Summary
פרוטוקול ספציפי ומהיר במקביל לחקירת פונקציה נכונה לב, דלקת ריאות, והתגובה החיסונית מתואר ככלי למידה. וידאו ודמויות מתארים פיזיולוגיה וטכניקות microdissection בצוות גישה מאורגנת שניתנת להתאמה לשימוש לקטן למחקרים בגודל גדולים.
Abstract
תפקוד הלב הנכון הוא להזרים דם דרך הריאות, ובכך מקשר פיזיולוגית לב ימנית ופיזיולוגיה של כלי דם ריאתי. דלקת היא צירוף שכיח של תפקוד לב וריאות, על ידי חדירה לפרט סלולרית, ייצור ציטוקינים וגורמי גדילה, ועל ידי ייזום תהליכי שיפוץ 1.
בהשוואה לחדר השמאלי, חדר ימין הוא משאבה בלחץ נמוך הפועלת באזור צר יחסי של שינויים בלחץ. לחצי עורק ריאה מוגברת קשורים ללחץ מוגבר במיטת כלי דם הריאה ויתר לחץ דם ריאתי 2. יתר לחץ דם ריאה קשור לעתים קרובות עם מחלות דלקתיות ריאה, למשל מחלת ריאות חסימתית כרונית, או מחלות אוטואימוניות 3. בגלל יתר לחץ דם ריאה מעניק פרוגנוזה גרועה לאיכות חיים ותוחלת חיים, הרבה מחקר מכוון להבנת המנגנונים שהמיגHT להיות מטרות להתערבות 4 תרופות. האתגר העיקרי לפיתוח של כלים לניהול יעילים עבור יתר לחץ דם ריאתי נשאר את המורכבות של ההבנה סימולטנית של שינויים מולקולריים ותאיים בלב הימני, ריאות ולמערכת החיסונית.
כאן, אנו מציגים את זרימת פרוצדורליים למדידה המהירה ומדויקת של שינויים בלחץ בלב הימני של עכברים וקציר סימולטני של דגימות מלב, ריאות ורקמות חיסוניות. השיטה מבוססת על הצנתור הישיר של חדר ממני דרך וריד הצוואר בעכברים קרובים חזה, פותח לראשונה בסוף 1990 כמדד חלופי של לחצים בעורק הריאה 5-13. צוות הגישה המאורגנת מאפשרת טכניקת צנתור מהירה מאוד נכונה לב. זה מאפשר לבצע את המדידות בעכברים כי באופן ספונטני לנשום אוויר חדר. הארגון של זרימת העבודה באזורי עבודה שונים-מפחית את השהיית זמן ופותח את האפשרות במקביל לביצוע ניסויי פיזיולוגיה וקציר רקמות חיסוניים, לב וריאות.
זרימת פרוצדורליים המתוארים כאן ניתן להתאים למגוון רחב של הגדרות במעבדה ועיצובי לימוד, מניסויים קטנים וממוקדים, למבחני מיון תרופות גדולים. הרכישה סימולטני של נתוני פיזיולוגית לב כי ניתן להרחיב לכלול אקו 5,14-17 וקציר של רקמות לב, ריאה וחיסון מפחיתה את מספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג נתונים שנעים בבסיס הידע המדעי קדימה. זרימת פרוצדורליים מוצגת כאן גם מספקת בסיס אידיאלי לרכישת ידע מהרשתות שהקישור, ריאות חיסוניות ותפקוד לב. את אותם עקרונות שהתוו כאן ניתן להתאים ללמוד איברים אחרים או נוספים במידת צורך.
Protocol
1. הכנה
- הכן את הפתרונים הבאים ואבובים (לוח 1), כדלקמן:
- הנקס פתרון, לא סידן, מגנזיום או חיווי עם פניצילין (100 U / ml) / סטרפטומיצין (100 מ"ג / מ"ל).
- נאגר מלוח פוספט (PBS), 1x, לא סידן, לא מגנזיום.
- אתנול, 70%, להפוך את 500 מ"ל.
- Buffered פורמלדהיד, 7-10% עם PBS, להפוך את 500 מ"ל.
- פתרוני אלחוש:
- Avertin. בזהירות להוסיף 5 מ"ל של 2-Methyl-2-butanol עד 5 גרם של 2,2,2-Tribromoethanol. נמס ברגע, לשמור פתרון מנייה בטמפרטורת חדר בחושך. קח 0.25 מ"ל של פתרון המנייה ולדלל אותו עם 10 מ"ל של 1xPBS בבקבוק זכוכית תחתונה. לעטוף את הבקבוק בנייר אלומיניום, במקום על 37 מעלות צלזיוס עד שהיא נמסה ולאחר מכן aliquot לתוך 5 צינורות פוליפרופילן מ"ל ולשמור במקרר. לחמם aliquot 1 בבוקרו של הניסוי.
- חומר הרגעה. לדלל פתרון מניות עם PBS לתת 2.6% רביטורטים סולution. הנח aliquots מ"ל 3-4 בצינורות פוליפרופילן.
- ארגן 3 עבודת אזורים (איור 1).
- אזור: סדר את הפריטים הבאים: טופס מחקר להקליט מספר זיהוי מחקר, תאריך, משקל גוף, משקולות של לב ימני, לב ומחץ שמאל; קנה מידת דיוק (0-50 בגרם דיוק 0.01 גר ') כדי לקבוע את משקל גוף; קנה מידת מייקרו כדי לקבוע משקולות לב בדיוק 0.001 גרם; פתרוני הרדמה (מסומן באופן ברור);; לשקול סירות קטנים דיואר עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 גם לאיסוף דם ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח ( טבלה 2, איור 2); ופתרונות כדי לנקות את המכשירים (טבלה 1).
- השטח B: סדר את הפריטים הבאים: מיקרוסקופ לנתח; קטטר לב הימני מחובר ליחידת שליטה בלחץ שמחוברת למגבר ומחשב נייד. מכניס צנתרמבחנה המכילה מים. סדר מכשירי ניתוח (טבלה 2), חתיכות לחתוך תפר לאורך אופטימלי והניח למשקל סירה; קלטת (קלטת חיטוי היא אופטימלית) חתוכה להאורך ולרוחב האופטימלי ועומדת בשורה על ספסל מיקרוסקופ או במעבדה לשם גישה נוחה; מטליות גפן פתרון מסיר שיער. כייל את הצנתר בתחילת המחקר.
- השטח C: סדר את הפריטים הבאים: זכוכית מגדלת העדשה; צינורית קנה נשימה; 1 מיליליטר מזרקים; לחתוך תפר לאורך אופטימלי ולהציב לתוך סירה לשקול; דיואר הקטן עם חנקן נוזלי; מכל מבודד עם קרח; צינורות וצלחת 24 היטב כדי לאסוף BAL ודגימות רקמה (טבלה 1); מכשירי ניתוח (טבלה 2); פתרונות לבצע BAL ולנקות את הצינורית קנה נשימה ואת המכשירים (טבלה 1).
2. צנתור לב ימני
- עכבר לשקול שימוש בסולם דיוק על ידי צבת עכבר בעדינות לתוך שוקל בשיבולת שועל. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט. הקלט משקל. הפרוטוקול המתואר עובד הכי טוב עבור עכברים שהם 20 גרמו או יותר בגלל הקוטר של עורק הצוואר צריך להכיל את הקטטר הלחץ; אפשר צנטר עכברים קטנים יותר (17 גרם או יותר), כל עוד הווריד גדול מספיק.
- לטשטש את העכבר באמצעות הזרקת Avertin תלוי במשקל הגוף (10 μl / g), לדוגמה, עבור 20 גרם לתת 200 μl, ל25 גרם לתת 250 μl, עבור 30 גרם לתת 300 μl. נפח ההזרקה המדויקת צריך להיות מותאם בהתאם לזן העכבר. הקפד לטפל בבעלי החיים בעדינות ובשקט, כי מתח יכול לשנות את התגובה לחומרי ההרדמה.
- ברגע שהעכבר מסומם, מניח על נייר טישו כפול קפלים. שים לב למספר תעודת הזהות על נייר. לשפשף בעדינות קרם להסרת שיער להיבט הגחון של הצוואר כדי לנקות את שדה הניתוח. הנח את העכבר חזרה על נייר ולחכות 1-2 דקות.
- הסרת שיער מהיבט הגחוןשל הצוואר על ידי מלטף את השיער נגד כיוון צמיחת השיער בעדינות עם צמר גפן.
- זהירות לקבוע את העומק המספיק של הרדמה בבדיקה להיעדר רפלקס בוהן: העכבר לא מגיב לצביטות האצבעות שלה.
- עבודה במהירות ובנינוחה, את שארית צנתור הלב הימני לא אמורה לקחת יותר מ 10 דקות, 3-6 דקות בצורה אופטימלית. חשובה שהרקמה לא תתייבש כי הצנתר צריך להחליק לתוך הווריד ולנוע בתוך הווריד על שכבת לחות. תזמון עקבי של ההליך הוא חשוב עבור הדור של נתונים שאינם ברים השוואה בין קבוצות.
- גב עכבר מקום על נייר טישו והעברה בנייר טישו על קלקר לוח. תקן את כפות רגליים וראש למקומו באמצעות קלטת חיטוי.
- הפוך חתך של עור מלסתות לעצם חזה (שד עצם).
- זהירות לנתח את מעלה הגדול בבלוטת התריס כלפי הצבתות לחשוף את עורק הצוואר הימניnd קנה נשימה.
- מקום קלקר הלוח מחזיק את העכבר מתחת למיקרוסקופ לנתיחה במטוס המוקד כבר במקום ועדשה בכ 0.8x הגדלה (גדלה מוחלטת [x חתיכת עדשת עין] הוא כ 8x.
- זהירות microdissect וריד צוואר הזכות על ידי הסרת רקמות חיבור המקיפים עם מלקחיים כירורגיים.
- מקום שתי חתיכות של תפרים על גבי עורק הצוואר הימני. לקשור את התפר הקרוב ללסתות כדי לסגור את זרימת דם בווריד לטפטוף זעיר, הנח את התפר שהוא קרוב ביותר לעצם החזה / שד העצם בקשר רופף מסביב לווריד. אפשר להשתמש בטפטוף הזעיר של דם מאוחר יותר כדי למצוא את החור בווריד, זה צריך להיות נחוץ.
- לנשום ולהירגע (לשחרר את השרירים בצוואר והלסת) כדי לשמור את העיניים על הווריד דרך עיני. זה יבטיח שהידות ואצבעות יהיו להעביר באופן מאובטח, בצורה חלקה ונינוח. בעוד מחזיק את הווריד עם מלקחיים בצד הקרוב להלסתות, לחתוך חור לווריד בין שני התפרים באמצעות מייקרו מספריים המופעלים על ידי היד השנייה. תוריד את מייקרו מספריים, ושמירה שרגועת יד, מרגיש לקטטר. בעדינות לשלוף את הקטטר מחזיק אותו בין אגודל והאצבע הראשונה (איור 3). הכנס את הקטטר אל תוך החור של הווריד.
- עדינות קידום הצנתר לתוך הלב הימני (איור 3). שימו לב לסימנים בקטטר שייתן מדד משוער של כמה רחוק קטטר צריך להיות מוכנס ולהתבונן בצג. ברגע עקומות הלחץ מוצגות, בעדינות להדק את התפר הנמוך סביב קטטר. בגלל קטטר יש חוזק מתיחה שנותן לו סליל, וכי קצב הנשימה ולב של העכבר להוסיף תנועה, בנוסף לקבע את הקטטר באמצעות קלטת.
- מדידות שיא לחץ ל2 דקות לניתוח מאוחר יותר (איור 4).
- פתח את התפר מחזיק קטטר, ואז בעדינות retrieve קטטר. נגב את החלק מאחורי מתמר לחץ, למקם אותו בחזרה לתוך הכוס עם מים. אל תיגע במתמר הלחץ.
- העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לאזור להמתת חסד, אוסף של רקמת דם וטחול. נקה מכשירי ניתוח.
- התחל את התהליך עם בעלי החיים הבאים. כאשר העיתוי מתיר, מזריק חומר ההרדמה בזמן המתנה כדי להקליט את עקומת לחץ (2.15).
3. איסוף דגימות דם וטחול
- הזרק barbiturate פתרון, 400 μl לעכבר ולחכות 1-2 דקות. זו מבוצעת באופן שגרתי במעבדה שלנו, כדי למנוע את האפשרות שעכברי טעות להתאושש מAvertin-הרדמה בעת היותו דמם. התקינה המתאימה של ניסוי מושגת על ידי הזרקת המנה הזהה של חומר הרגעת פתרון לעכבר, ועל ידי מתנה את אותה הכמות של זמן לפני הקציר של דם. אם מותר בטיפול בבעלי החיים המוסדי והשתמש ועדה ועוד החיות במעקב צמודות לעומק של הרדמה לפני exsanguination, צעד זה יכול להיות מושמט.
- הפוך חתך לתוך הבטן. פתח את וריד הזנב (וריד נבוב) ולאסוף דם באמצעות פיפטה העברה.
- הסר את הטחול, או חתיכת הטחול לתוך צינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או לתוך הצלחת גם 24 לחוצץ גם מכיל הנקס להכנה מאוחר יותר של תאים בודדים.
- העבר את העכבר על גבי נייר הטישו לC עבודת שטח לאיסוף BAL, ימפה ריאות ניקוז, ריאות ורקמות לב. נקה מכשירי ניתוח.
4. אוסף של ריאות ולב דוגמאות
- מנתח את קנה הנשימה החופשית של שרירים ורקמות חיבור. מלקחיים אותו תחת קנה הנשימה, דרך למשוך תפר. עדינות לייצר מתיחה מספיק כדי לחתוך חור. שמירה על המתיחה העדינה, הכנס את הצינורית של קנה הנשימה באמצעות תנועה מעט מפנה, ותפר הצינורית into מקום. להחדרה של צינורית קנה נשימה, לוודא שקנה הנשימה לח, אם יש צורך מוסיף טיפה של פתרון הנקס. במהלך ההליך, לנשום, להירגע צוואר ושרירי לסת, כדי לשמור על תנועות ידות בטוחות וחלקות.
- לנתח לפתוח את כלוב צלעות על ידי הסרת שד העצם החל מתום הבטן בזהירות. נא לא להפריע את התוכן של בית החזה, כי זה עושה את זה מאוד קשה למצוא לימפה.
- בצע רונכואלוואולרית שטיפה (BAL) על ידי הוספת 1 מ"ל של חיץ הנקס בעדינות, בעדינות להפוך את המזרק ולאחזר נוזל BAL. חזור 3 פעמים, צינור ומקום קרוב על קרח. במהלך ההליך, לשמור על עיניים בקצה הצינורית של קנה הנשימה המתחברת למזרק. מבט לבית החזה להתבונן האינפלציה והדפלציה של הריאות.
- צומת קציר ריאות הלימפה ידי החזקת קיר כלוב צלעות עם סט אחד של מלקחיים, מציאה ואחזור ימפה עם מלקחיים עוד. ימפה מקום לצלחת גם 24. חשוב kעכשיו איפה לחפש: החל מהצוואר, למצוא את הכניסה של כלוב הצלעות בצד הימני של העכבר ונראה מעל עמוד השדרה (איור 5).
- לב קציר ומניח על נייר טישו. לבודד את הלב הימני על ידי ביתור בזהירות לאורך המחיצה. העברה לעבודה באזור לשקול, רשום את המשקל והמקום לתוך צינורות Eppendorf לצלם הקפאה בחנקן נוזלי.
- הנח תפר סביב אונת הריאה השמאלית כדי לסגור את הסמפונות הראשית. מנתח את אונת הריאה השמאלית החופשית, מקום לצינור אפנדורף והקפאת צמד בחנקן נוזלי, או מקום לטוב של צלחת 24 היטב המכילה פתרון הנקס לבידוד מאוחר יותר של השעיות תא בודדות.
- הכנס כ. 0.5 מ"ל בופר פתרון פורמלדהיד דרך הצינורית קנה נשימה לאונות הריאה הנותרות. לאחר אינפלציה, לנתח את אונות ריאה מבית החזה והמקום לתוך שפופרת המכילה 50 מיליליטר תמיסת פורמלדהיד. לתכנון מחקר חלופי, הריאות יכולות להיות מנופחות עם optimal חיתוך התקשורת (אוקטובר, דילול 01:04 עם PBS) ולהקפיא בתבנית המכילה אוקטובר החי להכנה מאוחר יותר של חלקים קפואים. תכנון מחקר נוסף עשוי להצריך השגת רקמה קפוא צמד ריאות והשעיות תא בודדות מהריאות. במקרה זה, אין אינפלציה היא הכרחית: לנתח את אונות ריאה הנותרות; אחזר אותם לבית החזה והמקום לצלחת גם 24 לחוצץ הנקס גם מכיל.
- הסר צינורית קנה נשימה, נקיה על ידי שטיפה עם חיץ הנקס, לנקות מכשירי ניתוח.
5. ניתוח עקום לחץ שנוצר מצנתר הלב הימני
נתוני הלחץ הוקלטו חדרית מנותחים באמצעות 7 תוכנת LabChart ללא כל ידע בזהות הקבוצתית של כל הקלטה. יותר מ 20 עקומות נבחרות באופן אקראי וההבדל בין לחץ מקסימאלי והמינימאלי של חדר לכל עקומה נמדד (ΔP). ΔP הממוצע מחושב לתת זכות vלחץ הסיסטולי entricular.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאה העיקרית להשגת עקומות לחץ לב ימניות מושגת על ידי המיקום הנכון של צנתר הלב הימני. הצורה של העקומות בזמן לחץ היא קריטית, כי המיקום הנכון של הצנתר בתוך של חדר ממני יגרום מישורי לחץ (איור 4). קימורים מחודדים, במקום, מצביעים קטטר שמועבר על ידי הנשימה או תנועת פעימות לב לקיר של חדר ממני. כדי לזהות בעיות פוטנציאליות עם שלב ההישרדות של בעלי החיים, סטיית ההתקן של ΔP, וקצב הלב צריכה להיות מחושבות. שני הערכים צפויים להיות לא שונה משמעותי בין קבוצות טיפול. יתר על כן, הציפייה היא שערכי ΔP וקצב הלב לא מראים סחיפה על פני זמן ההקלטה. לדוגמה, הגדלת ערכי ΔP לאט היה מציינת vasoconstriction ריאתי היפוקסי 18-20. הפחתת קצב לב הייתי indicatדואר שהרמה של הרדמה היא גבוהה מדי שגרמו למותו של בעל החיים. במעבדה שלנו אנשים שונים לבצע את ההליך. בכל הקבוצות של עכברים אנו שגרתי להשיג אחוזי הצלחה 90-95% בהשגת נתוני לחץ חדרית נכונות.
תוך כדי למידת ההליך, עדיף להתחיל עם נקבות עכברים מבוגרים יותר (25-30 גרם ועוד) שיש להם וריד צוואר גדול יותר ונוטים להיות בעלי משקעי שומן תת עורי פחות מעכברי זכרים. הדרך הטובה ביותר לוודא את המיקום של הצנתר היא להרדימו בהקדם הצנתר מאובטח הפנימי של הווריד. מנתח את בעלי החיים החלו מלב ישירות לדמיין את המיקום של קטטר. זה יהיה מאוד להקל על פתרון בעיות.
התוצאה הראשונה לקבלת נוזל BAL היא המיקום הנכון של צינורית קנה נשימה. זה מסומן על ידי האינפלציה של הריאות כשהוא החדיר הנקס החיץ, והדפלציה של ריאות כאשר החובבאה הוא הוסר. ההתאוששות הצפויה היא 70-80% מהנפח החדיר בחיות בקרה, פחות (עד 50%) בבעלי חיים שיש להם דלקת ריאות. קצף מעל נוזל BAL התאושש מעיד על קיומו של שטח. זיהום דם של נוזל BAL התאושש או מתרחש בגלל הנוכחות של דלקת ריאות משמעותית, או בגלל החדרה והתאוששות של נוזל השטיפה הייתה מהירה מדי. יש לשים לב כי חלק מהצעדים חריפים של פגיעה בתוך הריאות יכולים להיגרם על ידי הליך BAL. אם עיצוב ניסיוני הוא להבין את הפרמטרים האלה חריפים פציעה והבחינה של BAL חשובה גם היא, ואז אונת ריאה אחת צריכה להיות אסופה ולהסיר לפני ביצוע BAL.
בהליך שמוצג כאן, אנחנו קוצרים רקמות ריאה ליסטולוגיה ללא אינפלציה וזלוף טופל של הריאות. במקרים בם morphometry היסטולוגית המדויקת הוא גדול לקריאה החוצה, הריאות צריכות להיות מנופחות דרך קנה נשימה, וperfusion להתבצע באמצעות עורק הריאה, והכל תחת לחץ סטנדרטי.
בפרוטוקול הראה, הלב גזור כדי לספק מדד פולטון כמדד ליפרטרופיה לב הימנית (משקל של חדר לב / משקל הנכון של חלל ומחיצה משמאל). בנוסף, השיטות חדשות מפותחות, המבוססים על הערכה היסטולוגית של הלב הימני. צעדים היסטולוגית מתעוררים של היפרטרופיה לב הימנית הם) במספר הגרעינים בתוך אזור מוגדר של לב ימני נבחר באקראי, וב) סעיפים של כלי שיט, ואינדקס fibrotic לאזור לב.
במעבדה שלנו, ההתאוששות הנכונה של ריאות ניקוז בלוטות לימפה וmediastinal tracheobronchial (איור 5) אומתה באופן שגרתי על ידי cytometry זרימה כי רקמות אלו הן קטנות מאוד בעכברי ביקורת. עם זאת, בהתאם microbiome במתקן הדיור וגילם של בעלי החיים, בגודל של בלוטות הלימפה בunchallenGED, עכברי בקרה עשויים להיות גדולים מספיק לאישור חזותי בלבד. בעת בדיקה על ידי cytometry זרימה, תאים הלימפה צריכים להיות נבדל thymocytes. במקרה, את התימוס יכול בקלות להיות דגם יחד עם בלוטות הלימפה בגלל התימוס והבלוטות הלימפה נמצאים קרוב זה לזה ונמצאים בתוך כלוב הצלעות. ההבחנה היא שהתימוס ממוקם קרוב לשד העצמות ובלוטת הלימפה הקרובה לשדרה. בהמשך מאתגר הוא שהתימוס הוא גדול מאוד, המכיל תאים רבים יותר מאשר את בלוטות הלימפה הקטנות. Thymocytes קלות ניתן להבחין בין תאים הלימפה באמצעות cytometry זרימה וCD3, CD4, CD8 וסמנים. בלוטות לימפה לי אופייני CD3 + תאים, שרובם הם או חיוביות עבור CD4 או CD8. לעומת זאת, הרוב המכריע של thymocytes הם חיובי עבור כל השלושה הסמנים (CD3 +, מסוג CD4 +, CD8 +). בהמשך במידע מעמיק על הלוקליזציה של בלוטות הלימפה עכבר ניתן למצוא בכתב היד על ידיאן דן ברוק ואח'. 21.
עיתוי עקבי של כל צעד פרוצדורלי ראשי (צנתור לב, התאוששות של דם וטחול, קציר, ריאות BAL ורקמות לב) הוא קריטי עבור הדור של נתונים המאפשר להשוואה חזקה בין קבוצות טיפול. לכן, מומלץ שלפחות שתיים, וטוב ביותר שלושה, חוקרים לשתף פעולה כדי להשיג את הניסוי. יתר על כן, זה קריטי, כי החוקרים לבצע את ההליך ללא ידיעה של זהות הקבוצה של בעלי החיים. לכן, זיהוי של הנתונים צריך להתבצע באופן שמטשטש את זהות הקבוצה. לבסוף, חשוב גם שההסדר שבו בעלי החיים מנותחים הוא אקראי. לדוגמה, מזהה פשוט הוא מועד הניסוי ורציפות מספור של בעלי החיים. אם יש לדוגמה 4 קבוצות של בעלי חיים (לספירה), להקצות זיהוי וללמוד את החיות על פי הסדר הבא: date_1: Aa, _2: התואר ראשון, date_3: Ca, date_4: דה, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: CB, וכן הלאה.
זרימה ניסויית זו מאפשרת למחקר מעמיק, בו זמני של המנגנונים המולקולריים השולטים בדלקת ריאות ותפקוד לב ימני. הנתונים בו זמנית וגביית מדגם משיגים תובנה טובות יותר לרשתות מולקולריות, וירידה במספר בעלי החיים הדרושים כדי להשיג ידע ביולוגי חדש.
| סוג של צינור / כוס | פתרון (נפח) | ניצול | |||
| עיבוד של דם | |||||
| אפנדורף, 1.5 מ"ל | דם לסרום | ||||
| EDTA מצופה 2.0 מ"ל | דם לפלזמה | ||||
| אפנדורף, 0.5 מ"ל | הקפאת סרום או פלזמה | עיבוד של BAL | |||
| פוליפרופילן, תחתית עגולה, 4.5 מ"ל | איסוף שטיפת רונכואלוואולרית | ||||
| פוליפרופילן, תחתית עגולה, 4.5 מ"ל | הקפא BAL supernatant | ||||
| צלחת 96-כן, הקיפה | תאי BAL | ||||
| עיבוד של רקמה | |||||
| פוליפרופילן, 50 מ"ל | פורמלדהיד, 7.5 מ"ל | תקן את רקמת ריאה | |||
| אפנדורף, 1.5 מ"ל | צמד אונת ריאת הקפאה | ||||
| אפנדורף, 1.5 מ"ל | צמד לב ימני הקפאה | ||||
| אפנדורף, 1.5 מ"ל | צמד לב שמאלי הקפאה | ||||
| צלחת 24 היטב | הנקס חיץ, 0.5-1 מ"ל | מהיר אחסון של אונות ריאה למאוחר יותרsolation של תאים בודדים | |||
| צלחת 24 היטב | הנקס חיץ, 0.5-1 מ"ל | אחסון מהיר של טחולים לבידוד מאוחר יותר של תאים בודדים | |||
| צלחת 24 היטב | הנקס חיץ, 0.5-1 מ"ל | אחסון מהיר של בלוטות לימפה לבידוד מאוחר יותר של תאים בודדים | |||
| לנהלים | |||||
| כוס זכוכית, 300 מ"ל | מי Autoclaved | לחות וניקוי קטטר | |||
| צינור פוליפרופילן, 50 מ"ל | הנקס חיץ, 50 מ"ל | בצע BAL | |||
| צינור פוליפרופילן, 50 מ"ל | הנקס חיץ, 50 מ"ל | שטוף את צינורית קנה נשימה | |||
| צינור פוליפרופילן, 50 מ"ל | פתרון חיטוי | ניקוי כלים | |||
| צינור פוליפרופילן, 50 מ"ל | 70% אתנול | Clמכשירי eaning | |||
| צינור פוליפרופילן, 50 מ"ל | מי ברז | ניקוי כלים | |||
טבלת 1. הכנה וארגון של צינורות ופתרונות.
