Summary
Los tatuajes es un medio potente y seguro para la administración de ADN vacuna por vía intradérmica. Aquí, un ADN plásmido que codifica EGFP se entrega por el tatuaje en la piel de un ratón de laboratorio, y la expresión de EGFP en las células de la piel es entonces inspeccionado por microscopía confocal.
Abstract
Basadas en ácidos nucleicos vacunación es un tema de creciente interés, especialmente de ADN plásmido (pDNA) que codifican antígenos inmunológicamente importantes. Después de la ingeniería de pDNA se administra a las vacunas, que se transcribe y se traduce en proteínas inmunógenos que pueden provocar respuestas del sistema inmune. Existen muchas formas de aplicar vacunas de ADN han sido investigadas, sin embargo, cada vía de administración tiene sus propias ventajas y dificultades. Los tatuajes es una técnica novedosa que es seguro, rentable y conveniente. Además, las perforaciones causadas por la aguja podría también servir como un potente adyuvante. Aquí, a) demostrar la administración intradérmica de ADN de plásmido que codifica la proteína verde fluorescente mejorada (EGFP-PCX) en un modelo de ratón utilizando un dispositivo de tatuaje y b) confirmar la expresión eficaz de EGFP en las células de la piel utilizando microscopía confocal.
Protocol
1. Purificación de ADN plásmido
- Transformar el plásmido de ADN eucariótico que codifica la EGFP (PCX-EGFP) en células de E. coli DH5a competentes. El vector vacío PCX también puede ser utilizado como un control negativo.
- Cultura y cosechar las células DH5a de E. coli y se purifica el pDNA de acuerdo con el Manual de Qiagen EndoFree purificación de plásmidos.
- Filtrar pDNA solución a través de un 0,22 m PVDF filtro estéril, y almacenar a -20 ° C hasta su uso.
2. Preparación del sistema Tattoo
- Conectar la unidad de mano y el pedal de control a la unidad de fuente de alimentación de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
- Ajuste la frecuencia de oscilación de la aguja a aproximadamente 100 Hz. Para el dispositivo de tatuajes que elegimos (Sistema de Sigilo Rotary Tattoo), el dial de la fuente de alimentación debe ajustarse a 4 voltios. Consulte los manuales de usuario o soporte técnico para los sistemas de otros tatuajes.
- Esterilizar el ar agujaray antes de su uso. Le recomendamos que utilice un conjunto de aguja por animal. Las agujas pueden ser reutilizados después de ser limpiada con agua y jabón y autoclave.
- Instale el conjunto de aguja en la unidad de mano y Monte la empuñadura de plástico.
- Ajustar la profundidad de la aguja en un valor adecuado moviendo el mango de plástico hacia arriba o hacia abajo. Se utilizó una aguja profundidad de aproximadamente 0,5 mm para nuestro experimento ratón.
- Apriete el mango de plástico cuando la profundidad de la aguja está en posición correcta, y el tatuaje sistema está listo para su uso.
3. Animal Afeitado
- Elija el sitio para el tratamiento de tatuajes. El sitio debe ser un área relativamente firme y plana, y carnosa de la piel, por ejemplo, el lado de la pata trasera del animal.
- Anestesiar a un ratón BALB / c con una mezcla de ketamina (90 mg / kg) y xilazina (5 mg / kg) de acuerdo con el peso corporal del animal. Para otros animales, se refieren a las directrices de anestesia de su institución.
- Compruebe elanimales de reflejos pellizcando su pie para confirmar que el animal es anestesiado adecuadamente.
- Utilice la podadora eléctrica para recortar el pelo de las patas traseras del animal lentamente y con cuidado. Eliminar el pelo del sitio de tatuaje planificada y el área circundante.
- Eliminar el vello residual más corta con la maquinilla de afeitar desechable. Tenga cuidado de no cortar la piel del animal. Tenga en cuenta que la crema depilatoria se puede utilizar como una alternativa de depilación método, sin embargo, preferimos afeitado sobre la crema depilatoria.
- Quitar pelos sueltos de corte de la piel con aire comprimido, si es necesario.
4. La administración de ADN de plásmido por el tatuaje
- Si un protocolo de inmunización se ha establecido anteriormente, la dosis y el volumen de solución de ADN a ser aplicado debe ser calculado en consecuencia. Se recomienda utilizar un volumen tan pequeño como sea posible para hacer que el proceso de tatuaje más manejable. En esta demostración EGFP, se utilizó 7,5 l de solución de ADN en una estafaconcentración de 0,25 mg / ml, que se aplica sobre un área de tatuaje de aproximadamente 1 cm 2. Para los experimentos de inmunización, el aumento de las concentraciones de pDNA puede ser necesaria para inducir una fuerte respuesta inmune 1,2.
