Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer's

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Cilia-gegenereerde vloeistofstroom in Blaasjes Kupffer's (KV) regelt links-rechts patroonvorming van de zebravis embryo. We beschrijven een techniek voor het moduleren genfunctie specifiek in KV cellen. Verder tonen we hoe fluorescerende kralen leveren in KV om vloeistofstroming visualiseren.

Abstract

Interne organen zoals het hart, hersenen, darm en ontwikkelen links-rechts (LR) asymmetrie die essentieel zijn voor hun normale functie 1. Beweeglijke cilia zijn betrokken bij het ​​vaststellen van LR asymmetrie in gewervelde embryo's, met inbegrip van de muis, kikker, en zebravis 2-6. Deze 'LR' cilia genereren asymmetrische vloeistofstroom die nodig is om een geconserveerde asymmetrische Nodal (TGF-β superfamilie) signaalcascade in de linker laterale plaat mesoderm, waarvan men denkt dat LR patronen informatie voor ontwikkelende organen 7 activeren. Dus begrijpen mechanismen LR patroon, is het essentieel om genen te identificeren die de organisatie van LR gecilieerde cellen, de motiliteit en de lengte van LR cilia en hun vermogen om robuuste asymmetrische stromen genereren reguleren.

In de zebravisembryo zijn LR cilia in vesicle Kupffer's (KV) 2,4,5. KV bestaat uit een enkele laag van epitheelcellen monociliateddat een met vloeistof gevulde lumen omsluiten. Fate mapping is gebleken dat KV is afgeleid van een groep van ~ 20-30 cellen bekend als dorsale voorloper cellen (DFC) die migreren op de dorsale blastoderm marge in epiboly fasen 8,9. Tijdens de vroege stadia somiet, om DFC's cluster en differentiëren tot trilharen epitheelcellen vormen KV in de tailbud van het embryo 10,11. De mogelijkheid om te identificeren en te volgen DFC-in combinatie met optische transparantie en de snelle ontwikkeling van de zebravis embryo-maken zebravis KV een uitstekend modelsysteem om LR trilharen cellen te bestuderen.

Interessant, voorvaderen van de DFC / KV cellijn te behouden cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel tot 4 uur na de bevruchting (HPF), terwijl cytoplasmatische bruggen tussen de dooier cel en andere embryonale cellen dicht na 2 hpf 8. Maken van deze cytoplasmatische bruggen hebben we een stadium-specifieke injectie strategie morfolino oligonucle leverenotides (MO) uitsluitend DFC en knockdown de functie van een gerichte gen in deze cellen 12. Deze techniek zorgt voor chimerisch embryo's in welk gen functie wordt naar beneden geklopt in de DFC / KV afkomst ontwikkelen in het kader van een wild-type embryo. Om asymmetrische stroming analyseren KV, we injecteren fluorescerende microbolletjes in de KV lumen en opnemen kraal beweging met behulp van videomicroscopie 2. Fluïdumstroom gemakkelijk gevisualiseerd en kan worden gekwantificeerd door het volgen bead verplaatsing in de tijd.

Hier, met het stadium-specifieke DFC-targetgen knockdown techniek en injectie van fluorescerende microbolletjes in KV stromen visualiseren we een protocol dat een effectieve benadering van de rol van een bepaald gen te karakteriseren tijdens KV ontwikkeling en functie biedt.

