Summary
En spesifikk og rask protokoll til samtidig undersøke høyre hjerte-funksjon, lungebetennelse, og immunrespons er beskrevet som et læremiddel. Video og tall beskriver fysiologi og mikrodisseksjon teknikker i en organisert team-tilnærming som er tilpasningsdyktig skal brukes til små til store studier.
Abstract
Funksjonen til høyre hjertet er å pumpe blodet gjennom lungene, og dermed knytte høyre hjerte fysiologi og pulmonal vaskulær fysiologi. Betennelse er en vanlig ombygging av hjerte-og lungefunksjon, ved å utarbeide mobilnettet infiltrasjon, produksjon av cytokiner og vekstfaktorer, og ved å initiere remodeling prosesser 1.
Sammenlignet med venstre hjertekammer, er høyre ventrikkel en lavtrykks pumpe som opererer i en relativt smal sone av trykkforandringer. Økte lungearterien presset er assosiert med økt trykk i lungen vaskulær seng og pulmonal hypertensjon 2. Pulmonal hypertensjon ofte er forbundet med inflammatoriske lungesykdommer, for eksempel kronisk obstruktiv lungesykdom, eller autoimmune sykdommer 3. Fordi pulmonal hypertensjon ensidige dårlig prognose for livskvalitet og levealder, er mye forskning rettet mot å forstå mekanismene som might være mål for farmasøytisk intervensjon 4. Hovedutfordringen for utvikling av effektive styringsverktøy for pulmonal hypertensjon fortsatt kompleksiteten samtidig forståelse av molekylære og cellulære endringer i høyre hjertet, lungene og immunsystemet.
Her presenterer vi en prosessuell arbeidsflyt for rask og presis måling av trykkforandringer i høyre hjertet av mus og samtidig høste av prøver fra hjertet, lungene og immunsystemet vev. Metoden er basert på direkte kateterisering av høyre ventrikkel via halsvenen på nært chested mus, først utviklet på slutten av 1990-tallet som surrogat mål på presset i lungearterien 5-13. Den organiserte team-tilnærming gjør en svært rask høyre hjerte kateterisering teknikk. Dette gjør det mulig å utføre målingene i mus som spontant puster romluft. Organiseringen av arbeidet-flow i forskjellige arbeids-områderreduserer tidsforsinkelse og åpner muligheten for å samtidig utføre fysiologi eksperimenter og høster immune, hjerte-og lunge vev.
Det prosessuelle arbeidsflyt skissert her kan tilpasses et bredt spekter av laboratoriet og studere design, fra små og målrettede eksperimenter, til store narkotika screening-analyser. Den samtidige kjøp av kardiale fysiologi data som kan utvides til å omfatte ekkokardiografi 5,14-17 og høsting av hjerte, lunge og immune vev reduserer antall dyr som trengs for å få data som beveger vitenskapelige kunnskapsgrunnlaget fremover. Det prosessuelle arbeidsflyt som presenteres her gir også et ideelt utgangspunkt for å få kunnskap om nett som knytter immune, lunge-og hjertefunksjonen. De samme prinsipper som er skissert her kan tilpasses å studere andre eller ytterligere organer etter behov.
Protocol
1. Forberedelse
- Forbered følgende løsninger og rør (tabell 1) som følger:
- Hanks løsning, ingen kalsium, magnesium eller indikator med Penicillin (100 U / ml) / streptomycin (100 mg / ml).
- Fosfatbuffret saltvann (PBS), 1x, ingen kalsium, ingen magnesium.
- Etanol, 70%, gjør 500 ml.
- Bufret formaldehyd, 7-10% med PBS, lage 500 ml.
- Anestesi-løsninger:
- Avertin. Tilsett forsiktig 5 ml 2-metyl-2-butanol til 5 g av 2,2,2-Tribromoethanol. Gang oppløst, holde stamoppløsning ved romtemperatur i mørket. Ta 0,25 ml av stamløsningen og fortynn med 10 ml 1xPBS i glassbunn flaske. Pakk flasken med aluminiumsfolie, sted ved 37 ° C inntil oppløsning og deretter alikvot i 5 ml polypropylenrør og holde i kjøleskap. Varm en delmengde om morgenen forsøket.
- Barbiturat. Fortynn stamoppløsning med PBS for å gi 2,6% barbiturat solution. Plasser 3-4 ml alikvoter i polypropylenrør.
- Organisere tre work-områder (figur 1).
- Område A: Ordne følgende elementer: studie skjema for å spille studie identifikasjonsnummer, dato, kroppsvekt, vekter av høyre hjerte, venstre hjerte og septum, presisjon skala (0-50 g til 0,01 g presisjon) for å bestemme kroppsvekt; mikro skala å bestemme heart vekter ved 0,001 g presisjon; veie båter, anestesi løsninger (tydelig merket), små Dewar med flytende nitrogen, isolert beholder med is; rør og 24-brønners plate for å samle blod og vevsprøver (tabell 1); kirurgiske instrumenter ( Tabell 2, figur 2), og for å rengjøre instrumentene (tabell 1).
- Område B: Ordne følgende elementer: disseksjonsmikroskop; rett hjertekateter koblet til et press kontrollenhet som er koblet til en forsterker og en bærbar datamaskin. Kateteret settes inn iet beger som inneholder vann. Ordne kirurgiske instrumenter (tabell 2), biter av sutur kuttet til optimal lengde og plassert inn i en veie båt; tape (autoklav tape er optimalt) kuttes til optimal lengde og bredde og stilt opp på mikroskop eller lab benk for enkel tilgang, bomullspinner og hårfjerningsmiddel løsning. Kalibrer kateteret ved begynnelsen av studien.
- Område C: Ordne følgende elementer: lupe linse, tracheal kanyle, 1 ml sprøyter, sutur snitt til optimal lengde og plassert i en veie båt, liten Dewar med flytende nitrogen, isolert beholder med is, rør og 24-brønners plate å samle BAL og vevsprøver (tabell 1); kirurgiske instrumenter (Tabell 2); løsninger for å utføre BAL og å rense tracheal kanyle og instrumentene (tabell 1).
2. Høyre Hjerte Kateterisering
- Vei mus med en presisjon skala ved forsiktig plassere musen til en veie bhavre. Sørg for å håndtere dyret forsiktig og stille. Ta opp i vekt. Den beskrevne protokoll fungerer best for mus som er 20 g eller mer, fordi diameteren til den halsvenen må imøtekomme trykket kateter, det er mulig å kateterisere mindre mus (17 g eller mer), så lenge venen er stor nok.
- Anaesthetize musen ved injeksjon med Avertin avhengig kroppsvekt (10 ul / g), for eksempel for 20 g gir 200 ul, for 25 g gi 250 pl, for 30 g gir 300 ul. Den eksakte injeksjonsvolum må justeres avhengig musen belastningen. Sørg for å håndtere dyret forsiktig og stille fordi stress kan endre svar på bedøvelse.
- Når musen er bedøvet, sted på dobbel-pleated silkepapir. Legg merke til ID-nummeret på papiret. Forsiktig gni hårfjerning lotion i ventrale aspektet av halsen for å fjerne den kirurgiske feltet. Plasser musen tilbake på papir og vente i 1-2 min.
- Fjerne hår fra ventrale aspektetav halsen ved forsiktig å stryke håret mot hårets vekst med vattpinner.
- Nøye bestemme tilstrekkelig anestesidybden ved å sjekke for fraværet av toe reflex musen ikke reagerer klemming av tærne.
- Arbeider raskt og avslappet, bør resten av høyre hjerte kateterisering ikke ta mer enn 10 min, optimalt 3-6 min. Det er viktig at vevet ikke tørker ut fordi kateteret må gli inn i venen og flytte innsiden av venen på et lag av fuktighet. Fast tidsskjema av prosedyren er viktig for generering av data som er sammenlignbare mellom gruppene.
- Place musen tilbake på silkepapir og overføring med silkepapir på styrofoam bord. Fikse poter og hodet på plass ved hjelp autoklav tape.
- Gjør innsnitt i huden fra mandibles til sternum (bryst-bein).
- Nøye dissekere skjoldbrusk grand oppover mot mandibles å eksponere riktig halsvenen og trachea.
- Place styrofoam bord holder musen under disseksjon mikroskop med fokusplanet allerede på plass og objektivet på ca 0,8 x forstørrelse (total forstørrelse [linse x okularet] er ca 8x.
- Nøye microdissect rett halsvene ved å fjerne omkringliggende bindevev med kirurgiske pinsett.
- Plass to stykker av sutur på toppen av høyre vena jugularis. Knytte sutur nærmest mandibles å stenge blodtilførselen i venen til en liten vedlikeholdslading, plasserer sutur som er nærmest sternum / bryst-bein på en løs knute rundt venen. Man kan bruke liten vedlikeholdslading av blod til senere finne hullet i venen, bør dette bli nødvendig.
- Puste og slappe av (løsne musklene i nakken og kjeven) for å holde øynene på venen gjennom okularet. Dette vil sikre at hendene og fingrene vil flytte sikkert, smidig og avslappet. Hold venen med pinsett i siden nærmestmandibles skjæres et hull i venen mellom de to suturer hjelp av mikro-saks drives av den andre hånden. Sett ned mikro-saks, og holde hånden avslappet, føler for kateteret. Forsiktig hente kateteret holder den mellom tommel og pekefinger (figur 3). Sett kateter inn i hullet av venen.
- Forsiktig avansere kateteret inn i høyre hjerte (Figur 3). Observere merkene på kateteret som gir en omtrentlig oversikt over hvor langt kateteret skal settes og observere skjermen. Når trykket kurver vises, forsiktig stramme nedre sutur rundt kateteret. Fordi Kateteret har strekkfasthet som gir det en spole, og fordi pusting og hjerteslag av musen legge til bevegelse, i tillegg påføre kateteret med tape.
- Record trykkmålinger for 2 min for senere analyse (figur 4).
- Åpne sutur holder kateteret, deretter forsiktig hente Catheter. Tørk den delen bak trykktransduseren, plasserer tilbake i begerglasset med vann. Ikke berør trykkgiver.
- Overfør musen på toppen av silkepapir til område A for eutanasi, samling av blod og milt vev. Rengjør kirurgiske instrumenter.
- Starte prosedyren med neste dyret. Når tidspunktet tillater, injisere bedøvelse mens du venter å registrere trykket kurven (2,15).
3. Innsamling av blod og Spleen Prøver
- Injisere barbiturat løsning, 400 pl per mus og vente i 1-2 min. Dette er rutinemessig utført i vårt laboratorium for å unngå muligheten for at musene utilsiktet gjenopprette fra Avertin-anestesi samtidig som blødde. Hensiktsmessig standardisering av eksperimentet er oppnås ved å injisere det samme dose barbiturat løsning per mus, og ved å vente samme mengde tid før høsting av blod. Hvis tillatt av Institutional Animal Care og bruk komité og så lengesom dyrene overvåkes nøye for anestesidybden før blodtapping, kan dette trinnet utelatt.
- Gjør snitt i buken. Åpne Caudal blodåre (vena cava) og samle blod ved hjelp av en overføringspipetten.
- Fjerne milten, eller et stykke av milten i Eppendorf-rør og snap fryse i flytende nitrogen, eller i 24 brønn plate i en brønn inneholdende Hanks buffer for senere fremstilling av enkeltceller.
- Overfør musen på toppen av silkepapir til arbeid-område C for oppsamling av BAL, tette drenering lymfeknute, lunge og hjerte vev. Rengjør kirurgiske instrumenter.
4. Innsamling av lunge-og hjerte Prøver
- Dissekere luftrøret fri for muskel-og bindevev. Plassere tang under luftrøret, trekk sutur gjennom. Forsiktig generere tilstrekkelig strekning å skjære et hull. Vedlikeholde mild strekk, setter tracheal kanyle med en litt dreiebevegelse, og sutur kanyle på plass.For innsetting av tracheal kanylen, være sikker på at luftrøret er fuktig, eventuelt tilsette en dråpe Hanks løsning. Gjennom hele prosedyren, puste, slappe nakke og kjeve muskler, for å holde håndbevegelser sikker og smidig.
- Dissekere åpne brystkassen ved å forsiktig fjerne brystet-bein fra abdominal slutten. Ikke forstyrr innholdet i thorax fordi dette vil gjøre det svært vanskelig å finne lymfeknute.
- Utfør bronchoalveolar lavage (BAL) ved å forsiktig sette 1 ml Hanks buffer, forsiktig snus sprøyte og hente BAL væske. Gjenta 3 ganger, tett rør og legg på is. Gjennom hele prosedyren, holde øynene på enden av tracheal kanylen som kobles til sprøyten. Blikk til thorax for å observere inflasjon og deflasjon av lungene.
- Innhøsting lunge lymfeknute ved å holde brystkassen veggen med ett sett av tang, finne og hente lymfeknute med en annen tang. Sted lymfeknute i 24 brønners plate. Det er viktig å vite der hvore for å søke i: fra halsen, finne inngangen av brystkassen fra høyre side av musen og ser over ryggraden (figur 5).
- Innhøstingen hjerte og sted på silkepapir. Isolere rett hjertet ved forsiktig dissekere langs septum. Overføring til work-området A til veie, registrere vekt og plass i Eppendorf rør for å knipse fryse i flytende nitrogen.
- Plasser sutur rundt venstre lunge lobe å lukke den viktigste bronkie. Dissekere venstre lunge lobe gratis, plasser i Eppendorf-rør og snap fryse i flytende nitrogen, eller sted i en brønn av en 24 brønns plate inneholdende Hanks løsning for senere isolering av enkle cellesuspensjoner.
- Sett ca. 0,5 ml bufret formaldehyd løsning gjennom tracheal kanylen inn de resterende lungelapper. Etter inflasjon, dissekere lungelapper ut av thorax og fyll i 50 ml tube inneholder formaldehyd løsning. For en alternativ studie design, kan lungene bli fylt med optimal cutting media (OCT, fortynnet 1:4 med PBS) og frosset i en form som inneholder ufortynnet oktober for senere utarbeidelse av frosne seksjoner. En annen studie design kan nødvendiggjøre innhenting snap frossen lungevev og encellede suspensjoner fra lungene. I så fall er det ikke inflasjon nødvendig: dissekere resterende lungelapper; hente dem fra thorax og fyll i den 24 brønns plate i en brønn inneholdende Hanks buffer.
- Fjern tracheal kanyle, rent ved å skylle med Hanks buffer, rengjør kirurgiske instrumenter.
5. Analyse av Pressure Curves generert fra Høyre hjertekateter
De innspilte høyre ventrikkel trykkdata analyseres med LabChart 7-programvare med ingen kunnskap om gruppetilhørighet av hvert opptak. Mer enn 20 kurver velges tilfeldig og forskjellen mellom maksimal og minimal ventrikulær press for hver kurve måles (AP). Gjennomsnittlig AP beregnes å gi den rette ventricular systoliske trykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Primærvariabelen for innhenting høyre hjerte press kurver oppnås ved riktig plassering av høyre hjertet kateteret. Formen av trykktankene tidskurver er kritisk fordi riktig plassering av kateteret innsiden av høyre ventrikkel vil resultere i trykk platåer (figur 4). Spiky kurver, angir i stedet et kateter som er beveget av pust eller hjerteslag bevegelse mot veggen av den høyre ventrikkel. For å oppdage potensielle problemer med fasen av overlevelse av dyrene, må standardavviket AP, og hjertefrekvensen skal beregnes. Begge verdiene forventes å være ikke signifikant forskjellig mellom behandlingsgruppene. Videre er en forventning om at de AP verdier og hjertefrekvens ikke viser en drift over opptakstid. For eksempel vil langsomt øke AP verdier indikerer hypoksisk pulmonal vasokonstriksjon 18-20. Avtagende hjertefrekvens ville indie at nivået av anestesi for høyt fører til død av dyret. I vårt laboratorium forskjellige mennesker utføre prosedyren. På tvers av alle grupper av mus vi rutinemessig oppnå 90-95% suksessrate i å skaffe høyre ventrikkel trykkdata.
Mens læring prosedyren, er det best å starte med eldre hunnmus (25-30 g og mer) som har en større halsvene og har en tendens til å ha mindre subkutan fett innskudd enn hannmus. Den beste måten å fastslå plasseringen av kateteret er å avlive dyret så snart kateteret er festet innsiden av venen. Dissekere dyret fra hjertet til direkte visualisere plasseringen av kateteret. Dette vil i stor grad forenkle problemløsning.
Det første resultatet for innhenting BAL fluid er riktig plassering av tracheal kanylen. Dette indikeres ved inflasjon av lungene når Hanks buffer innpodes og deflasjon av lungene når buffER er fjernet. Forventet utvinning er 70-80% av volumet i innpodet kontrolldyr, mindre (ned til 50%) i dyr som har lungeinflammasjon. Skum på toppen av det gjenvunnede BAL fluid indikerer tilstedeværelse av overflateaktivt middel. Blodsmitte av gjenvunnet BAL fluid oppstår enten på grunn av tilstedeværelsen av betydelige lungeinflammasjon, eller fordi inndrypping og utvinning av vaskefluidum var for fort. Det er verdt å merke at noen akutte tiltak av skader i lungene kan induseres ved den BAL prosedyre. Om den eksperimentelle design er å forstå disse akutte skader parametere og undersøkelse av BAL er også viktig, så en lunge lapp må være bundet av og fjernes før gjennomføring BAL.
I prosedyren vist her, høster vi lungevev for histologi uten standardisert inflasjon og perfusjon av lungene. I tilfeller der eksakt histologisk morfometri er den store lese-out, bør lungene blåses via luftrøret, og perfusion bør utføres via lungearterien, alt under standardisert press.
I protokollen vist er hjertet dissekert å gi Fulton indeksen som mål på høyre hjertehypertrofi (vekt av høyre ventrikkel / vekt av venstre ventrikkel og septum). I tillegg er nye metoder utviklet som er basert på histologisk evaluering av høyre hjerte. Emerging histologiske tiltak av høyre hjerte hypertrofi er a) antall kjerner innenfor et definert område av tilfeldig valgte rett hjerte, og b) teller på fartøy, og fibrotiske indeks per område i hjertet.
I vårt laboratorium, riktig gjenvinning av lunge drenering mediastinale og tracheobronchial lymfeknuter (figur 5) rutinemessig verifisert av flowcytometri fordi disse vev er svært liten i kontroll mus. Imidlertid, avhengig av microbiome i boliger anlegget og alderen av dyrene, størrelsen av lymfeknuter i unchallenged kan kontroll mus være tilstrekkelig stor for bare visuell bekreftelse. Ved kontroll av flowcytometri, lymfeknute cellene trenger for å skilles fra thymocytter. Ved et uhell, kan thymus enkelt samplet sammen med lymfeknute fordi thymus og lymfeknutene er lokalisert nær hverandre, og er inneholdt i brystkassen. Forskjellen er de thymus ligger nær brystet-bein og lymfeknute nær ryggraden. Videre utfordrende er at thymus er veldig stor, og inneholder mange flere celler enn de små lymfeknuter. Thymocytter kan enkelt skilles fra lymfeknute celler ved hjelp flowcytometri og CD3, CD4, og CD8 markører. Lymfeknuter har karakteristisk CD3 + celler, de fleste av disse er enten positive for CD4 eller CD8. I kontrast, de fleste thymocytter er positive for alle tre merkene (CD3 +, CD4 +, CD8 +). Ytterligere detaljert informasjon om lokalisering av mus lymfeknuter kan bli funnet i manuskript avvan den Broeck et al. 21.
Fast tidsskjema for hver viktigste prosessuelle trinn (hjerte kateterisering, gjenvinning av blod og milt, høsting av BAL, lunge og hjerte vev) er kritisk for generering av data som gjør det mulig for robust sammenligning mellom behandlingsgruppene. Derfor anbefales det at minst to, og best tre, forskerne samarbeide å utføre forsøket. Videre er det avgjørende at undersøkerne utfører prosedyren uten kunnskap om gruppeidentitet av dyrene. Derfor, har identifikasjon av data som skal gjøres på en måte som skjuler gruppe identitet. Til slutt er det også viktig at den rekkefølge som dyrene analyseres er randomisert. For eksempel, er en enkel identifikator datoen for forsøket og rad nummerering av dyrene. Hvis det er for eksempel 4 grupper av dyr (AD), tildele identifikasjon og studere dyrene i følgende rekkefølge: date_1: Aa, dato_2: Ba, date_3: Ca, date_4: Da, date_5: Ab, date_6: Bb, date_7: Cb, og så videre.
Dette eksperimentelle flyt gir en grundig, samtidig studie av de molekylære mekanismene som styrer lungebetennelse og høyre hjertefunksjon. De samtidige data og prøvetaking oppnår bedre innsikt i molekylære nettverk, og en reduksjon i antall dyr som trengs for å få romanen biologisk kunnskap.
| Type rør / beger | Løsning (volum) | Utnyttelse | |||
| Behandling av blod | |||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Blod for serum | ||||
| EDTA belagt 2,0 ml | Blod for plasma | ||||
| Eppendorf, 0,5 ml | Frys serum eller plasma | Behandling av BAL | |||
| Polypropylen, rund bunn, 4,5 ml | Samle bronchoalveolar lavage | ||||
| Polypropylen, rund bunn, 4,5 ml | Frys BAL supernatant | ||||
| 96-brønners plate, skirted | BAL celler | ||||
| Behandling av vev | |||||
| Polypropylen, 50 ml | Formaldehyd, 7,5 ml | Fix lungevev | |||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse lunge lobe | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse rett hjertet | ||||
| Eppendorf, 1,5 ml | Snap fryse venstre hjerte | ||||
| 24-brønns plate | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Quick-lagring av lungelapper for senere isolation av enkeltceller | |||
| 24-brønns plate | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Rask lagring av spleens for senere isolering av enkeltceller | |||
| 24-brønns plate | Hanks buffer, 0,5-1 ml | Rask lagring av lymfeknuter for senere isolering av enkeltceller | |||
| For prosedyrene | |||||
| Begerglass, 300 ml | Autoklaverte vann | Fuktighetsgivende og rengjøring kateter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Hanks buffer, 50 ml | Utfør BAL | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Hanks buffer, 50 ml | Vask tracheal kanyle | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Desinfeksjonsmiddel | Rengjøring instrumenter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | 70% etanol | Cleaning instrumenter | |||
| Polypropylenrør, 50 ml | Vann fra springen | Rengjøring instrumenter | |||
Tabell 1. Forberedelse og organisering av rør og løsninger.
| Instrument | Beskrivelse | Bruk |
| Saks | avrundede eller rett 5,5 tommer, rund eller skarpe ender | Område A |
| Saks | rundet 4,0 inches, skarpe ender | |
| Tang | 4,5 tommer, bøyd, med flate, fatte ender | |
| Tang | 4,0-tommers, bøyd, med flate, fatte ender | |
| Saks | Slim Blades/Angled- 9 cm | Område B |
| Mikro-saks | Vannas Spring Scissors - 2 mm Blades | |
| Tang | tang (Dumon # 5 Fin) | |
| Tang | 4,0-tommers, bøyd, med flate, fatte ender | |
| Tang | 4,0-tommers, rett, med flat, fatte ender | |
| Suture | Flettet Silk Sutur 6-0 | |
| Kateter | Pressure kateter | |
| Saks | avrundede eller rett 5,5 tommer, rund eller skarpe ender | Område C |
| Saks | rundet 4,0 inches, skarpe ender | |
| Tang | 4,5 tommer, bøyd, med flate, fatte ender | |
| Tang | 4,0-tommers, bøyd, med flate, fatte ender | |
| Kanyle | Tracheal kanyle | |
| Suture | Flettet Silk Sutur4-0 |
Tabell 2. Organisering av instrumenter, sutur, kateter, tracheal kanyle.
Figur 1. Skjematisk skisse av work-områdene. A) Work-området A for opptak, veiing, innsamling av blod og milt vev og midlertidig holder plass til dyrene. B) Work-område B for høyre hjerte kateterisering. C) Work-område C for innhøsting av BAL, lungene, lunge lymfeknute, og hjerte vev.
.. Figur 2 instrumenter som brukes for prosedyren A) Instrumenter for arbeid-området A, B) instrumenter for høyre hjerte kateterisering (work-område B), c) instruments for arbeid-område C. D) Tracheal kanyler. Linjalen viser størrelsen av instrumentene.
Figur 3. Høyre hjertekateter. Høyre hjertekateter vist med merker og tape (A), eller holdt for hånd (B). Blyanten peker merkene gjort på kateteret (A). Katetret (CE): rensing av høyre halsvene (C); sutureres vene holdes med pinsett, blir kateter blir avansert mot et hull som tidligere er gjort i venen (D); kateter etter innsetting inn i venen (E). Pilene peker til kateteret (D, E).
"/ Files/ftp_upload/50023/50023fig1highres.jpg" />
Figur 4. Eksempel spor av trykkforandringer i den høyre hjerte. Sporene viser trykkforandringer (mmHg) over tid (min: sek), programvaren viser hver av kurvene på to forskjellige hastigheter. De spor av en kontroll mus (A), og en mus med betennelse indusert pulmonal arteriell ombygging og hypertensjon (B) er vist. Kurvene som ble brukt for måling av høyre systolisk ventrikkel trykk er uthevet. Legg merke til den klare trykket platåer i de markerte kurver. Pilen peker på en kurve som har en topp som indikerer en teknisk feil. Disse spiky typer kurver kan ikke brukes til måling av høyre ventrikkel systolisk press. Klikk her for å se større figur .
0023fig5.jpg "alt =" Figur 5 "/>
Figur 5. Plasseringen av en mediastinum / tracheobronchial lymfeknute i forhold til brystkassen og ryggraden. Pilen peker mot lymfeknute.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den eksperimentelle flyt skissert her gir mulighet for rask og samtidig måling av høyre ventrikkel systolisk trykk og høste av prøver for analyse av svarene i lungene, hjertet og immunsystemet hos mus. Prosedyren kombinerer hjerte fysiologi målinger, mikro-disseksjon og påfølgende vev innhøsting for live celle studier, histologisk analyse, eller omics-analyse av vev. Hele prosedyren tar mindre enn 20 minutter per mus. På grunn av arbeid-området organisert arbeidsflyt, kan 2-3 dyr studeres samtidig. Derfor er fremgangsmåten egnet for små, målrettede eksperimenter 12 og storskala skjermer utført i et bredt spekter av innstillinger, fra en liten laboratorium til et stort farmasøytisk studie.
Kombinasjonen av hjerte fysiologi målinger og vev harvest åpner muligheten for å utføre analyse utformet for å detektere biologiske nettverk som kontrollerer eller synkronisere hjerte, lunge and immunforsvar, utnytte transgene og KO mus ressurser. En viktig fordel med den simultane prosedyren flyt er reduksjonen i antall dyr som trengs pr studien. En annen anvendelse av denne prosedyre arbeidsflyten er muligheten å studere andre eller ytterligere organer fra samme dyr som det er nødvendig.
Fremgangsmåten beskrevet her genererer høyre hjerte trykkdata veldig raskt, innen 5-10 min av anestesi induksjon. Dette gjør det mulig å studere dyrene mens de puster romluft spontant. En begrensning med metoden er at det er invasiv: dyrene er bedøvet, er de plassert på ryggen, og et kateter føres via halsvenen gjennom atrium til høyre hjertekammer. Begrensningen er også fordelen av denne prosedyren fordi dataene representerer direkte målinger av trykkforandringer over tid i den høyre ventrikkel. Ytterligere tekniske forbedringer, særlig avhengig av miniaturizing PREssure katetre, kan tillate å plassere permanente, inneliggende katetre hos mus som åpner for direkte opptak av lungearterietrykk over flere uker, som blir utført på rotter 22-24 og andre større dyr. Hvis innføringen av en hjerte-kateter gjennom halsvenen på nært overkropp, spontant pustende dyr ikke er mulig, kan en alternativ registrering av Høyreventrikulært systoletrykk gjøres endringer i ventilerte dyrene ved åpning av thorax og plassere trykket kateteret gjennom en innsnitt direkte til høyre hjertekammer 25. Ikke-invasive målinger av høyre hjerte-funksjonen kan gjøres ved hjelp ekkokardiografi. Denne prosedyren kan utføres før høyre hjerte kateterisering eller mus kan bli undersøkt ved ekkokardiografi for flere ganger å studere sykdomsutvikling før de invasive målinger 5,14-17.
