Summary
En specifik og hurtig protokol til samtidigt at undersøge højre hjerte funktion, lungebetændelse, og immunresponset er beskrevet som et læringsredskab. Video og figurer beskriver fysiologi og mikrodissektions teknikker i et organiseret team-tilgang, der kan tilpasses til brug for små til store mellemstore studier.
Abstract
Funktionen af det rigtige hjerte er at pumpe blodet gennem lungerne, og dermed forbinder højre hjerte fysiologi og pulmonal vaskulær fysiologi. Inflammation er en almindelig modifier af hjerte-og lungefunktion, ved at udarbejde cellulær infiltration, produktion af cytokiner og vækstfaktorer, og ved at indlede remodeling fremgangsmåder 1.
I forhold til den venstre ventrikel, er højre ventrikel en lavtryks-pumpe, der opererer i et relativt snævert område af trykændringer. Øget lungepulsåren pres er forbundet med øget tryk i lungerne vaskulære seng og pulmonal hypertension 2. Pulmonal hypertension er ofte forbundet med inflammatoriske lungesygdomme, f.eks kronisk obstruktiv lungesygdom, eller autoimmunsygdomme 3. Fordi pulmonal hypertension giver en dårlig prognose for livskvalitet og forventede levetid, der er meget forskning rettet mod at forstå de mekanismer, der MIGht være mål for farmaceutiske intervention 4. Den største udfordring for udviklingen af effektive værktøjer til pulmonal hypertension forbliver kompleksiteten af den samtidige forståelse af molekylære og cellulære forandringer i den rigtige hjerte, lunger og immunsystem.
Her præsenterer vi en proceduremæssig workflow til hurtig og præcis måling af trykændringer i den rigtige hjertet hos mus og den samtidige høst af prøver fra hjerte, lunger og immune væv. Fremgangsmåden er baseret på den direkte kateterisering af den højre ventrikel via halsvenen i tæt overkrop mus, først blev udviklet i slutningen af 1990'erne som erstatningsmålingen af tryk i lungepulsåren 5-13. Den organiserede team-tilgang muliggør en meget hurtig højre hjerte kateterisation teknik. Dette gør det muligt at udføre målinger i mus, som spontant indånder rumluft. Organiseringen af work-flow i forskellige work-områderreducerer tidsforsinkelse og åbner mulighed for samtidigt at udføre fysiologi eksperimenter og høst immun, hjerte-og lunge væv.
Den proceduremæssige arbejdsgang beskrevet her kan tilpasses til en lang række laboratorietests og studere motiver, fra små, målrettede eksperimenter, til store lægemiddel-screeningsassays. Den samtidige køb af hjerte fysiologi data, som kan udvides til at omfatte ekkokardiografi 5,14-17 og høst af hjerte, lunge og immun væv reducerer antallet af dyr, der er nødvendige for at indsamle data, der bevæger den videnskabelige viden grundlag fremad. Den proceduremæssige workflow præsenteret her giver også et ideelt udgangspunkt for deres kendskab til de netværk, der forbinder immun-, lunge-og hjertefunktionen. De samme her skitserede principper kan tilpasses til at studere andre eller yderligere organer efter behov.
Protocol
1. Forberedelse
- Forbered følgende løsninger og rør (tabel 1) som følger:
- Hanks opløsning, uden calcium, magnesium eller indikator med penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 mg / ml).
- Phosphatbufret saltvand (PBS), 1x, intet calcium, no magnesium.
- Ethanol, 70%, fremstillingen af 500 ml.
- Pufret formaldehyd,, 7-10% med PBS fremstillingen af 500 ml.
- Bedøvelse løsninger:
- Avertin. Derefter tilsættes forsigtigt 5 ml 2-methyl-2-butanol til 5 g 2,2,2-tribromethanol. Når opløst, hold stamopløsning ved stuetemperatur i mørke. Tag 0,25 ml af stamopløsningen og fortynde den med 10 ml 1XPBS i glas bunden flaske. Omvikles flasken med aluminiumfolie, sted ved 37 ° C indtil opløsning og derefter aliquot i 5 ml polypropylenrør og opbevares i køleskab. Varm en alikvot om morgenen for forsøget.
- Barbiturat. Fortynd stamopløsning med PBS, hvilket gav 2,6% barbiturat solution. Placer 3-4 ml aliquots i polypropylenrør.
- Afholde tre arbejds-områder (figur 1).
- Område A: Arranger følgende punkter: studieform at optage studie identifikationsnummer, dato, kropsvægt, vægte på højre hjerte, venstre hjerte og septum, præcision skala (0-50 g ved 0,01 g præcision) for at bestemme kropsvægt; mikroskala at bestemme hjerte vægt på 0,001 g præcision veje både, anæstesi-løsninger (tydeligt), små Dewar med flydende nitrogen, isoleret beholder med is, rør og plade med 24 brønde til at indsamle blod-og vævsprøver (Tabel 1), kirurgiske instrumenter ( Tabel 2, figur 2), og til at rense instrumenterne (tabel 1).
- Område B: Arranger følgende punkter: dissektionsmikroskop, højre hjerte kateter forbundet til et tryk styreenhed der er forbundet til en forstærker og bærbar computer. Kateteret anbringes iet bægerglas indeholdende vand. Arranger kirurgiske instrumenter (tabel 2), stykker af sutur skåret til optimal længde og anbringes i et vejer båd, tape (autoklave tape er optimalt) skæres til optimal længde og bredde og linet op på mikroskop eller lab bænk for nem adgang, vatpinde og hår remover opløsning. Kalibrer kateteret ved begyndelsen af undersøgelsen.
- Område C: Arranger følgende punkter: lup linse, trachealkanyle, 1 ml sprøjter, sutur skæres til optimal længde og anbringes i et vejer båd, små Dewar med flydende nitrogen, isoleret beholder med is, rør og 24-brønds plade til at indsamle BAL og vævsprøver (Tabel 1), kirurgiske instrumenter (tabel 2), opløsninger til at udføre BAL og at rense den tracheale kanyle og instrumenterne (tabel 1).
2. Right Heart Kateterisering
- Afvejes musen med en præcision skala ved forsigtigt at placere musen i en vejer bhavre. Sørg for at håndtere dyret forsigtigt og roligt. Optag vægt. Den beskrevne protokol fungerer bedst for mus, som er 20 g eller mere, fordi diameteren af halsvenen skal rumme trykkateter, er det muligt at catheterize mindre mus (17 g eller mere), så længe venen er stor nok.
- Bedøve musen ved injektion med Avertin afhængigt af kropsvægt (10 ul / g), fx til 20 g opnåelse af 200 pi, for 25 g opnåelse af 250 pi, for 30 g opnåelse af 300 gl. Den nøjagtige injektionsvolumen skal justeres afhængigt af musestamme. Sørg for at håndtere dyret forsigtigt og roligt, fordi stress kan ændre respons på narkose.
- Når musen er bedøvet, sted på dobbelt-plisseret silkepapir. Bemærk ID-nummeret på papiret. Gnid forsigtigt hårfjerning lotion i den ventrale del af halsen for at fjerne det kirurgiske område. Placere musen tilbage på papiret og vente på 1-2 min.
- Fjerne hår fra den ventrale aspektaf halsen ved forsigtigt at stryge håret mod retningen af hårvækst med vatpinde.
- Omhyggeligt at fastlægge tilstrækkelig dybde af anæstesi ved at kontrollere for fraværet af tå refleks: musen reagerer ikke klemning af sine tæer.
- Arbejder hurtigt og afslappet, vil den resterende del af højre hjerte kateterisering ikke mere end 10 min, optimalt 3-6 min. Det er vigtigt, at vævet ikke tørrer ud, fordi kateteret skal glide ind i venen og bevæge sig inden i venen på et lag af fugt. Konsistent timing af proceduren er vigtig for dannelsen af sammenlignelige data mellem grupper.
- Placer musen tilbage på filtrerpapir og overførsel med silkepapir på styrofoam bord. Fix poter og hoved på plads ved hjælp af autoklave tape.
- Gør indsnit i huden fra underkæber til brystbenet (bryst-ben).
- Omhyggeligt dissekere de thyroid grand opad mod Kindbakkerne at eksponere den højre halsvene og trachea.
- Place styrofoam bestyrelse holder musen under dissektion mikroskop med fokus flyet allerede er på plads, og linsen på cirka 0,8 x forstørrelse (total forstørrelse [linse x okular] er ca 8x.
- Omhyggeligt microdissect den højre halsvene ved at fjerne omgivende bindevæv med kirurgiske pincet.
- Place to stykker sutur oven på den højre halsvene. Bind suturen tættest på kæberne at lukke blodgennemstrømningen i venen til en lille strøm, anbringe suturen, der er tættest på brystbenet / bryst-knogle på en løs knude omkring venen. Man kan bruge den lille strøm af blod til senere finde hullet i venen, hvis det bliver nødvendigt.
- Træk vejret og slappe af (løsne musklerne i nakke og kæbe) til at holde dine øjne på venen gennem okularet. Dette vil sikre, at dine hænder og fingre vil bevæge sig sikkert, smidigt og afslappet. Hold venen med en pincet på den side nærmestKindbakkerne, klippede et hul i venen mellem de to suturer med micro-saks drives af den anden hånd. Lćg mikro-saks, og holde den hånd afslappet, føler for kateteret. Forsigtigt hente kateteret holde den mellem tommelfingeren og pegefingeren (figur 3). Indsætning af kateteret i hullet af venen.
- Forsigtigt fremføre kateteret ind i højre hjerte (Figur 3). Overhold varemærker kateteret, der giver en omtrentlig indeks for, hvor langt kateteret skal indsættes og observere skærmen. Når trykket kurver vises, strammes forsigtigt den nedre sutur omkring kateteret. Fordi katetret er trækstyrken, der giver den en spole, og fordi vejrtrækning og hjerteslag af musen føje bevægelse, yderligere anbringe kateteret ved hjælp af tape.
- Optag trykmålinger i 2 minutter til senere analyse (figur 4).
- Åbn suturholderen kateteret, derefter forsigtigt hente CatheTer. Tør del bag tryktransduceren, skal du placere tilbage i bægerglasset med vand. Rør ikke ved tryktransducer.
- Overfør mus oven på tissuepapiret til område A for eutanasi, tapning af blod og miltvæv. Rengør kirurgiske instrumenter.
- Starter proceduren med den næste dyr. Når tiden tillader, injiceres den anæstetiske, mens man venter til registrering af trykkurven (2.15).
3. Tapning af blod og Spleen Prøver
- Injicere barbiturat opløsning, 400 gi pr mus og vente 1-2 min. Dette udføres rutinemæssigt i vores laboratorium for at undgå, at musene uforvarende komme sig Avertin-anæstesi under afblødning. Passende standardisering af eksperimentet opnås ved indblæsning af den samme dosis af barbiturat opløsning per mus, og ved at vente på samme tid før høst af blod. Hvis tilladt af Institutional Animal Care og brug Udvalg, og så længesom dyrene overvåges nøje for dybden af bedøvelse forud for åreladning, kan dette trin udelades.
- Gør indsnit i maven. Åbne caudale (vena cava) og opsamling af blod under anvendelse af en transfer pipette.
- Fjerne milten eller et stykke af milten i Eppendorf-rør og snap fryse i flydende nitrogen eller i 24-brønds plade til en brønd indeholdende Hanks buffer til senere fremstilling af enkeltceller.
- Overfør mus oven på tissuepapiret til arbejds-området C til opsamling af BAL-, lunge-drænende lymfeknude, lunge og hjerte væv. Rengør kirurgiske instrumenter.
4. Indsamling af lunge og hjerte Prøver
- Dissekere luftrør fri af muskel-og bindevæv. Placering pincet under luftrøret, træk suturen igennem. Forsigtigt generere tilstrækkelig stretch til at skære et hul. Opretholdelse af den blide stræk, skal du indsætte trachealkanyle med en let drejende bevægelse, og sutur kanyle på plads.Til indføring af den tracheale kanyle, sørge for, at luftrøret er fugtig, i givet fald tilsættes en dråbe Hanks opløsning. Hele proceduren, indånder, slappe hals og kæbe muskler, for at holde håndbevægelser sikker og glat.
- Dissekere åbne brystkassen ved omhyggeligt at fjerne bryst-ben startende fra den abdominale ende. Forstyr ikke indholdet af thorax, da dette vil gøre det meget svært at finde lymfeknude.
- Udfør bronchoalveolær udskylning (BAL) ved forsigtigt at indføre 1 ml Hanks-puffer, forsigtigt dreje sprøjten og hente BAL fluid. Gentag 3 gange, luk rør og sted på is. Under hele proceduren, holde øjnene på enden af den trakeale kanyle, der forbinder til sprøjten. Blik brystkasse at observere inflation og deflation af lungerne.
- Høst lunge lymfeknude ved at holde brystkassen væg med et sæt pincet, finde og hentning af lymfeknuden med en anden tang. Sted lymfeknude i 24-brønds plade. Det er vigtigt at vide anbragt, hvore søge: startende fra halsen, finde indgangen af brystkassen fra den højre side af mus og ser over rygsøjlen (figur 5).
- Harvest hjerte og sted på silkepapir. Isoler den rigtige hjerte ved forsigtigt at dissekere langs septum. Overførsel til arbejds-område A til veje, registrere vægt og plads i eppendorfrør at snappe fryse i flydende nitrogen.
- Anbring sutur omkring venstre lungelap at lukke main bronchus. Dissekere den venstre lungelap frit, anbringes i Eppendorf-rør og snap fryse i flydende nitrogen, eller anbringes i en brønd i en 24 brøndsplade indeholdende Hanks opløsning til senere isolering af enkeltcelle-suspensioner.
- Indsæt ca. 0,5 ml pufret formaldehydopløsning gennem den tracheale kanyle til de resterende lungelapper. Efter oppustning, dissekere de lungelapper ud af brystkassen og anbringes i 50 ml glas indeholdende formaldehydopløsning. For en alternativ undersøgelse design, kan lungerne blive oppustet med optimal cuttIDLER (OCT, fortyndet 1:4 med PBS) og fryses i en form indeholdende ufortyndet oktober til senere fremstilling af frosne snit. En anden undersøgelse konstruktion kan nødvendiggøre opnå snap frosset lungevæv og enkelte cellesuspensioner fra lungerne. I dette tilfælde er ingen inflation nødvendigt: dissekere de resterende lungelapper, henter dem fra brystkassen og anbringes i den 24-brønds plade til en brønd indeholdende Hanks puffer.
- Fjern trachealkanyle, ren ved skylning med Hanks buffer, rense kirurgiske instrumenter.
5. Analyse af trykkurver genereret fra Right hjertekateter
De registrerede højre ventrikulær tryk data analyseres ved hjælp af LabChart 7 software uden kendskab til den gruppe identiteten af hver optagelse. Mere end 20 kurver er valgt tilfældigt, og forskellen mellem maksimum og minimum ventrikulær pres for hver kurve målt (AP). Den gennemsnitlige AP beregnes for at give den rette ventricular systoliske blodtryk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det primære resultat for opnåelse højre hjerte trykkurver opnås ved den korrekte position i højre hjerte kateteret. Formen af tryk tidskurver er kritisk, fordi den korrekte placering af katetret inde i højre ventrikel vil resultere i tryk plateauer (fig. 4). Piggede kurver i stedet indikerer et kateter, der flyttes af åndedrættet eller hjerteslag bevægelse mod væggen i den højre ventrikel. At afsløre potentielle problemer med fase overlevelse af dyrene, standardafvigelsen af AP, og hjertefrekvensen skal beregnes. Begge værdier forventes at være ikke signifikant forskellig mellem behandlingsgrupperne. Desuden forventes det, at differenstrykket værdier og puls ikke viser et skred tværs optagetiden. For eksempel vil langsomt stigende AP værdier indikerer hypoxisk pulmonær vasokonstriktion 18-20. Faldende puls ville indicate, at niveauet af anæstesi er for højt førte til dyrets død. I vores laboratorium forskellige mennesker udføre proceduren. På tværs af alle grupper af mus vi rutinemæssigt opnå 90-95% succesrate med at få højre ventrikulær trykdata.
Mens man lærer af proceduren, er det bedst at starte med større hunmus (25-30 g og mere), som har en større halsvene og tendens til at have mindre subkutane fedtdepoter end hanmus. Den bedste måde at konstatere placeringen af katetret er at aflive dyret, så snart kateteret er fastgjort inden i venen. Dissekere dyret startende fra hjertet til direkte at visualisere placeringen af katetret. Dette vil i høj grad lette problemløsning.
Det første resultat for opnåelse af BAL fluid er den korrekte placering af den tracheale kanyle. Dette er angivet ved inflation af lungerne, når Hanks buffer indpodet, og tømning af lungerne, når buffare fjernes. Det forventede opsving er 70-80% af indgydt volumen i kontroldyr, mindre (ned til 50%) hos dyr, der har lungeinflammation. Skum på toppen af det udvundne BAL fluid indikerer tilstedeværelsen af overfladeaktivt middel. Blodkontaminering af det udvundne BAL fluid enten forekommer på grund af tilstedeværelsen af betydelige lungeinflammation, eller fordi drypning og udvinding af vaskevæske var for hurtig. Det skal bemærkes, at nogle akutte foranstaltninger skade i lungerne kan induceres ved BAL procedure. Hvis det eksperimentelle design er at forstå disse akut skade parametre og undersøgelse af BAL er også vigtig, så en lunge lap skal hæftes og fjernes før udførelse BAL.
I proceduren vist her, høster vi lungevæv for histologi uden standardiseret inflation og perfusion af lungerne. I tilfælde, hvor eksakt histologisk morfometri er den største udlæsning, bør lungerne blive oppustet via luftrøret, og perfusion skal udføres via lungepulsåren, alle under standardiserede tryk.
I det viste protokol, er hjertet dissekeret at give Fulton indekset som mål for højre hjerte hypertrofi (vægt af højre hjertekammer / vægt af venstre ventrikel og septum). Desuden er nye metoder, der udvikles, der er baseret på histologisk evaluering af højre hjerte. Nye histologiske foranstaltninger af højre hjerte hypertrofi er a) antallet af kerner inden for et afgrænset område af tilfældigt udvalgte højre hjerte, og b) tællinger af skibe, og fibrotisk indeks pr område i hjertet.
I vores laboratorium er den korrekte genvinding af lunge dræning mediastinale og tracheobronkiale lymfeknuder (fig. 5) rutinemæssigt kontrolleret ved flowcytometri, fordi disse væv er meget små i kontrolmus. Men afhængigt af microbiome i huset anlægget og dyrenes alder, størrelse af lymfeknuderne i unchallenGED, kan kontrolmus være tilstrækkeligt stort til kun visuel bekræftelse. Ved verifikation ved flowcytometri, lymfeknudeceller bør holdes adskilt fra thymocytter. Ved et uheld, kan thymus let udtages prøver sammen med lymfeknude fordi thymus og lymfeknuder er placeret tæt på hinanden og er indeholdt i brystkassen. Denne skelnen er, at thymus er placeret tæt på bryst-ben og lymfeknuderne tæt ved rygsøjlen. Yderligere udfordring er, at thymus er meget stor, indeholder mange flere celler end de små lymfeknuder. Thymocyter nemt kan skelnes fra lymfeknudeceller ved hjælp af flowcytometri og CD3, CD4 og CD8 markører. Lymfeknuder er karakteristisk CD3 +-celler, hvoraf størstedelen enten positive for CD4 eller CD8. I modsætning hertil er de fleste thymocyter positive for alle tre markører (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Yderligere i dybden oplysninger om lokaliseringen af muse lymfeknuder kan findes i manuskriptet vedvan den Broeck et al. 21.
Konsekvent timing af hvert hovedområde proceduremæssige trin (hjerte kateterisation, genvinding af blod og milt, høst af BAL-, lunge-og hjertesygdomme væv) er kritisk for fremskaffelse af data, der giver mulighed for robust sammenligning mellem behandlingsgrupperne. Derfor anbefales det, at mindst to, og tre bedste, undersøgere samarbejder om at udføre eksperimentet. Desuden er det kritisk, at efterforskerne udføre proceduren uden kendskab til den gruppe af dyrenes identitet. Derfor er identifikation af data skal foretages på en måde, der tilslører den gruppe identitet. Endelig er det også vigtigt, at den rækkefølge, hvori dyrene analyseres, er randomiseret. For eksempel er en simpel identifikator tidspunktet for eksperimentet og nummereringen af dyrene. Hvis der er for eksempel 4 grupper af dyr (AD), tildele identifikation og studere dyrene i følgende rækkefølge: date_1: Aa, dato_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, og så videre.
Denne eksperimentelle flow giver mulighed for en grundig, samtidig undersøgelse af de molekylære mekanismer, der styrer lunge betændelse og højre hjerte funktion. De samtidige data og prøveindsamling opnår bedre indsigt i molekylære netværk, og en reduktion i antallet af dyr, der er nødvendige for at opnå ny biologisk viden.
| Type af rør / bæger | Solution (volumen) | Udnyttelse | |||
| Behandling af blod | |||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Blod til serum | ||||
| EDTA coated 2,0 ml | Blod til plasma | ||||
| Eppendorf, 0,5 ml | Freeze serum eller plasma | Behandling af BAL | |||
| Polypropylen, rundbundet, 4,5 ml | Collect bronchoalveolær udskylning | ||||
| Polypropylen, rundbundet, 4,5 ml | Frys BAL supernatant | ||||
| 96-brønds plade, kantsyet | BAL-celler | ||||
| Behandling af væv | |||||
| Polypropylen, 50 ml | Formaldehyd, 7,5 ml | Ret lungevæv | |||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse lungelap | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse højre hjerte | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse venstre hjerte | ||||
| 24-brønds plade | Hanks-puffer, 0,5-1 ml | Quick-opbevaring af lungelapper til senere isolation af enkeltceller | |||
| 24-brønds plade | Hanks-puffer, 0,5-1 ml | Hurtig lagring af milte til senere isolering af enkeltceller | |||
| 24-brønds plade | Hanks-puffer, 0,5-1 ml | Hurtig lagring af lymfeknuder til senere isolering af enkelte celler | |||
| For procedurerne | |||||
| Bægerglas, 300 ml | Autoklaveret vand | Fugtgivende og rengøring kateter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Hanks-puffer, 50 ml | Udfør BAL | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Hanks-puffer, 50 ml | Vask trachealkanyle | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Desinficerende opløsning | Rengøring instrumenter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | 70% ethanol | Cleaning instrumenter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Tap vand | Rengøring instrumenter | |||
Tabel 1. Forberedelse og organisering af rør og løsninger.
| Instrument | Beskrivelse | Brug |
| Saks | afrundede eller ligekædet 5,5 tommer, runde eller skarpe ender | Område A |
| Saks | afrundet 4,0 inches, skarpe ender | |
| Tang | 4,5 tommer, bøjet, med flade, grådige ender | |
| Tang | 4,0 tommer, bøjet, med flade, grådige ender | |
| Saks | Slim Blades/Angled- 9 cm | Område B |
| Micro-saks | Vannas Spring Sakse - 2 mm Blades | |
| Tang | tang (Dumon # 5 Fine) | |
| Tang | 4,0 tommer, bøjet, med flade, grådige ender | |
| Tang | 4,0 tommer, lige, med flade, grådige ender | |
| Suturere | Flettet silkesutur 6-0 | |
| Kateter | Trykkateter | |
| Saks | afrundede eller ligekædet 5,5 tommer, runde eller skarpe ender | Område C |
| Saks | afrundet 4,0 inches, skarpe ender | |
| Tang | 4,5 tommer, bøjet, med flade, grådige ender | |
| Tang | 4,0 tommer, bøjet, med flade, grådige ender | |
| Kanyle | Trachealkanyle | |
| Suturere | Flettet silkesutur4-0 |
Tabel 2. Organisation af instrumenter, sutur, kateter, trachealkanyle.
Figur 1. Skematisk skitse af arbejds-områder. A) Work-område A til optagelse, vejning, tapning af blod og milt væv og midlertidig holde plads til dyrene. B) Work-område B for højre hjerte kateterisation. C) Work-område C for høst af BAL, lunger, lunge lymfeknude, og hjerte væv.
.. Figur 2 Instrumenter, der anvendes til proceduren a) instrumenter til arbejde-område A, B) instrumenter til højre hjerte kateterisation (arbejds-område B) c) instruments for arbejds-område C. D) Trakeal kanyler. Linealen viser størrelsen af instrumenterne.
Figur 3. Højre hjertekateter. Højre hjertekateter vist med mærker og tape (A), eller holdes i hånden (B). Blyanten peger på de mærker lavet på kateteret (A). Indføring af kateteret (CE): rengøring af den højre halsvene (C) sutureret vene holdes med pincet, er kateteret føres frem i retning af et hul tidligere fremstillet i venen (D) kateteret efter indføring i en vene (E). Pilene peger til kateteret (D, E).
