cerebral Artery Constriction

Zelt "> Um zu demonstrieren, wie Sie Bilder in Echtzeit, eine Ratte, die durchlaufen ET-1-induzierten MCAO ist zu erfassen ist für dieses Protokoll verwendet.

1. Vor dem Aufbringen des vasoaktiven Verbindungen sollten eine Grundlinie Video für mindestens 1 min aufgezeichnet. Für ET-1-induzierten MCAO wird die Basislinie Aufzeichnung erfolgt, wenn die Nadel in das Hirnparenchym abgesenkt worden, aber vor der ET-1 Injektion.
2. Die Spritzenpumpe wird zur Injektion begonnen und aufgezeichnet für 1 Stunde oder bis zum gewünschten Endpunkt. Die Nadel wird in die während Videoaufzeichnung belassen, um Störungen der Fokalebene zu verhindern.
3. Die Ratte sollte tief betäubt und eingeschläfert nach einer genehmigten Protokoll des folgenden Verfahrens.

5. Image Analysis

Gefäßdurchmesser kann für einen beliebigen Teil der visualisierten MCA bestimmt werden. Als Beispiel verwenden wir ein Zweig der MCA zu Behälterdurchmesser bei Zeit-Punkten messen vor und nach ET-1 Injektion. Still Frames aus dem Video werden auf 1 min Abständen mit VLC media player (VideoLAN) erfasst.

1. VLC Player installiert und geöffnet.
2. Durch Auswahl von Werkzeugen und Vorlieben, wird die Einstellung auf "All" unter veränderten "Einstellungen anzeigen".
3. Der "Video-Menü" in der linken Navigationsleiste erweitert und "Output Module" wird dann erweitert. "Scene Filter" ausgewählt wird, um die Szene Videofilter Menü.
4. "Szene" in den Kasten für Dateinamenpräfix getippt.
5. Ein Verzeichnispfad Präfix definiert. Dies ist, wo Standbilder gespeichert werden.
6. Aufzeichnungs-Verhältnis wird auf der Basis der gewünschten Geschwindigkeit der Standbild-Capture ausgewählt. Wenn ein Video mit 29 Frames pro Sekunde, dann "1749" (29 Bilder / sec x 60 sec / min) erfasst wurde, sollte in der Box eingegeben werden, um zu sparen ein Standbild alle 1 min. Alle Änderungen werden dann gespeichert.
7. Die gewünschte Video wird dann im VLC-Player geöffnet werden, um automatisch noch retten Frames einmal pro 1 min.
8. Gefäßdurchmesser wird dann mit diesenBilder. Zuerst wird ImageJ Software (NIH) geöffnet.
9. Dann werden die Standbilder, die Sie messen in ImageJ geöffnet.
10. Durch die Auswahl der "analysieren" Menü "gesetzt Messungen" wird dann geöffnet und alle Boxen deaktiviert sind.
11. Als nächstes wird die gerade Linie Werkzeug ausgewählt.
12. Die Tastenkombination "Strg +" wird verwendet, um in nach Bedarf vergrößern und eine Linie senkrecht zur Schiffes Weg zum Gefäßdurchmesser zu messen.
13. Schließlich wird Gefäßlänge, indem Sie die "analysieren" Menü und dann "Maßnahme" (Strg + M) in den Behälter Länge zu erhalten erhalten.
14. Dieser Vorgang wird mindestens dreimal wiederholt und gemittelt für jede gemessene Gefäß in jedem Standbild gemessen.
15. Gefäßdurchmessers zu jedem Zeitpunkt an der Grundlinie Gefäßdurchmesser normiert, so dass Vergleiche können unter Verwendung mehrerer Ratten werden. Um dies zu tun, verwenden Sie die Formel aktuellen Durchmesser / Baseline Durchmesser x 100% die% Baseline Durchmesser jedes Schiff zu berechnen.

Representative Results

Standbilder von der Videoaufnahme entnommen wurden, zeigen, dass die Veränderung in Hirnarterie Durchmesser nach ET-1 Injektion kann leicht erkannt werden, mit dieser kranialen Fenster-Technik (Abbildung 2). Innerhalb von Minuten nach ET-1 Injektion wird das Schiff beginnt zu verengen. Schließlich die Gefäße schwierig sein wird, zu visualisieren und das Gehirngewebe wird bleich. Nach ca. 20 min die Auswirkungen von ET-1 wird abnehmen und die Gefäße beginnen zu erweitern, allmählich wieder auf den Ausgangswert Durchmesser nach ca. 45 min. Neben der offensichtlicher Vasokonstriktion, die auftritt, wird der kortikalen Oberfläche blasser nach ET-1 Verabreichung. Es ist möglich, die absolute Änderung des Gefäßdurchmessers mit einem kalibrierten Mikroskop Retikel berechnen, falls gewünscht. Zum Vergleich zwischen mehreren Ratten berechnen wir die relative Änderung des Gefäßdurchmessers, die während eines Verfahrens auftritt. Diese Messungen werden mit ImageJ Software (NIH). Dann wird eine graphische Darstellung des reltive Veränderungen im Gefäßdurchmesser im Laufe der Zeit kann dann aufgebaut (Abbildung 3).