Protocol

Overzicht van Stage-specifieke zebravisembryo Injecties

Antisense oligonucleotiden morfolino (MO), die binden aan een doelwit-mRNA en eiwitexpressie verstoren van die transcript, worden veel gebruikt in gen knockdown (loss-of-function) studies in zebravis 13,14. Gene Tools, LLC biedt MO's die zijn voorzien van tag met ofwel carboxyfluoresceïne (zendt groene fluorescentie) of lissamine (zendt rode fluorescentie) om MO te detecteren in geïnjecteerde embryo's met behulp van fluorescentie microscopie. Door het injecteren MO in de dooier cel in verschillende stadia van ontwikkeling van de zebravis, is het mogelijk om de MO leveren aan specifieke compartimenten van de embryo (figuren 1A-F). MO geïnjecteerd in de dooier tussen de 1-4 cel stadium (0-1 HPF) voert alle embryonale cellen (figuren 1A, D, D ') via verbindingen met de dooier die blijven bestaan ​​tot aan de 32-cellig stadium 15 tot wereldwijde knockdown te vergemakkelijken. MO geïnjecteerd in de dooier tijdens midblastula stadia (2.5-3 HPF) kunt u de voorouders van de DFC (Figuren 1B, E, E ') waarschijnlijk door cytoplasmatische bruggen 8 en knockdown genfunctie specifiek in de DFC / KV cellijn 12, zonder het invoeren van de meeste andere embryonale cellijnen . Als belangrijke gebruiken om te testen of genfunctie noodzakelijk is DFC / KV of ook in dooier 12,16 is het ook mogelijk om MO beperken tot de dooier cel door het injecteren van de koepel-30% epiboly fasen (~ 4,5 hpf) na alle cytoplasmatische bruggen gesloten (figuren 1C, F, F '). Deze injecties werden gebruikt in combinatie met genfunctie analyse in DFC / KV cellen 17-24. Om vloeistofstroom in KV beoordelen, zijn fluorescerende microbolletjes geïnjecteerd in de KV lumen tussen het 6-10 somiet stadia (12-14 HPF) en daarna meteen afgebeeld met behulp van videomicroscopie (Figuren 1G-J). Microkorrels zijn die emitteren rode of groene fluorescentie (of beide), dus is het mogelijk om verschillendekanalen om de afbeelding fluorescerende microbolletjes en MO.

1. Stadiumspecifieke Injectie van morfolino (MO)

Injectie van MO in zebravis embryo's eerder 25,26 aangetoond. Hier beschrijven we kort stadium-specifieke MO injecties. Na alle injecties worden embryo's overgebracht naar een petrischaal en geïncubeerd bij 28,5 ° C.

  1. Global MO injectie: Verzamel embryo's onmiddellijk na de bevruchting en ze in een injectie plaat te laden. Laad fluorescerende MO in een capillaire naald en bevestig de naald op een microinjector (bijvoorbeeld Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector). Breek de naaldpunt en pas injectie instellingen (druk-en / of tijd) om een injectie druppel die een volume van 1 nl zoals beschreven 25,26 te creëren. Met behulp van een dissectie stereomicroscoop, injecteren 1 nl van MO in de dooier (Figuur 1A) van ≥ 50 embryo's per experiment. Werk snel om injecties te voltooien door de 4-cels herte.
  2. DFC-gerichte MO injectie: Verzamel embryo's onmiddellijk na de bevruchting en incuberen bij 28,5 ° C. Wanneer de embryo's hebben de 256-cellig stadium (~ 2.5 HPF) bereikt, snel laden ze in een injectie plaat en vervolgens 1 nl van TL-MO injecteren in de dooier van ≥ 100 embryo's tussen de 256-cel en 1.000-cel stadia (figuur 1B).
  3. Dooier-gerichte MO injectie: Verzamel embryo's onmiddellijk na de bevruchting en incubeer bij 28,5 ° C. Op dome stadium (~ 4 HPF) en laadt de embryo's in een injectie plaat en injecteer 1 nl van fluorescerende MO in de dooier van ≥ 100 embryo tussen de koepel en 30% epiboly fasen (Figuur 1C).

2. Selecteren van geïnjecteerde embryo's voor Analyse

  1. Wanneer MO geïnjecteerde embryo's bij de 75%-epiboly stadium (8 HPF), verwijder onbevruchte en dode embryo's en vervolgens het scherm levende embryo's onder een tl-dissectiemicroscoop voor de distributie van de fluorescerende MO. Dan allow geselecteerd embryo te ontwikkelen op 28,5 ° C.
    1. Voor wereldwijde MO injecties, selecteert embryo die gelijkmatig verdeeld fluorescentie in alle embryonale cellen (figuur 1D, Figuur 2A).
    2. Voor DFC doelgericht MO injecties, selecteert embryo's die fluorescent MO heeft verspreid in de dooier en geconcentreerd verschijnt aan de dorsale blastoderm marge (DFC) (Figuur 1E; Figuur 2B). In dit stadium kan het moeilijk zijn om fluorescerende DFC door heldere fluorescentie in de onderliggende dooier visualiseren. Zorg ervoor dat embryo's waarbij de fluorescerende MO is opgenomen in embryonale cellen anders dan DFC's of blijft geaggregeerd op de injectieplaats (figuur 2D) uit te sluiten.
    3. Voor dooier doelgericht MO injecties, selecteert embryo waarin MO fluorescentie gelijkmatig verdeeld over de dooier en niet waargenomen in embryonale cellen (Figuur 1F; Figuur 2C). Nogmaals, verwijder embryo's waarbij de fluorescerende MO blijftgeaggregeerd op de injectieplaats.
  2. Tussen de 2-4-somiet stadia (~ 11 HPF), scherm embryo's een tweede keer onder een fluorescentiemicroscoop met een sterkere vergroting. Dan kunnen geselecteerde embryo's te ontwikkelen op 28,5 ° C.
    1. Voor wereldwijde MO injecties, ervoor gekozen embryo's MO fluorescentie gelijkmatig verdeeld in KV en alle embryonale cellen (figuur 1D; figuur 2E).
    2. Voor DFC-gerichte MO injecties, zorgvuldige selectie van embryo's die MO fluorescentie alleen in KV cellen en de dooier (figuur 1E ') hebben. Transgene embryo express GFP in KV cellen, zoals Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, kan helpen bij de identificatie van embryo's waarin MO succesvol afgeleverd aan KV cellen (figuur 2F). Gooi embryo's met MO fluorescentie in embryonale cellen andere dat KV cellen.
    3. Voor dooier-gerichte MO injecties, selecteert embryo's die MO fluorescentie hebben uitsluitend in de dooier (Figuur 1F ': Afbeelding2G).

3. Montage Embryo's te Fluid Flow Analyze in KV

  1. Om asymmetrische stroming analyseren KV van de wereldwijde MO, DFC-gerichte MO of dooier-gerichte MO geïnjecteerde embryo's, zorgvuldig dechorionate ~ 20 embryo's tussen 4-6 somiet stadia (~ 11 tot 12 HPF) met scherpe tang.
  2. Bereid 50 ml van 1% laag smeltpunt agarose en aliquot in 5 ml buizen worden gehouden als een vloeistof in een droge bad bij 42 ° C.
  3. Overdracht een embryo aan een glas depressie dia (United Scientific Supplies, Inc) en verwijder zo veel van het water mogelijk te maken. Immobiliseren de embryo door toevoegen van voldoende warm 1% laag-smeltpunt agarose juist bedekt de embryo (teveel agarose kan interfereren met verdere imaging). Zoals de agarose stolt, een tang om het embryo zodanig te positioneren dat KV naar boven (dorsaal aanzicht) (figuur 1H). Monteer 10 embryo's met een embryo per dia. Werken snel zodat alle injecties in de volgende stap zijn completed door de 10 somiet fase (14 hpf).

4. Injectie van TL Microbeads in KV

  1. Verdun Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micron diameter Microspheres (Polysciences, Inc) om 1:50 in steriel water in een 1,5 ml Eppendorf buis.
  2. Meng de 1:50 verdunning van microbolletjes door te tikken op de buis en plaats 3 ui in een capillaire naald. Met dezelfde microinjector voor MO injecties (bijv. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injector), breken de naaldpunt met een tang en pas de injectie instellingen om de kleinst mogelijke (<0,5 nl) injectie drop te bepalen.
  3. Onder een dissectiemicroscoop, lijnt u de naald met de KV lumen van de eerste gemonteerde embryo. Steek de naald in de lumen en injecteer een klein volume (<0,5 nl) kralen (figuur 1G). Een kleine naald en kleine injectievolume zijn van cruciaal belang om schade aan KV voorkomen.
  4. Injecteer alle gemonteerde embryo's. Zodra een embryo is injected een druppel steriel water kan worden toegevoegd bovenop de agarose te uitdroogt. Tijdens de injecties zullen de korrels blokkeren, de naald opening. Dit vereist de naald opnieuw breken en het aanpassen van de injectie volume door het moduleren van de druk of tijdinstelling van de micro-injectie apparaat. Vervang de naald als het bot wordt genoeg om aanzienlijke schade tijdens de injectie veroorzaken.
  5. Het scherm van de geïnjecteerde embryo's voor succesvolle oplevering van kralen in een rechtopstaande tl samengestelde microscoop (bv. Zeiss AxioImager M1) met een 20X objectief. Bepaal eerst of KV structuur is intact met helderveld verlichting (Figuur 1J), en gebruik vervolgens de fluorescentie om de kralen te observeren. Selecteer embryo's waarin kralen aanwezig zijn en bewegen in de KV lumen. Gooi embryo's met KV schade of geen zwevende kralen in KV. Het is gemakkelijk om KV missen en kralen leveren nabijgelegen weefsel of de onderliggende dooier. Lukt dit niet, mount anopoort aansluiten op 10 embryo's en herhaal de injectie procedure.

5. Visualisatie en analyse van KV Fluid Flow

  1. Voor elke geselecteerde embryo met kralen in KV, voeg een druppel steriel water om de agarose te dekken en vervolgens KV observeren onder de rechtopstaande tl samengestelde microscoop met een 63X water dompelen doelstelling (figuur 1I). Als alternatief kan een dekglaasje worden toegepast voor gebruik met niet-water dompelen doelstellingen en / of omgekeerde microscoop.
  2. Een high-speed camera geplaatst op de microscoop (Zeiss bijv. AxioCamHSm) een 10 sec film opneemt. Noteer zowel de kralen met de fluorescerende kanaal (ongeveer 70 frames / sec) en KV lumen met een helderveld of differentiële interferentie contrast (DIC) kanaal.
  3. Als u alle kraal bewegingen te visualiseren na verloop van tijd, importeert u de film van fluorescerende kralen in ImageJ software (gratis te downloaden op http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) eennd een maximum projectie van fluorescente signalen in de film. Om de maximale projectie in ImageJ uit te voeren, klikt u op "Afbeelding → Stapels → Z project." In de "Z-project" venster, projecteren alle segmenten met projectie type "Max intensiteit". Dit beeld kan worden gesuperponeerd op een afbeelding van de DIC KV waarin de korrels werden afgebeeld (Figuren 3A-B).
  4. De bewegingen van de afzonderlijke kralen kunnen worden bijgehouden met ImageJ. Een plugin ("Handmatige sporing") kan worden gedownload op http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Open de fluorescerende kralen film in ImageJ en voer de handmatige Tracking functie. In het venster van de Handmatige sporing, check "show parameters" en input parameters voor "tijdsintervallen" en "x / y kalibratie". Selecteer handmatig kralen die blijven in het brandvlak van de film voor ≥ 50 frames en dan volgen ≥ 5 kralen per embryo. Het pad en de snelheid van elke korrel wordt gegenereerd door the software (figuren 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stadiumspecifieke MO injecties geven een nuttige benadering voor genfunctie analyse in specifieke compartimenten van de embryo. Figuur 1 toont een stroomschema van de injectie strategieën om genfunctie testen DFC / KV cellen en hoe fluorescerende kralen introduceren fluïdumstroming visualiseren in KV. De verdeling van fluorescentie in MO succesvolle stadium-specifieke geïnjecteerde embryo's is schematisch weergegeven in de figuren 1D-F en levende embryo's in Figuur 2. Een niet MO injectie, waarbij de MO blijft geaggregeerd in de dooier cel wordt getoond in figuur 2D.