"/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Fig. 4. Eksempel spor af trykændringer i højre hjerte. Sporene viser trykændringer (mmHg) over tid (min: sek), viser softwaren hver af kurverne ved to forskellige hastigheder. Sporene af en kontrol-mus (A), og en mus med inflammation induceret pulmonal arteriel remodellering og hypertension (B) er vist. Kurver anvendt til måling af højre systoliske ventrikulære tryk er fremhævet. Bemærk den klare trykket plateauer i de fremhævede kurver. Pilen peger på en kurve, der har en spyd angiver en teknisk fejl. Disse strittende typer af kurver kan ikke anvendes til måling af Højre ventrikels systoliske tryk. Klik her for at se større figur .
0023fig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Placering af en mediastinal / tracheobronkiale lymfeknude i forhold til brystkassen og rygsøjlen. Pilen peger på lymfeknude.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksperimentelle flow skitseret her giver mulighed for hurtig og samtidig måling af højre ventrikel systoliske blodtryk og høst af prøver til analyse af svarene i lunger, hjerte og immunforsvaret hos mus. Proceduren kombinerer hjerte fysiologi målinger, mikro-dissektion og efterfølgende væv høst for levende celle undersøgelser, histologisk analyse eller omik-analyse af væv. Den komplette procedure tager mindre end 20 min per mus. På grund af arbejds-området organiseret workflow, kan 2-3 dyr undersøges samtidigt. Derfor er fremgangsmåden er egnet til små, målrettede forsøg 12 og store skærme udføres i en lang række indstillinger, fra en lille laboratorie til et stort farmaceutisk undersøgelse.
Kombinationen af hjerte fysiologi målinger og væv høst åbner mulighed for at udføre analyser designet til at detektere biologiske netværk, der styrer eller synkronisere hjerte-, lunge ennd immunfunktion, udnytte transgene og KO mus ressourcer. En vigtig fordel ved den samtidige procedure flow er reduktionen i antallet af dyr, der er nødvendige per undersøgelse. En anden anvendelse af denne procedure arbejdsgang er muligheden for at studere andre eller yderligere organer fra det samme dyr efter behov.
Den procedure, der beskrives her genererer højre hjerte trykdata meget hurtigt, inden 5-10 min af anæstesi induktion. Dette gør det muligt at undersøge dyrene, mens de vejrtrækning rumluft spontant. En begrænsning ved den fremgangsmåde er, at den er invasiv: dyrene bedøvet, placeres de på ryggen, og et kateter føres via halsvenen gennem atrium ind i den højre ventrikel. Begrænsningen er også fordelen ved denne procedure, fordi dataene repræsenterer direkte målinger af trykændringer over tid i den højre ventrikel. Yderligere tekniske forbedringer, især bygger på miniaturizing af PREssure katetre, kan tillade at placere permanente, indlagte katetre i mus, der muliggør direkte optagelse af det pulmonale arterietryk over flere uger, som er ved at blive udført på rotter 22-24 og andre større dyr. Hvis insertion af et hjerte-kateter gennem halsvenen i tæt overkrop, trækker vejret spontant dyr ikke er muligt, kan en alternativ optagelse af højre ventrikels systoliske tryk foretages ændringer i ventilerede dyr ved åbning af thorax og placere trykkateter gennem en incision direkte ind i højre ventrikel 25. Ikke-invasive målinger af højre hjerte-funktionen kan gøres ved hjælp ekkokardiografi. Denne procedure kan enten udføres før højre hjerte kateterisering eller mus kan undersøges ved ekkokardiografi til flere gange at studere sygdomsprogression forud for de invasive målinger 5,14-17.
En anden anvendelse af denne fremgangsmåde er at opnå Additional data. Som et eksempel, anvendelse af et kateter, der kan måle strømme og tryk kunne højre hjerte output samtidigt registreres sammen med højre hjerte trykændringer. Fremgangsmåden angivet her, kan også anvendes til yderligere at forstå de fysiologiske, cellulære og molekylære forandringer, der udløser af pulmonal hypertension end immunreaktionen, for eksempel genetiske mutationer 8,10, cigaretrøg eksponering 26 eller mikrobielle infektioner 27-29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG) R01HL082694 (JW), American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG) Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