Abbildung 1. Schematische Darstellung der Lage der zeitlichen Kraniektomie. Dieses Diagramm zeigt das Skelett Anatomie der Ratte Schädel mit vorderen orientiert sich an der linken Seite. Der M. temporalis hat seinen Ursprung an der lateralen Schädelbasis Kamm. Dieser Muskel muss von diesem Grat gelöst und halbiert, um den Plattenepithelkarzinomen Teil des Schläfenbein visualisieren. Eine etwa 3-4 mm Kraniektomie kann an dieser Stelle unmittelbar hinter der Bahn und über dem Boden des zygomatic Verfahren durchgeführt werden, wie es reflektiert von dem Schläfenbein. Der große Pfeil markiert den Speicherort für die Kraniektomie durchzuführen. Die 3 kleinen Pfeile zeigen die MCA und seine Äste. Alle Arterienan diesem Standort werden Zweige der MCA und Arterien von Venen kann sowohl durch ihre nicht-gewundene Aussehen und Empfindlichkeit gegenüber vasoaktiven Verbindungen unterschieden werden.

Abbildung 2. Cranial Fenster vor ET-1 Injektion, nach ET-1 Injektion und nach Reperfusion. Beginnend auf der linken Seite wird ein repräsentatives Bild der MCA Niederlassungen wie durch ein Schädel-Fenster angesehen gezeigt. Arterien können durch ihre Morphologie identifiziert werden. Die relativ gerade MCA in das Feld am unteren linken Seite und hat einen großen Knotenpunkt in diesem Bild. Andere Schiffe in diesen Abbildungen sind Hirnvenen, die durch ihre tieferen Ton und gewundenen Erscheinungsbild identifiziert werden können. Während Okklusion Arterien rasch verengen und das Gewebe wird blass. Langsam wird die Arterie erweitern und wieder auf den Ausgangswert Durchmesser.

Abbildung 3. Repräsentative Gefäßdurchmesser über die Zeit für eine einzige Ratte. Prozent Basislinie Durchmesser können mit der Zeit berechnet werden unter Verwendung der einfachen Formel, aktuellen Durchmesser / Basislinie Durchmesser x 100%. Dies kann mit jedem vasoaktiven Verbindung erfolgen.

Discussion

Zusammenfassend ist das kraniale Fenster Präparationstechnik sehr vielseitig wie sie kann geändert werden, um den Anforderungen vieler Versuche mit geringfügigen Modifikationen ^{4, 5} erfüllen. Zum Beispiel haben wir erfolgreich zerebralen Blutflusses in bestimmten MCA Niederlassungen mittels Laser-Doppler-Flussmessung direkt konzentrieren sich auf eine Hirnarterie visualisiert durch ein Schädel-Fenster (Mekka AP 2009 und 2011) überwacht. Zusätzlich kann eine ähnliche Zubereitung mit der Dura mit eingeschnittenen topischen Verabreichung von vasoaktiven Verbindungen verwendet werden, um eine in vivo Gefäßreagibilität Bad ³ zu erstellen. Mehrere Faktoren müssen in Betracht gezogen werden beim Herstellen einer kranialen Fenster, um die Fehlerrate für diese Technik zu verringern. Viele dieser Faktoren sind, um gute Visualisierung der zerebralen Arterien. Erstens muss darauf geachtet werden, beim Erstellen der Kraniektomie so dass die Dura oder Blutgefäße darüberliegenden es nicht mit der Bohrkrone gestört werden. Dies geschieht am bestendurch häufiges Waschen mit steriler Kochsalzlösung zu löschen Schutt und kühlen den Schädel. Zweitens sollte das Knochenfragment vorsichtig angehoben werden, wenn sie entfernt wird. Wenn das Fragment nicht ziehen nicht einfach weg, dann wird der Bohrer sollte verwendet werden, um weggeschnitten mehr Knochen werden. Schließlich können kleine Mengen von Blut oder Liquor leicht ändern das Aussehen des kranialen Fensters während dieses Verfahrens. Die Kraniektomie durchgeführt stellt eine Öffnung in den Schädel, die größer als für die Visualisierung erforderlich ist. Daher ist es leicht, mehrere absorbierende Schwämme in der abhängigen Abschnitt der Operationsstelle, um Fluid aus Akkumulieren verhindern platzieren. Diese Schwämme können nach Bedarf geändert, wenn Sorgfalt verwendet werden, nicht um das Fenster mit chirurgischen Instrumenten behindern.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Inhalation anesthesia system	VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA	901806
Isoflurane anesthetic	Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA	1001936060
Small animal stereotaxic system	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	900
Non-rupture ear bars, rat	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	957
Rat gas anesthesia head holder	David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA	1929
BAT-12 microprobe thermometer	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	BAT-12
T/PUMP, Thermal blanket	Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA	T/PUMP, TP600
Metzenbaum Scissors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	501254
Iris forceps	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	15915
Bulldog clamp retractors	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	14119-G
10 μl syringe 26-gaugue	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	SGE010RNS
Bovie, high temperature cautery kit	World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA	500392
Rat tooth forceps 0.12	Stotz	E1811
Micromotor drill	Stoelting, Wood Dale, IL, USA	51449
0.8 mm round drill bur	Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA	RS-6280C-1
STORZ Bonn suturing forceps	Bausch and Lomb, Inc., Rochester, NY, USA
Nylon Suture, size 3.0	Oasis, Mettawa, IL, USA	MV-663
Cotton swabs	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	22-029-488
Puralube eye ointment	Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA	NC0138063
Electric hair clippers	Oster, Providence, RI, USA	78005-301
ET-1 diluted to 80 μM concentration in PBS	American Peptide, Sunnyvale, CA, USA	88-1-10A
Chlorhexidine, 2%	Agrilabs, St. Joseph, MO, USA	1040, Rev. 6-06, NAC No.: 10580322
Surgical microscope	Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, USA	Evolution xR6
Sony Handycam	Sony, Minato, Tokyo, Japan	HDR-SR12
Fiber optic illuminator	TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA	FO1–150
VLC media Player	(Paris, France)
Image J software	U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA