Summary
동시에 오른쪽 심장 기능, 폐 염증 및 면역 반응을 조사하기 위해 구체적이고 빠른 프로토콜은 학습 도구로 설명되어 있습니다. 비디오 및 그림은 큰 규모의 연구에 작은에 사용할 수에 적용 할 수 있습니다 조직 팀 접근 방식에서 생리학 및 microdissection 기술을 설명합니다.
Abstract
오른쪽 심장의 기능은 따라서 오른쪽 심장 생리학과 폐동맥 혈관 생리학을 연결 폐를 통해 혈액을 펌프하는 것입니다. 염증 세포 침투, 크린 시토 킨과 성장 요인의 생산을 elaborating 의해 리모델링 프로세스에게 1 시작하여, 마음과 폐 기능의 일반적인 변형입니다.
왼쪽 심실에 비해 우심실 압력의 변화는 비교적 좁은 영역에서 작동하는 저압 펌프입니다. 증가 폐동맥 압력은 폐 혈관 침대 및 폐 고혈압 2 증가 압력과 연결되어 있습니다. 폐 고혈압은 종종 염증성 폐 질환, 예를 들어 만성 방해하는 폐 질환, 또는 면역 질환 3 연결됩니다. 폐 고혈압은 생명과 수명의 품질에 대한 나쁜 예후 (豫 后)를 수여하기 때문에, 많은 연구는 그 미그 메커니즘을 이해하는쪽으로 지향된다HT는 의약품 개입 4 타겟이 될. 폐 고혈압에 대한 효과적인 관리 도구의 개발을위한 주요 과제는 분자 및 세포 오른쪽 가슴의 변화, 폐, 면역 시스템의 동시 이해의 복잡성 남아 있습니다.
여기, 우리는 마우스의 오른쪽 중심에 압력 변화의 신속하고 정확한 측정을위한 절차 흐름과 심장, 폐, 면역 조직에서 샘플의 동시 수확을 제시한다. 방법 먼저 폐동맥 5-13의 압력 대리 조치로 1990 년대 후반에 개발 된 근접 chested 마우스의 경정맥 정맥,를 통해 우심실 직접 catheterization를 기준으로합니다. 조직 팀 접근 방식은 매우 빠른 오른쪽 심장 catheterization 기술을 용이하게한다. 이렇게하면 저절로 방 공기를 호흡 마우스에서 측정을 수행 할 수 있습니다. 서로 다른 업무 영역에서 작업 흐름의 조직시간 지연을 줄이고 동시에 생리학 실험 및 수확 면역, 심장과 폐 조직을 수행 할 수있는 가능성을 엽니 다.
여기에 설명 된 절차 흐름이 큰 약물 검사 assays에, 작은 타겟이 실험에서 실험 설정 및 연구 디자인의 다양한 적용 할 수 있습니다. echocardiography 5,14-17과 심장, 폐와 면역 조직의 수확을 포함하도록 확장 할 수 있습니다 심장 생리학 데이터의 동시 인수 앞으로 과학 지식 기반을 이동 데이터를 얻기 위해 필요한 동물의 수를 줄일 수 있습니다. 여기에 제시된 절차 흐름은 또한 면역, 폐 및 심장 기능을 연결하는 네트워크에 대한 지식을 얻기위한 이상적인 기반을 제공합니다. 여기에 설명 된 동일한 원칙은 필요에 따라 다른 또는 추가적인 장기를 공부하도록 구성 할 수 있습니다.
Protocol
1. 준비하기
- 다음과 같이 다음과 같은 솔루션 및 튜브 (표 1) 준비 :
- 행크스 솔루션, 아니 칼슘, 마그네슘 또는 표시 페니실린과 (100 U / ML) / 스트렙토 마이신 (100 MG / ML).
- 인산염은 염분 (PBS), 1X, 아니 칼슘, 마그네슘 노 버퍼.
- 에탄올, 70 %, 500 ML을합니다.
- 포름 알데히드 버퍼, PBS로 7~10%는 500 ML을합니다.
- Anaesthesia 솔루션 :
- Avertin. 조심스럽게 2,2,2 - Tribromoethanol의 5g에 2 - 메틸 -2 - 부탄올 5 ML을 추가합니다. 일단 용해, 어둠 속에서 실온에서 재고 솔루션을 유지. 주식 솔루션의 0.25 ML를 타고 유리 하단 병에 1xPBS의 10 ML로 희석. 37 알루미늄 호일, 장소와 병을 감싸 ° C 해산 한 후 나누어지는 5 ML의 폴리 프로필렌 튜브에, 냉장고에 보관까지. 실험의 아침에 하나 나누어지는을 따뜻하게.
- 바르비 투르 산염. 2.6 %에게 바르비 투르 산염 솔을주고 PBS로 주식 솔루션을 희석ution. 폴리 프로필렌 튜브에 3-4 ML의 aliquots를 놓습니다.
- 세 업무 영역 (그림 1)을 구성 할 수 있습니다.
- 지역 A : 연구 양식 연구 식별 번호, 날짜, 체중, 오른쪽 심장의 무게, 왼쪽 가슴과 심장 녹화, 체중을 결정하기 위해 정밀 규모를 (0.01 g의 정밀도에 0-50그램), 마이크로 규모 : 다음 항목을 정렬 0.001 g 정밀도에서 심장 가중치를 결정하는 것은, (수술기구, 배를 체중, 마취 솔루션 (명확하게 표시), 액체 질소로 작은 dewar, 얼음과 분리 된 용기, 튜브와 24도 판은 혈액 및 조직 표본 (표 1) 수집 표 2, 그림 2) 및 장비 (표 1) 청소하는 솔루션입니다.
- 지역 B : 해부 현미경, 증폭기 및 노트북 컴퓨터에 연결되어 압력 제어 장치에 연결된 마우스 오른쪽 심장 카테 테르 다음 항목을 준비합니다. 카테터가에 위치물을 포함하는 비커. 수술기구 (표 2), 최적의 길이 봉합 컷의 조각과는 배를 무게로 배치를 마련, 테이프 (압력솥 테이프 최적입니다) 최적의 길이와 너비로 잘라 쉽게 액세스 할 수 있도록 현미경 또는 실험실 벤치에 늘어선, 면봉과 머리 제거 솔루션입니다. 연구의 시작 부분에 카테터를 보정합니다.
- 지역 C는 :; tracheal 캐뉼라, 1 ML의 주사기, 봉합 최적의 길이 잘라 내기, 무게 배에 배치, 액체 질소로 작은 dewar, 얼음과 분리 된 용기, 튜브와 24도 판 BAL 수집 확대경 렌즈 : 다음 항목을 정렬 및 조직 표본 (표 1) 수술기구 (표 2) 솔루션은 BAL 수행하고 tracheal 캐뉼라와 악기를 (표 1) 청소.
2. 오른쪽 심장 Catheterization
- 부드럽게에 마우스를 배치하여 정밀 척도를 이용하여 마우스를 무게는 B를 무게귀리. 부드럽게 조용하게 동물을 처리 할 수 있는지 확인하십시오. 체중을 기록합니다. 설명 프로토콜은 경정맥 정맥의 직경이 압력 카테터를 수용 할 수 있기 때문에 20g 이상 아르 마우스에 가장 적합한, 그것은 정맥이 충분히 클하는 한 작은 쥐 (17g 이상) ...에 카테 테르를 꽂다 할 수 있습니다.
- , Avertin는 20g 200 μl을 줘 예를 들어, 체중 (10 μl / g)에 따라 함께 주입하여 마우스를 마취시키다 25 g 250 μl를 제공, 30에 g 300 μl을 제공합니다. 정확한 분사 볼륨은 마우스 변형에 따라 조정해야합니다. 스트레스가 마취에 대한 응답을 변경할 수 있기 때문에 부드럽게 조용하게 동물을 처리 할 수 있는지 확인하십시오.
- 이중 내기대로 티슈에 마우스가 진정되면, 장소. 종이에 ID 번호를 적어 둡니다. 부드럽게 외과 필드를 삭제하려면 목의 복부 측면에 머리 제거 로션을 문지르세요. 종이에 다시 마우스를 놓고 1-2 분 기다립니다.
- 복부 측면에서 머리를 제거부드럽게 면봉으로 머리 성장의 방향에 대해 머리를 쓰다듬어하여 목의.
- 조심스럽게 발가락 반사의 부재를 확인하여 마취의 충분한 깊이를 결정 : 마우스는 발가락의 곤란에 반응하지 않습니다.
- 신속하고 편안한 작업, 오른쪽 심장 catheterization의 나머지 최적, 3-6 분 이상 10 분 빼앗지는 않을 것입니다. 그것은 카테터가 정맥으로 활강과 수분의 레이어에 정맥의 내부로 이동해야하기 때문 조직 아웃 건조하지 않는 것이 중요합니다. 절차의 일관성 타이밍 그룹 간의 비교 아르의 데이터를 생성하는 것이 중요합니다.
- 조직 종이와 스티로폼 보드로 조직 종이 양도 플레이스 마우스 등. 압력솥 테이프를 사용하여 장소로 손과 머리를 수정합니다.
- 개미의 흉골 (가슴 뼈 -)에 피부 절개를합니다.
- 오른쪽 경정맥 정맥을 노출하는 개미를 향해 갑상선 그랜드 이상을 자세히 해부차 기관.
- 장소 스티로폼 보드가 약 0.8x 배율 (총 배율 [렌즈 X 눈 부분]에서 장소와 렌즈에 이미 초점 비행기와 해부 현미경 아래에 마우스를 길게 누르면 약 8 배속입니다.
- 조심스럽게 수술 포셉과 주변 결합 조직을 제거하여 오른쪽 경정맥 정맥을 microdissect.
- 오른쪽 경정맥 정맥 상단에 장소 봉합의 두 조각을. 작은 세류에 정맥에 혈액의 흐름을 닫 개미에 가장 가까운 봉합을 묶어, 정맥 주위에 느슨한 매듭에서 가슴 / 가슴 - 뼈에 가장 가까운 봉합을 배치합니다. 하나는 나중에 정맥에 구멍을 찾아 혈액의 작은 세류을 사용할 수 있습니다,이 필요할 때해야합니다.
- 숨을와 접안 렌즈를 통해 정맥에 눈을 유지하기 (목 턱의 근육을 풀어) 휴식을 취하실 수 있습니다. 이렇게하면 손과 손가락을 부드럽게하고 편안한, 안전하게 이동 될 수 있도록해야합니다. 가장 가까운 옆에 집게로 정맥를 누른 상태에서개미는, 다른 손으로 운영하는 마이크로 가위를 사용하여 두 개의 봉합 사이의 정맥에 구멍을 잘라 버릴거야. 마이크로 가위를 내려 놓고, 그 손 이완을 유지, 카테터에 대한 생각. 부드럽게 엄지와 첫 번째 손가락 (그림 3) 사이를 가지고있는 카테 테르를 검색합니다. 정맥의 구멍에 카테터를 삽입합니다.
- 부드럽게 오른쪽 심장 (그림 3)에 카테터를 전진. 카테터를 삽입해야 얼마만큼의 대략적인 인덱스를 포기하고 모니터를 관찰 카테 테르에서 점수를 관찰. 압력 곡선이 표시되면, 부드럽게 카테터 주변의 낮은 봉합사를 조이십시오. 카테터는에게 코일을 제공 인장 강도가 있기 때문에, 그리고 마우스의 호흡과 심장 박동이 부착 또한, 테이프를 사용하여 카테터를 모션을 추가 때문입니다.
- 나중에 분석을위한 2 분을 기록 압력 측정치 (그림 4).
- 카테터를 가지고있는 봉합을 열고 부드럽게 retrie카테터이 있어요. 압력 변환기 뒤에있는 부분을 닦아, 물을 비커에 다시 넣습니다. 압력 변환기를 만지지 마십시오.
- 안락사에 대한 지역을, 혈액, 비장 조직의 컬렉션에 휴지 위에 마우스를 전송합니다. 수술기구를 청소합니다.
- 다음 동물과 절차를 시작합니다. 압력 곡선 (2.15)를 기록하는 대기하는 동안 시간이 허용되면 마취를 삽입.
3. 혈액과 비장 샘플 수집
- 솔루션, 마우스 당 400 μl를 바르비 투르 산염로 1-2 분 기다려 주입. 이것은 일상적으로 없어져야하면서 쥐가 실수로 avertin - 마취에서 회복 가능성을 방지하기 위해 연구실에서 수행됩니다. 실험의 적절한 표준화는 마우스 당 바르비 투르 산염 솔루션의 동일한 복용량을 주입하고, 혈액의 수확하기 전에 시간의 동일한 금액을 기다리지에 의해 달성된다. 기관 동물 케어에 의해 허용 및위원회를 사용하여 경우오래 동물주의 깊게 전에 일어난 과다 출혈로 마취의 깊이에 대한 감시로,이 단계는 생략 할 수 있습니다.
- 복부에 절개를합니다. 꼬리 정맥 (정맥)을 열고 전송 피펫을 사용하여 피를 수집합니다.
- 비장을 제거하거나 Eppendorf 튜브 및 액체 질소에 스냅 동결에 비장의 한 부분, 또는 단일 셀의 나중에 준비 잘 포함 행크스 버퍼에 24 잘 판에.
- BAL의 수집, 폐 배수 림프절, 폐, 및 심장 조직에 대한 업무 지역 C에 휴지 위에 마우스를 전송합니다. 수술기구를 청소합니다.
4. 폐와 심장 샘플 수집
- 근육과 결합 조직의기도 무료로 해부. 기관에 따라 배치 포셉은을 통해 봉합을 당긴다. 부드럽게 구멍을 절단 할 수있는 충분한 신축성를 생성합니다. 부드러운 신축성을 유지하는 것은, 약간 회전 운동을 사용하여 tracheal 캐뉼라를 삽입하고, 봉합 캐뉼라 정수장소 O. 행크스 솔루션의 한 방울을 추가 필요한 경우 tracheal 캐뉼라의 삽입 들어, 기관은 습기 있는지 확인하십시오. 절차 전반에 걸쳐, 호흡 손 움직임이 안전하고 원활하게 유지하기, 목, 턱 근육을 휴식을 취하실 수 있습니다.
- 조심스럽게 복부 끝에서 시작하는 모유 뼈를 제거하여 흉곽을 열고 해부. 이 매우 하드 림프 노드를 찾을 수 있도록 할 용의가 있기 때문에 가슴의 내용을 방해하지 마십시오.
- 부드럽게 행크스 버퍼 1 ML를 삽입하여 bronchoalveolar 세척 (BAL)을 수행 부드럽게 주사기를 켜고 BAL 유체를 검색합니다. 3 번, 얼음에 가까운 튜브 및 장소를 반복합니다. 절차를 통해 주사기에 연결 tracheal 캐뉼라의 끝 부분에 눈을 유지. 폐의 인플레이션과 수축을 관찰하기 위해 가슴에 눈에.
- , 포셉 한 세트로 갈비 벽을 들고 찾아 다른 포셉과 림프 노드를 검색하여 수확 폐 림프절. 24 잘 판에 장소 림프절. 그것은 K 중요합니다지금은 어디 검색 방법 : 목부터 시작하면, (그림 5) 마우스의 오른쪽에서 갈비의 입구를 찾아 척추 위에 봐.
- 조직 종이에 수확 마음과 장소. 조심스럽게 심장과 함께 해부하여 바로 마음을 분리합니다. 이 무게 액체 질소에 동결을 부러 eppendorf 튜브에 무게와 장소를 기록 할 업무 영역에 전송할 수 있습니다.
- 주요 기관지를 닫 왼쪽 폐 엽 주위에 봉합사를 놓습니다. eppendorf 튜브 및 단일 세포 현탁액의 이상 격리에 대한 행크스 솔루션을 포함하는 24 잘 접시의 잘에 액체 질소, 또는 장소에서 스냅 동결로 왼쪽 폐 엽 무료로 장소를 해부.
- 약을 삽입합니다. 0.5 ML이 남아있는 폐의 엽 (叶)에 tracheal 캐뉼라를 통해 포름 알데히드 솔루션을 버퍼. 인플레이션 후, 포름 알데히드 용액을 포함하는 50 ML 튜브에 가슴과 장소의 폐 엽 (叶)을 해부. 대안 연구 설계를 들어, 폐 opti으로 증가 할 수 있습니다말 미디어 (OCT, PBS로 1시 4분을 희석)을 절단 및 냉동 섹션 나중에 준비를 위해 undiluted 10월를 포함하는 금형에 냉동. 또 다른 연구 디자인은 스냅 냉동 폐 조직과 폐의 단일 세포 현탁액을 얻는 필요로 할 수 있습니다. 이 경우 더 인플레이션 필요가 없습니다 : 남아있는 폐 엽 (叶)을 해부, 잘 포함 행크스 버퍼에 24 잘 판에 가슴과 장소에서를 검색합니다.
- 행크스 버퍼와 린스로 깨끗이 tracheal 캐뉼라를 제거 수술기구를 청소.
5. 오른쪽 심장 카테 테르에서 생성 된 압력 곡선 분석
녹화 오른쪽 심실 압력 데이터는 각 녹음의 그룹 ID에 대한 지식과 LabChart 7 소프트웨어를 사용하여 분석하고 있습니다. 20 개 이상의 곡선은 무작위로 선택된 각 커브에 대한 최대 및 최소 심실 압력의 차이는 (ΔP) 측정합니다. 평균 ΔP는 오른쪽 v를 보여주고 계산됩니다entricular 수축기 압력.