En annen anvendelse av denne prosedyren er å skaffe additional data. Som et eksempel, ved hjelp av et kateter som kan måle strømmer og trykk, kunne høyre hjerte ytelse økes samtidig registreres sammen med høyre hjerte trykkforandringer. Fremgangsmåten beskrevet her kan også brukes for ytterligere å forstå de fysiologiske, cellulær og molekylære forandringer som utløsere av pulmonal hypertensjon enn immunresponsen, for eksempel genetiske mutasjoner 8,10, sigarettrøyk eksponering 26 eller mikrobielle infeksjoner 27-29 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health 1R21HL092370-01 (GG), 1R01 HL095764-01 (GG); R01HL082694 (JW), American Heart Association, Founders affiliate (0855943D, GG); Stony Wold - Herbert Fund, New York (SHP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 2-Methyl-2-butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | |
| 2,2,2-Tribrom–thanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
| disinfectant soap (Coverage Spray TB plus Steris) | Fisher Scientific | 1629-08 | |
| Ethyl Alcohol, 200 Proof, Absolute, Anhydrous ACS/USP Grade | PHARMCO-AAPER | 111000200 | Dilute to 70 % with distilled water |
| Formaldehyde solution | Sigma-Aldrich | F1635-500ML | Dilute to a 7-10 % formaldehyde concentration at a PBS concentration of 1x using PBS stock solution and water |
| Hanks solution, no calcium, magnesium | Fisher Scientific | 21-022-CV | |
| O.C.T | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin (10,000 U/ml) / Streptomycin (10,000 mg/ml) solution | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), no calcium, no magnesium, 1x and 10x solutions | Fisher Scientific | ||
| Sodium pentobarbital 26% | Fort Dodge Animal Health | NDC 0856-0471-01 | |
| Labware | |||
| Plates 12, 24, 96 well | Falcon | ||
| Transfer Pipet | Fisher Scientific | 13-711-9BM | |
| Tube, EDTA coated | Sarstedt | 2013-08 | |
| Tubes 0.65 ml and 1.7 ml micro-centrifuge | VWR | ||
| Tubes 12 x 75 mm polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | |
| Tubes, various sizes, polypropylene | Fisher Scientific | ||
| Instruments | |||
| Forceps, Dumon #5 Fine | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips curved | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Forceps, extra fine graefe -0.5 mm tips straight | Fine Science Tools | 11150-10 | |
| Cannula 18 ga, 19 ga | BD | Precision Glide Needles | Cut to optimal length, blunted and outside rasped to create a rough outside surface. |
| Scissors, Dissector scissors-slim blades 9 cm | Fine Science Tools | 14081-09 | |
| Suture for BAL, braided silk suture, 4-0 | Fine Science Tools | SP116 | |
| Suture for right heart catheterization, braided silk suture, 6-0 | Teleflex medical | 18020-60 | |
| Syringe, 1 ml | BD | 309659 | |
| Equipment | |||
| Amplifier, PowerLab 4/30 | ADInstrument | Model ML866 | |
| Catheter, pressure F1.4 | Millar Instruments, Inc | 840-6719 | |
| Dissecting Microscope | Variscope | ||
| Forceps, Vannas spring scissors-2 mm blades | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Halogen Illuminated Desk Magnifier | Fisher Scientific | 11-990-56 | |
| Laptop computer | Asus | Model number A52F i5 processor; 15 inch | |
| Light Source | Amscope | HL-250-A | |
| Pressure Control Unit | Millar Instruments, Inc | PCU-2000 | |
| Software, Labchart-Pro V.7 | AD Instruments | ||
References
- Price, L. C., et al. Inflammation in pulmonary arterial hypertension. Chest. 141, 210-221 (2012).
- Olschewski, H., et al. Cellular pathophysiology and therapy of pulmonary hypertension. J. Lab. Clin. Med. 138, 367-377 (2001).
- Hassoun, P. M., et al. Inflammation, growth factors, and pulmonary vascular remodeling. J. Am. Coll. Cardiol. 54, S10-S19 (2009).