Succesvol geïnjecteerde embryo's geselecteerd op basis van de lokalisatie van fluorescentie-MO kunnen worden gemonteerd op de 4-6 somiet fase voor afgifte van fluorescerende microbolletjes in de KV lumen (figuren 1G-H) om de fluïdumstroming analyseren. Videomicroscopie wordt gebruikt om kraal bewegingen in KV (Figuren 1I-J), op te nemen die kan kwalitatief worden geanalyseerd (Figuren 3A-B) of kwantitatief (Figuren 3C-E) met ImageJ software. In een controle embryo met normale doorstroming, volg kralen tegen paden die kan worden gevisualiseerd door een maximum projectie van fluorescerende kralen posities tijd (Figuur 3A) of door het volgen van afzonderlijke kralen tijd (Figuur 3C). Om verlies van gecoördineerde stroom aan te tonen, hebben we geïnjecteerd embryo's met MO om knockdown Rho kinase 2b (Rock2b), die we eerder hebben laten zien verstoort stroom 18. In Rock2b MO geïnjecteerde embryo, kralen willekeurig bewegen in KV (figuren 3B, D). ImageJ software werd gebruikt om de snelheid van individuele kraal tracks berekenen. De gemiddelde snelheid van 5 kralen controle en Rock2b MO embryo wordt getoond in figuur 3E.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Figuur 1. Overzicht van stadium-specifieke MO injecties en microbead injectie in KV. (A) Injectie van fluorescerende MO (rood) in de dooier op de 1-cel stadium voor wereldwijde distributie van MO gehele embryo. (B) DFC-gericht MO injectie op de 512-cel stadium MO laden in DFC / KV cellen. (C) Yolk-gericht MO injectie bij 30%-epiboly stadium MO beperken tot de dooier. (DF) Schematische weergave van de verdeling van fluorescerende MO (rood) succesvol geïnjecteerd embryo's in het stadium 75% epiboly (D, E, F) en de 6 somiet fase (D ', E', F ') volgende fase- specifieke injecties. MO accumuleert in de DFC / KV cellijn bij injectie van 512-cel stadium (pijlen in E, E), maar niet bij injectie epiboly 30% (pijlen in F, F '). (G) Injectie van TL-microkorrels (groen) in de KV lumen. (H) Een propErly gemonteerd embryo met KV (pijl) naar boven voor microbead injectie. (I) Imaging kralen beweging in KV met behulp van een rechtopstaande microscoop. (J) High vergroting van een intact KV lumen geïnjecteerd met microbolletjes. Embryonale stadia en embryo tekeningen zijn gebaseerd op ref. 28.

Figuur 2
Figuur 2. Selectie van embryo na stadium-specifieke MO injecties. (AC) Voorbeelden van geselecteerde embryo's in het stadium epiboly 75% (8 hpf) waarin fluorescent MO (rood) ofwel is opgenomen in alle embryonale cellen na injectie global MO (A), verspreid door het eigeel en DFC (pijl) na DFC gerichte MO injectie (B) of is gebleven na de dooier dooier gerichte MO injectie (C). (D) Voorbeeld van een uitgesloten embryo waarin de fluorescent MO geaggregeerd op de injectieplaats. (EG) Voorbeelden van fluorescerende MO (rood) de distributie in geselecteerde embryo's in het 4-somiet stage (11,5 hpf). DIC beelden identificeren van de KV lumen (pijl) in transgene Tg (Dusp6: d2EGFP) embryo's die uitdrukkelijke GFP in KV cellen 27. In de mondiale MO geïnjecteerde embryo, werd MO waargenomen in KV en alle omliggende cellen (E). In de DFC gerichte MO geïnjecteerde embryo, MO samen gelocaliseerd in de meeste GFP KV cellen en was aanwezig in de onderliggende dooier kernen (F). In de dooier gerichte embryo werd MO uitsluitend in dooier kernen (G).