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Representative Results
오른쪽 심장 압력 곡선을 얻기위한 기본 결과는 오른쪽 심장 카테 테르의 정확한 위치에 의해 달성된다. 오른쪽 심실의 카테 테르 내부의 정확한 위치는 (그림 4) 압력 고원의 결과 때문에 압력 시간 곡선의 모양이 중요합니다. 뾰족한 곡선은 대신, 오른쪽 심실의 벽 호흡이나 심장 박동 운동에 의해 이동 카테터를 나타냅니다. 동물의 생존의 무대 잠재적 인 문제를 감지하려면 ΔP의 표준 편차, 그리고 심장 박동이 계산해야합니다. 두 값은 치료 그룹 사이에 크게 차이가 될 것으로 예상된다. 또한, 기대는 ΔP 값과 심장 박동이 녹화 시간에 걸쳐 드리프트를 표시하지 않는 것입니다. 예를 들어, 천천히 ΔP 값을 늘리면 hypoxic 폐 혈관 수축 18-20을 나타냅니다. 심장 박동를 낮추면 indicat 것마취의 수준은 동물의 죽음으로 이어지는 너무 높은 것을 전자. 저희 연구실에서 다른 사람들이 절차를 수행합니다. 마우스의 모든 그룹에 걸쳐 우리는 정기적으로 오른쪽 심실 압력 데이터를 얻을에 90~95% 성공 속도를 얻을 수 있습니다.
절차를 학습 있지만, 큰 경정맥 정맥을 가지고 남성 생쥐보다 피하 지방 예금을 가지고하는 경향이 나이가 여성 마우스 (25-30그램 등)로 시작하는 것이 가장 좋습니다. 카테터의 위치를 확인하는 가장 좋은 방법은 가능한 한 빨리 카테터가 정맥의 내부에 고정 될 때 동물을 안락사시켜야하는 것입니다. 직접 카테터의 위치를 시각화하는 마음부터 동물을 해부. 이 크게 문제가 해결 촉진합니다.
BAL 유체를위한 첫 번째 결과는 tracheal 캐뉼라의 정확한 위치입니다. 이것은 행크스 버퍼 배우는 거죠 폐의 인플레이션, 그리고 폐의 수축으로 표시 될 때 광어가 제거됩니다. 예상 복구 폐 염증이 동물에서 제어 동물에서 배우는 볼륨 70-80%이며, 적은 (아래 50 %). 복구 BAL 유체의 위에 거품은 계면 활성제의 존재를 나타냅니다. 복구 BAL 유체의 혈액 오염 중 하나 때문에 상당한 폐 염증의 존재로 인해 발생하거나, 떨어 뜨림과 세척 유체의 복구는 너무 빨랐어 때문입니다. 그것은 폐에서 부상의 일부 급성 조치는 BAL 절차에 의해 유도 될 수 있다는주의입니다. 실험 디자인이 급성 부상 매개 변수 및 BAL의 심사도 중요합니다 이해를하는 경우, 다음 하나 폐 엽이 해제 묶고 BAL를 수행하기 전에 제거해야합니다.
여기에 표시된 절차에서, 우리는 폐의 표준화 인플레이션과 재관류없이 조직학에 대한 폐 조직을 수확. 정확한 조직 학적 morphometry 읽기 아웃의 주요입니다 경우, 폐는 호흡 관 및 PE를 통해 증가 할 것rfusion은 모든 표준 압력이 폐동맥을 통해 수행해야합니다.
표시된 프로토콜에서 심장이 오른쪽 심장 비대의 측정 (왼쪽 심실 중격과의 우심실 / 무게의 무게)로 풀톤 색인을 제공하기 위해 해부되어 있습니다. 또한, 새로운 방법은 오른쪽 심장의 조직 학적 평가에 근거됩니다 개발되고있다. 오른쪽 심장 비대의 새로운 조직 학적 조치는 무작위로 선택된 바로 마음의 정의 영역 내에서) 핵의 수이며, B) 선박과 마음의 영역 당 fibrotic 인덱스의 개수.
이러한 조직이 통제 마우스에 매우 작기 때문 저희 연구실에서 mediastinal 및 tracheobronchial 림프절 (그림 5) 배수 폐의 정확한 복구 정기적으로 유동 세포 계측법에 의해 확인된다. 그러나, 주택 시설 및 동물의 나이, unchallen에있는 림프절의 크기에 microbiome에 따라검정 고시 공부, 컨트롤 마우스는 시각적 인 확인을 충분히 큰 수 있습니다. 유동 세포 계측법에 의해 확인되면 림프절 세포는 thymocytes 구별해야합니다. thymus과 림프절이 가까이 서로 위치하고 있으며, 흉곽 내에 포함되어 있기 때문에 사고로, thymus 쉽게 림프절과 함께 맛보실 수 있습니다. 의 구분은 thymus이 가까이 모유 뼈와 척추에 가까운 림프절에 자리 잡고 있다는 것입니다. 또한 도전은 thymus는 작은 림프절보다 더 많은 세포를 포함하는 매우 큰 점입니다. Thymocytes 쉽게 유동 세포 계측법과 3 번 CD, CD4, CD8 및 마커를 사용하여 림프절 세포 구별 할 수 있습니다. 림프 노드는 특질 상 3 번 CD + 세포를 가지고 대부분은 CD4 또는 CD8에 대한 중 긍정적입니다. 대조적으로, thymocytes의 대부분이 세 가지 마커에 대한 긍정적 인 (3 번 CD +, CD4 +, CD8 +). 마우스 림프절의 지역화에 대한 자세한 정보에 더는이 논문에서 찾을 수 있습니다반 덴 Broeck 외. 21.
각 주요 절차 단계 (심장 catheterization, 혈액, 비장의 복구, BAL, 폐 및 심장 조직의 수확)의 일관된 타이밍 치료 그룹 사이의 강력한 비교를 허용 데이터의 생성에 중요합니다. 따라서, 그것은 적어도 두 개의하고, 3, 조사관 실험을 달성하기 위해 협력 할 것을 권장합니다. 또한,이 조사는 동물의 그룹 ID에 대한 지식없이 절차를 수행하는 것이 중요합니다. 따라서 데이터의 식별은 그룹 ID를 불분명하게하는 방식으로 변경해야합니다. 마지막으로, 동물 분석되는 순서는 무작위입니다 또한 중요합니다. 예를 들어, 간단한 식별자는 동물의 번호 실험과 연속의 날짜입니다. 동물의 4 그룹 (AD)는 예를 들어이있는 경우, 식별을 지정하고 다음 순서대로 동물을 연구 : DATe_1 : AA, 날짜 : 바, date_3 : CA, date_4 : 다, date_5 : AB, date_6 : BB, date_7 : CB 등.
이 실험 흐름이 폐 염증과 오른쪽 심장 기능을 제어하는 분자 메커니즘에 대한 깊이, 동시 학습 할 수 있습니다. 동시 데이터 및 샘플 컬렉션은보다 나은 분자 네트워크에 대한 인사이트, 그리고 소설 생물학적 지식을 얻기 위해 필요한 동물의 수의 감소를 달성.
| 관 / 비커의 종류 | 솔루션 (볼륨) | 이용 | |||
| 혈액의 처리 | |||||
| Eppendorf, 1.5 ML | 혈청 혈액 | ||||
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 코팅 2.0 ML | 플라즈마에 대한 혈액 | ||||
| Eppendorf, 0.5 ML | 동결 혈청 또는 혈장 | BAL의 처리 | |||
| 폴리 프로필렌, 둥근 바닥, 4.5 ML | bronchoalveolar 세척 수집 | ||||
| 폴리 프로필렌, 둥근 바닥, 4.5 ML | BAL 표면에 뜨는는 멈추고 | ||||
| 96 - 웰 플레이트는, skirted | BAL 세포 | ||||
| 조직의 처리 | |||||
| 폴리 프로필렌, 50 ML | 포름 알데히드, 7.5 ML | 폐 조직을 수정 | |||
| Eppendorf, 1.5 ML | 동결 폐 엽 낚아 | ||||
| Eppendorf, 1.5 ML | 동결 권리 마음을 낚아 | ||||
| Eppendorf, 1.5 ML | 동결 왼쪽 가슴을 낚아 | ||||
| 24 잘 판 | 행크스 버퍼 0.5-1 ML | 나중에위한 폐 엽 (叶)의 빠른 스토리지단일 세포의 solation | |||
| 24 잘 판 | 행크스 버퍼 0.5-1 ML | 단일 세포의 이상 고립에 spleens의 빠른 저장 | |||
| 24 잘 판 | 행크스 버퍼 0.5-1 ML | 단일 세포의 이상 분리에 대한 림프절의 빠른 저장 | |||
| 절차에 대한 | |||||
| 유리 비커, 300 ML | Autoclaved 물 | 카테터를 보습 및 청소 | |||
| 폴리 프로필렌 튜브 50 ML | 행크스 버퍼, 50 ML | BAL을 수행 | |||
| 폴리 프로필렌 튜브 50 ML | 행크스 버퍼, 50 ML | tracheal 캐뉼라를 씻어 | |||
| 폴리 프로필렌 튜브 50 ML | 살균제 솔루션 | 악기를 청소 | |||
| 폴리 프로필렌 튜브 50 ML | 70 % 에탄올 | CLeaning 악기 | |||
| 폴리 프로필렌 튜브 50 ML | 수도물 | 악기를 청소 | |||
표 1. 준비 및 튜브 및 솔루션의 조직입니다.