- Aplicar la solución de ADN pipeteando directamente en el sitio de tatuaje. Alternativamente, se carga la disolución de ADN en la empuñadura de plástico al vaso, de modo que el líquido se suspende entre la aguja y la punta del mango de plástico. Consulte el video de una demostración. Hemos observado ninguna diferencia notable entre los dos métodos. Sin embargo, la carga de la solución en la empuñadura de plástico puede ser ventajoso en superficies verticales piel, por ejemplo.
- Comenzar la oscilación aguja y coloque la agrupación de agujas con una ligera presión sobre la piel del animal en el sitio de tatuaje. A continuación, mover la aguja oscilante suave y lentamente de forma lineal para administrar ADN plasmídico sobre el área de tatuaje entero. Mantenga un ángulo de 90 grados entre la aguja y la piel para evitarlaceraciones en la piel.
- Observar la piel. La abrasión y la inflamación son normales. Si el sangrado ocurre, detenga el proceso de tatuaje y reducir la profundidad de la aguja.
- Continuar el movimiento de la aguja de aproximadamente 1 min, y luego se detiene el proceso de tatuaje.
- Con un algodón limpio para aplicar una capa delgada de analgesia tópica en el sitio de tatuaje. Analgésicos tópicos como la crema de sulfadiazina de plata (SSD Cream) o ungüento Neosporin puede ayudar a aliviar el dolor o la angustia de los animales, y por lo tanto se recomienda su aplicación antes de la anestesia. Observar a los animales al día siguiente en busca de signos de dolor o angustia (cambio de marcha, inactividad). Vuelva a aplicar la crema analgésica si los signos persisten.
5. Confirmación de la expresión del antígeno
- 48 h después del tratamiento de tatuajes (tenga en cuenta que diferentes construcciones de pDNA pueden requerir tiempos de expresión diferentes), el ratón se sacrificaron mediante narcosis CO 2. Por otroanimales, se refieren a las directrices de eutanasia de su institución.
- Diseccionar la piel en el sitio de tatuajes, y fijar el tejido en paraformaldehído al 4% a 4 º C durante la noche.
- Enjuague el tejido con un 70% de etanol, y la transfiere en 1X PBS para obtener imágenes.
- Examinar todo el tejido usando un microscopio confocal para detectar señales de EGFP. Alternativamente, el tejido de la piel puede ser incrustado en cera de parafina y se examinó en las secciones en un microscopio fluorescente.
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Representative Results
La expresión de EGFP con un pico de excitación a 488 nm y un pico de emisión a 509 nm puede ser observado en las células de piel de ratón. A partir de una dosis de 1,875 mg de ADN, que contiene aproximadamente 3 × 10 17 copias del plásmido, se observa típicamente 10-20 señales de EGFP en los 1 cm 2 zona tatuada. Este número relativamente bajo de células transfectadas es consistente con los resultados de un estudio anterior 3. La expresión de EGFP (Figura 1) proporciona la evidencia de que el plásmido EGFP fue entregado en células de la piel del animal utilizando la técnica del ADN tatuaje.
Figura 1. EGFP expresión en las células de la piel 48 horas después del tratamiento de un tatuaje en la pata trasera de un ratón BALB / c vistos con un microscopio confocal. A) Una proyección de señales de EGFP desde múltiples planos focales. B) EGFP expresión en un cantarLe celular.
Solución de problemas
1. No se detecta la expresión del antígeno (por ejemplo, no hay señales de EGFP de control positivo).
- Aumentar la concentración de la solución de ADN plasmídico por 2 - a 5-fold. Se recomienda una concentración inicial de 0,2 mg / ml. Concentraciones tan altas como 5 mg / ml se ha informado de ADN tatuaje experimentos 3.
- Evitar graves daños en la piel, como la piel de ratón en el sitio de tatuaje se puede cortar fácilmente por las maquinillas de afeitar y agujas.
- Asegúrese de que la construcción de ADN es apropiado para su experimento.
- Realizar la electroforesis en gel para asegurarse de que la mayoría del ADN del plásmido se encuentra en forma circular superenrollado o cerrada.
2. Hemorragias o el daño a la piel se produce en el sitio de tatuaje.
- Disminuir la profundidad de la aguja.
- Mantenga un ángulo de 90 grados entre la matriz de aguja y la piel.
- Disminución de la fuerza aplicada durante latatuaje tratamiento.
- Disminuir la velocidad del movimiento de tatuaje.