- Rabinovitch, M. Molecular pathogenesis of pulmonary arterial hypertension. J. Clin. Invest. 118, 2372-2379 (2008).
- Steudel, W., et al. Sustained pulmonary hypertension and right ventricular hypertrophy after chronic hypoxia in mice with congenital deficiency of nitric oxide synthase 3. J. Clin. Invest. 101, 2468-2477 (1998).
- Zaidi, S. H., You, X. M., Ciura, S., Husain, M., Rabinovitch, M. Overexpression of the serine elastase inhibitor elafin protects transgenic mice from hypoxic pulmonary hypertension. Circulation. 105, 516-521 (2002).
- Guignabert, C., et al. Tie2-mediated loss of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma in mice causes PDGF receptor-beta-dependent pulmonary arterial muscularization. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 297, L1082-L1090 (2009).
- West, J., et al. Pulmonary hypertension in transgenic mice expressing a dominant-negative BMPRII gene in smooth muscle. Circ. Res. 94, 1109-1114 (2004).
- Cook, S., et al. Increased eNO and pulmonary iNOS expression in eNOS null mice. Eur. Respir. J. 21, 770-773 (2003).
- West, J., et al. Mice expressing BMPR2R899X transgene in smooth muscle develop pulmonary vascular lesions. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 295, L744-L755 (2008).
- Tu, L., et al. Autocrine fibroblast growth factor-2 signaling contributes to altered endothelial phenotype in pulmonary hypertension. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 45, 311-322 (2011).
- Daley, E., et al. Pulmonary arterial remodeling induced by a Th2 immune response. J. Exp. Med. 205, 361-372 (2008).
- Song, Y., et al. Inflammation, endothelial injury, and persistent pulmonary hypertension in heterozygous BMPR2-mutant mice. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 295, 677-690 (2008).
- Thibault, H. B., et al. Noninvasive assessment of murine pulmonary arterial pressure: validation and application to models of pulmonary hypertension. Circulation. Cardiovascular imaging. 3, 157-163 (2010).
- Otto, C., et al. Pulmonary hypertension and right heart failure in pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide type I receptor-deficient mice. Circulation. 110, 3245-3251 (2004).
- Burton, V. J., et al. Attenuation of leukocyte recruitment via CXCR1/2 inhibition stops the progression of PAH in mice with genetic ablation of endothelial BMPR-II. Blood. 118, 4750-4758 (2011).
- Fujita, M., et al. Pulmonary hypertension in TNF-alpha-overexpressing mice is associated with decreased VEGF gene expression. J. Appl. Physiol. 93, 2162-2170 (2002).
- Motley, H. L., Cournand, A., Werko, L., Himmelstein, A., Dresdale, D. The Influence of Short Periods of Induced Acute Anoxia Upon Pulmonary Artery Pressures in Man. Am. J. Physiol. 150, 315-320 (1947).
- Liljestrand, G. Regulation of Pulmonary Arterial Blood Pressure. Arch. Intern. Med. 81, 162-172 (1948).
- Euler, U. S. V., Liljestrand, G. Observations on the pulmonary arterial blood pressure in the cat. Acta Physiol. Scand. 12, 301-320 (1946).
- Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice. Journal of immunological. 312, 12-19 (2006).
- Rabinovitch, M., et al. Angiotensin II prevents hypoxic pulmonary hypertension and vascular changes in rat. Am. J. Physiol. 254, 500-508 (1988).
- Rabinovitch, M., Gamble, W., Nadas, A. S., Miettinen, O. S., Reid, L. Rat pulmonary circulation after chronic hypoxia: hemodynamic and structural features. Am. J. Physiol. 236, 818-827 (1979).
- Rabinovitch, M., et al. Changes in pulmonary blood flow affect vascular response to chronic hypoxia in rats. Circ. Res. 52, 432-441 (1983).
- Kugathasan, L., et al. The angiopietin-1-Tie2 pathway prevents rather than promotes pulmonary arterial hypertension in transgenic mice. J. Exp. Med. 206, 2221-2234 (2009).
- Bearer, C., Emerson, R. K., ORiordan, M. A., Roitman, E., Shackleton, C. Maternal tobacco smoke exposure and persistent pulmonary hypertension of the newborn. Environ. Health Persp. , 105-202 (1997).
- Graham, B. B., et al. Schistosomiasis-induced experimental pulmonary hypertension: role of interleukin-13 signaling. Am. J. Pathol. 177, 1549-1561 (2010).
- Butrous, G., Ghofrani, H. A., Grimminger, F. Pulmonary vascular disease in the developing world. Circulation. 118, 1758-1766 (2008).
- Crosby, A., et al. Praziquantel reverses pulmonary hypertension and vascular remodeling in murine schistosomiasis. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 184, 467-473 (2011).