| 기계 | 기술 | 사용 |
| 가위 | 반올림 또는 바로 5.5 인치 원형 또는 날카로운 끝 | 지역 |
| 가위 | 4.0 인치 날카로운 끝을 둥글게 | |
| 집게 | 평면 물체를 움켜 끝을 가진 4.5 인치, 구부러진, | |
| 집게 | 평면 물체를 움켜 끝을 가진 4.0 인치, 구부러진, | |
| 가위 | 슬림 Blades/Angled- 9cm | 지역 B |
| 마이크로 가위 | 반NAS 봄 가위 - 2 밀리미터 블레이드 | |
| 집게 | 포셉 (Dumon은 # 5 파인) | |
| 집게 | 평면 물체를 움켜 끝을 가진 4.0 인치, 구부러진, | |
| 집게 | 4.0 인치, 직선과 평면 물체를 움켜 종료 | |
| 상처의 봉합 | 합 사형 실크 봉합 6-0 | |
| 카테 테르 | 압력 카테터 | |
| 가위 | 반올림 또는 바로 5.5 인치 원형 또는 날카로운 끝 | 지역 C |
| 가위 | 4.0 인치 날카로운 끝을 둥글게 | |
| 집게 | 평면 물체를 움켜 끝을 가진 4.5 인치, 구부러진, | |
| 집게 | 평면 물체를 움켜 끝을 가진 4.0 인치, 구부러진, | |
| 캐뉼라 | Tracheal 캐뉼라 | |
| 상처의 봉합 | 합 사형 실크 봉합4-0 |
악기의 표 2. 조직, 봉합, 카테터, tracheal 캐뉼라.
그림 1. 업무 분야의 도식 스케치. A) 업무 영역 녹화, 무게, 혈액, 비장 조직과 동물 임시 보관 공간의 모음입니다. 오른쪽 심장 catheterization을위한 B) 업무 - 지역 B. C) BAL, 폐, 폐 림프절 및 심장 조직의 수확 작업 - 지역 C.
.. 업무 영역에 대한 절차에 사용되는 그림 2 계측기 A) 계측기 A; B) 오른쪽 심장 catheterization (업무 영역 B)를위한 악기, C) 기능업무 영역 C. D에 대한 truments) Tracheal cannulas. 통치자는 악기의 크기를 보여줍니다.
그림 3. 오른쪽 심장 카테 테르. 오른쪽 심장 카테 테르는 마크 및 테이프 (A)로 표시, 또는 손 (B)에 의해 개최. 연필 카테 테르 (A)에 만든 자국을 가리 킵니다. 카테터의 삽입 (CE) : 오른쪽 경정맥 정맥 (C)의 청소, 포셉 개최 봉합 정맥은 카테터는 이전에 정맥 (D)으로 만들어 구멍을 향해 전진하고 있습니다, 카테 테르는 정맥 (E)에 삽입에 따라. 화살표는 카테 테르 (D, E)를 가리 킵니다.
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그림 4. 오른쪽 중심에 압력 변화의 샘플 추적. 흔적은 시간이 지남에 따라 압력 변경 사항 (mmHg) (분 : 초) 표시, 소프트웨어는 두 개의 다른 속도로 커브의 각을 표시합니다. 제어 마우스 (A)의 흔적, 그리고 염증 유도 폐 동맥 리모델링과 고혈압 (B)와 마우스가 표시됩니다. 오른쪽 수축기 심실 압력의 측정에 사용되는 곡선이 강조 표시됩니다. 강조 표시된 곡선의 투명한 압력 고원을 확인합니다. 화살표 기술적 인 오류를 나타내는 스파이크를 가진 곡선을 가리키는. 곡선이 뾰족한 형식은 오른쪽 심실 수축기 압력 측정을 위해 사용할 수 없습니다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .
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그림 5. 갈비와 척추에 상대적으로 tracheobronchial / mediastinal 림프절의 위치. 화살표는 림프절을 가리 킵니다.
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Discussion
여기에 설명 된 실험 흐름은 폐, 심장과 쥐의 면역 시스템에서 응답의 분석에 적합한 심실 수축기 압력과 샘플 수확의 신속하고 동시 측정 할 수 있습니다. 절차는 심장 생리학 측정, 마이크로 해부 및 라이브 세포 연구, 조직 학적 분석, 또는 조직의 omics 분석을위한 후속 조직의 수확이 조화를 이루고 있습니다. 전체 절차는 마우스 당 미만 20 분 정도 소요됩니다. 때문에 업무 영역이 주관하는 워크 플로를, 2-3 동물 동시에 공부를 할 수 있습니다. 따라서 절차는 작은 실험실에서 큰 제약 연구에, 설정의 다양한에서 수행 작고, 대상 실험 12 대형 화면에 적합합니다.
심장 생리학 측정 및 조직 수확의 조합 폐, 생물 네트워크 해당 컨트롤을 검색하거나 심장를 동기화하기위한 분석을 수행 할 수있는 가능성을 열어유전자 변형과 KO 마우스 자원을 활용 차 면역 기능. 동시 절차 흐름의 중요한 장점은 연구에 따라 필요한 동물 수의 감소입니다. 이 절차 워크 플로우의 또 다른 응용 프로그램은 필요에 따라 같은 동물에서 다른 또는 추가적인 장기를 연구 할 수있는 가능성이 있습니다.
여기에 설명 된 절차는 마취 유도의 5-10 분 내에 매우 빠르게 오른쪽 심장 압력 데이터를 생성합니다. 이 사람들이 자발적으로 실내 공기를 호흡하는 동안은 가능한 한 동물을 연구 할 수 있습니다. 접근 방식의 한계가 침략적이라는 것입니다 : 동물 anaesthetized 있으며, 그들은 자신의 뒤를에 배치되며, 카테터가 우심실에 아트리움을 통해 경정맥 정맥을 통해 전달됩니다. 데이터가 오른쪽 심실에서 시간이 지남에 따라 압력 변화를 직접 측정을 나타냅니다 때문에 제한이 절차의 장점입니다. 또한 기술 개선, 특히 홍보를 miniaturizing에 의존essure의 카테터는 쥐 22-24과 다른 큰 동물에서 수행되는 같은 여러 주 시간이 지남에 따라 폐동맥 압력의 직접 기록 할 수 있도록 마우스에 영구적 내주하시는 카테터를 게재 할 수 있습니다. 근접 chested에서 경정맥 정맥을 통해 심장 카테터의 삽입은 저절로 동물을 호흡하는 것은 불가능할 경우, 오른쪽 심실 수축기 압력 변화의 대안 녹음 가슴을 열고 통해 압력 카테터를 삽입하여 통풍이 동물에서하실 수 있습니다 직접 우심실 25에 절개. 오른쪽 심장 기능의 비 침습적 측정 echocardiography를 사용하여 만들 수 있습니다. 이 절차는 마우스 오른쪽 심장 catheterization하기 전에 수행 할 수 있습니다, 또는 쥐들이 사전에 침입 측정 5,14-17로 질병의 진행을 연구하기 위해 여러 번 echocardiography에 의해 검사를 할 수 있습니다.
이 절차의 다른 응용 프로그램 additiona를 얻을 것입니다난 데이터입니다. 예를 들어, 흐름과 압력을 측정 할 수 카테터를 사용하여, 오른쪽 심장 출력이 동시에 오른쪽 심장 압력 변화와 함께 기록 될 수 있습니다. 여기에 설명 된 절차는 더 예를 들어, 유전자 변이 8,10, 담배 연기에 노출 26, 또는 미생물 감염 27-29, 면역 반응이 아닌 다른 폐 고혈압의 트리거하는, physiologic 세포와 분자 변경 사항을 이해하는 데 사용할 수 있습니다 .
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
R01HL082694 (JW), 미국 심장 협회, 설립자 제휴 (0855943D, GG),이 작품은 건강 1R21HL092370-01의 국립 연구소 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG)에 의해 재정 지원되었다 스토니은 고원 - 허버트 기금, 뉴욕 (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
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