3. La señal de fondo es demasiado alto cuando la imagen EGFP.
- Utilice una maquinilla de afeitar de seguridad nuevo desechable para eliminar el vello tanto como sea posible antes de tatuaje. A veces es necesario afeitar de nuevo antes de la disección.
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Discussion
Vacunación de ADN se considera más seguro que las estrategias de vacunación tradicionales, ya que no requiere la manipulación de, o exponer las vacunas a, patógenos vivos o atenuados 4. Sin embargo, el resultado de la vacunación de ADN depende en gran medida de la ruta de entrega. La piel es abundante en las células presentadoras de antígeno, tales como células de Langerhans y células dendríticas 1, y por lo tanto un sitio ideal para la inmunización en términos de inmunogenicidad y la facilidad de acceso de 5,6. Como resultado, la estrategia de vacunación intradérmica es una de las opciones más populares para las vacunas de ADN. Como se muestra en este vídeo, ADN tatuaje es una manera simple pero prometedor para administrar una vacuna de ADN por vía intradérmica. Interesantemente, las respuestas inflamatorias provocadas por el proceso de tatuaje podría servir también como un adyuvante natural 1,2 y potente. Se ha informado de que el tatuaje ADN puede provocar un aumento de hasta 100 veces en respuestas de células T en monos, en comparación con las respuestas de células T en los animales immunized por vía intramuscular 7,8. En comparación con otros métodos de administración dérmicas, tales como la pistola de genes, el tatuaje ADN tiene varias ventajas. En primer lugar, el tatuaje ADN no requieren un equipo costoso y los portadores, es decir, partículas de oro. Esto sería una gran ventaja en términos de distribución de la vacuna, especialmente para los países en desarrollo. En segundo lugar, se sabe que el aire de alta presión puede causar daños pDNA debido a la fuerza de corte, lo que podría disminuir el nivel de expresión del antígeno. Un estudio ha demostrado que los daños de ADN de tatuaje menos de 3% del total pDNA 9. Por último, el tatuaje de ADN puede cubrir un área grande de la piel, lo que podría provocar una respuesta inmune más fuerte. El tatuaje dispositivos también pueden ser utilizados para entregar el péptido / proteína de las vacunas, y se han demostrado para inducir respuestas inmunitarias tanto humorales como mediadas por células-10. Ahora usamos la piel tatuajes de forma rutinaria en nuestros experimentos con animales en un primer ADN en proteínas impulso de vacunación de protocolo (tres primos de ADN seguidopor dos proteínas aumenta durante un período de 16 semanas), y hemos logrado inducida en ratones fuertes respuestas inmunes contra el VIH-1 gp120.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a todos los miembros del Laboratorio Kong y el Dr. Yan Deng en Microscopy Core, Oficina de Ciencia Colaborativa, NYUMC por su asistencia y apoyo técnico. Este trabajo fue apoyado por una subvención piloto de la New York University Center for AIDS Research (CFAR, NIH subvención AI027742).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pCX-EGFP plasmid DNA | Clontech | ||
| STEALTH Rotary Tattoo System | Worldwide Tattoo Supply | STEALTH-L | |
| Tattoo needles | Worldwide Tattoo Supply | 1207RSB | |
| EndoFree Plasmid Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| 0.22 μm PVDF sterile filter | Millipore | SLGV013SL | |
| electrical hair trimmer | Commercially available | ||
| disposable safety razors | Commercially available | ||
| Silver Sulfadiazine Cream | Watson | NDC 0591-0810-55 | |
| Ketamine HCL | NDC 0856-2012-01 | ||
| Zylazine Sterile Solution | NADA 139-236 |
References
- Bins, A. D. A rapid and potent DNA vaccination strategy defined by in vivo monitoring of antigen expression. Nat Med. 11, 899-904 (2005).
- Pokorna, D., Rubio, I., Muller, M. DNA-vaccination via tattooing induces stronger humoral and cellular immune responses than intramuscular delivery supported by molecular adjuvants. Genet. Vaccines Ther. 6, 4 (2008).
- van den Berg, J. H. Optimization of intradermal vaccination by DNA tattooing in human skin. Hum. Gene Ther. 20, 181-189 (2009).
- Liu, M. A.
- Koide, Y., Nagata, T., Yoshida, A., Uchijima, M.
- Peachman, K. K., Rao, M., Alving, C. R. Immunization with DNA through the skin. Methods. 31, 232-242 (2003).
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- Pokorna, D. Vaccination with human papillomavirus type 16-derived peptides using a tattoo device. Vaccine. 27, 3519-3529 (2009).