| מכשיר | תיאור | להשתמש |
| מספרים | מעוגלים או ישר 5.5 אינץ', עגול או חדת קצוות | אזור |
| מספרים | מעוגל 4.0 אינץ, מסתיים חד | |
| מצבטים | 4.5 אינץ', כפוף, עם קצוות שטוחים, תופסני | |
| מצבטים | 4.0 אינץ', כפוף, עם קצוות שטוחים, תופסני | |
| מספרים | סלי Blades/Angled- 9 סנטימטרים | השטח B |
| מייקרו מספריים | טנדרnas מספרי האביב - 2 מ"מ להבים | |
| מצבטים | מלקחיים (Dumon # 5 פיין) | |
| מצבטים | 4.0 אינץ', כפוף, עם קצוות שטוחים, תופסני | |
| מצבטים | 4.0 אינץ', ישר, עם שטוח, קצוות התופסניות | |
| תפר | תפר קלוע משי 6-0 | |
| קתטרה | קטטר לחץ | |
| מספרים | מעוגלים או ישר 5.5 אינץ', עגול או חדת קצוות | השטח C |
| מספרים | מעוגל 4.0 אינץ, מסתיים חד | |
| מצבטים | 4.5 אינץ', כפוף, עם קצוות שטוחים, תופסני | |
| מצבטים | 4.0 אינץ', כפוף, עם קצוות שטוחים, תופסני | |
| קנייה | צינורית לקנה נשימה | |
| תפר | תפר משי קלוע4-0 |
טבלה 2. ארגון של מכשירים, תפר, קטטר, צינורית של קנה נשימה.
איור 1. מערכון סכמטי של אזורי עבודה.) עבודה באזור להקלטה, במשקל, אוסף של רקמת דם וטחול ומרחב מחזיק זמני לבעלי החיים. B) B-עבודת שטח לצנתור לב ימני. C) C-עבודת שטח לקציר של BAL, ריאות, בלוטות לימפה ריאות, ורקמות לב.
.. איור 2 מכשירים המשמשים להליך A) מכשירים לעבודת שטח A; B) מכשירים לצנתור לב ימני (עבודת שטח B); C) תוספותtruments לעבודת שטח C. D) cannulas קנה נשימה. השליט מראה את הגודל של המכשירים.
איור 3. ימני צנתר לב. צנתר לב ימני מוצג עם סימנים וקלטת (), או מוחזק ביד (ב '). נקודתי העיפרון בסימנים שעל הצנתר (). החדרת הצנתר (CE): ניקוי של עורק הצוואר הימני (ג); וריד sutured נערך עם מלקחיים, קטטר שהתקדם לעבר חור שנעשה בעבר לווריד (ד); קטטר לאחר כניסה לתוך הווריד (E). חיצים מצביעים על קטטר (D, E).
"/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
איור 4. עקבות מדגם של שינויים בלחץ בלב הימני. העקבות להראות שינויים בלחץ (מ"מ כספי) לאורך הזמן (דקות: שניות), התוכנה מציגה כל אחת מהעקומות בשתי מירויות שונות. העקבות של עכבר שליטה (); ועכבר עם שיפוץ דלקת ריאות הנגרמים עורק ויתר לחץ דם (B) מוצגים. עקומות המשמשות למדידת לחץ סיסטולי חדרית ימין מודגשות. שים לב לרמות הלחץ הברורות בקימורים המודגשים. נקודתי החיצים לעקומה שיש עלייה חדה מצביעה על טעות טכנית. סוגים אלה של עיקולים קוצניים לא יכולים לשמש למדידה של לחצי סיסטולי חדרית נכונות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.
0023fig5.jpg "alt =" איור 5 "/>
איור 5. מיקום של בלוטות לימפה mediastinal / tracheobronchial יחסית לכלוב צלעות ועמוד שדרה. החץ מצביע לימפה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרימה הניסויית המתוארת כאן מאפשרת מדידה מהירה וסימולטני של לחץ הנכון חדרית סיסטולי וקציר של דגימות לניתוח התשובות בריאות, לב והמערכת החיסונית בעכברים. ההליך משלב מדידות לב פיזיולוגיה, מייקרו נתיחה וקציר רקמה הבאה ללימודים חיים תא, ניתוח היסטולוגית או omics-ניתוח של הרקמות. ההליך המלא לוקח פחות מ 20 דקות לכל עכבר. בגלל זרימת עבודת שטח המאורגן, 2-3 חיות ניתן ללמוד בו זמנית. לפיכך, ההליך מתאים לניסויים קטנים וממוקדים 12 ומסכים בקנה מידה גדולים שבוצעו במגוון רחב של הגדרות, ממעבדה קטנה למחקר תרופות גדול.
שילוב של מדידות פיזיולוגית לב וקציר רקמה פותח את האפשרות לביצוע ניתוח שנועד לזהות רשתות בקרה ביולוגיות האו לסנכרן לב, ריאותפונקצית nd חיסונית, תוך ניצול משאבי ק.א. עכבר מהונדס ו. יתרון חשוב של זרימת ההליך בו זמנית הוא הירידה במספר בעלי החיים הדרושים למחקר. יישום נוסף של זרימת פרוצדורליים זה הוא האפשרות ללמוד איברים אחרים או נוספים מאותו בעל החיים במידת צורך.
ההליך המתואר כאן מייצר נתונים בלחץ לב ימניים בקצב מהיר מאוד, בתוך דקות 5-10 של אינדוקצית הרדמה. זה מאפשר ללמוד את החיות בזמן שהם נושמים אוויר חדר באופן ספונטני. הגבלה של הגישה היא שזה פולשני: החיות הן מורדמות, הם ממוקמים על גבם, וקטטר מועברת דרך וריד הצוואר דרך המבואה לחדר ימין. ההגבלה היא גם היתרון של הליך זה, כי הנתונים מייצגים מדידות ישירות של שינויים בלחץ לאורך הזמן בחדר ימין. שיפורים טכניים נוספים, בעיקר להסתמך על miniaturizing יחסי הציבורצנתרי essure, עשויים לאפשר למקום קבועים, צנתרי שכינה בעכברים המאפשרים הקלטה הישירה של לחץ עורק הריאה על כמה זמן שבועות, כפי שמתבצע בחולדות 22-24 וחיות גדולות אחרות. אם החדרת צנתר ללב דרך וריד הצוואר בקרבת חזה, נשימה ספונטנית חיות אינה אפשרית, הקלטת חלופה של שינויים בלחץ סיסטולי חדרית הנכונים יכולה להיעשות בחיות מאווררות ידי פתיחה של בית החזה והצבת קטטר הלחץ דרך חתך ישירות לתוך 25 החדר הימני. מדידות לא פולשנית של תפקוד לב ימני יכולות להתבצע באמצעות אקו. הליך זה גם יכול להתבצע לפני צנתור לב ימני, או עכברים יכולים להיבחן על ידי אקו עבור מספר רבות של פעמים כדי ללמוד התקדמות מחלה לפני המדידות פולשניים 5,14-17.
יישום נוסף של הליך זה הוא להשיג additionaנתוני ליטר. כדוגמה, באמצעות קטטר שניתן למדוד זרמים ולחץ, תפוקת לב ימנית יכולה להיות מוקלטת בו זמנית עם שינויים בלחץ לב ימניים. ההליך המתואר כאן יכול לשמש גם יותר להבין את השינויים הפיסיולוגיים, תאיים ומולקולריים שהדק של יתר לחץ דם ריאה אחרת מאשר התגובה החיסונית, למשל, מוטציות גנטיות 8,10, חשיפה לעשן סיגריות, 26 או זיהומים מיקרוביאליים 27-29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי האינטרסים הכריזו.
Acknowledgments
עבודה זו מומנה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות 1R21HL092370-01 (ג"ג), 1R01 HL095764-01 (ג"ג); R01HL082694 (ג"ו); איגוד לב אמריקאי, שותפי מייסדים (0855943D, ג"ג); סטוני ולד - הרברט קרן, ניו יורק (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