Figuur 3
Figuur 3. Kwalitatieve en kwantitatieve analyses van fluïdumstroming in KV. (AB) Voor kwalitatieve analyse van de stroming, een maximale projectie van een 10 seconden film met beweging van alle fluorescent microbeads geïnjecteerd KV is gesuperponeerd op een beeld van het DIC KV lumen in een globale controle MO (A) of Rock2b MO (B) ingespoten embryo. (CE) te stromen, beweging van individuele microbeads (n = 5) werd gevolgd in een controle embryo (C) en Rock2b MO geïnjecteerd embryo (D) en gebruikt om een gemiddelde snelheid bead (E) uitrekenen. Circles (CD) bij benadering de KV lumen grenzen. Foutbalken (E) vormen een standaarddeviatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Met behulp van fase-specifieke injecties om MO te richten op de DFC / KV cellijn is een bruikbare benadering van de cel-autonomie van gen-functie te bestuderen en te voorkomen dat pleiotrope fenotypes veroorzaakt door de opwarming gen knockdown. Toch kunnen deze injecties zijn technisch uitdagend. Injectie van MO tussen de 256-cel en 1.000 cellen fasen kan resulteren in drie mogelijkheden: 1) de MO blijft geaggregeerd op de injectieplaats, 2) de MO diffundeert in de dooier en gaat DFC / KV cellen of 3) de MO diffundeert in de dooier en gaat DFC / KV cellen en andere embryonale cellen. Daarom selecteren van embryo's waarbij MO uitsluitend is verhuisd naar de DFC / KV-cellen is een belangrijke stap in dit experiment. Het is belangrijk op te merken dat MO kan laden in alle DFC / KV-cellen, maar vaak komt slechts een deel van deze cellen 10. De oorzaken van deze mozaïek gericht blijven onduidelijk, maar kan variabiliteit in hoe efficiënt de MO beweegt zich door de dooier en / of het tijdstip van sluiting van ind weerspiegelenividual bruggen tussen de dooier en DFC voorouders. We hebben niet gevonden voorwaarden die verhoging targeting-efficiëntie, maar hebben vertrouwd op het selecteren van embryo's waarin de meeste van de KV-cellen hebben opgenomen MO. Het succes voor het genereren embryo's met MO in de meeste DFC / KV cellen typisch ~ 20-30%, maar dit kan heel variabel van dag tot dag. Daarom raden injecteren zoveel mogelijk embryo (≥ 100) en zorgvuldig de embryo de juiste verdeling van fluorescerende morfolino hebben.

Controle-experimenten zijn van vitaal belang voor de interpretatie van de resultaten van DFC-gerichte injecties. Een mismatch MO of standaard negatieve controle MO (van Gene Tools, LLC) moet worden gebruikt om te controleren voor niet-specifieke effecten. Bovendien, omdat DFC gerichte injecties leveren MO zowel de dooier en DFC / KV cellijn (figuur 2F), is het belangrijk om te bepalen of fenotypes in deze embryo's door verlies van gen funActies in DFC / KV cellen of in de dooier cel. Vergelijken van fenotypen in DFC-gerichte embryo's met dooier-gerichte embryo's (figuren 2F-G) zal identificeren DFC / KV cel-specifieke beïnvloedt. Natuurlijk kunnen sommige genen functioneren in zowel de DFC / KV cellen en de dooier 16. Hoewel we richten van MO-gemedieerde loss-of-function analyses hier kan de DFC gerichte injectietechniek en geassocieerde controle-experimenten worden gebruikt om een ​​gain-of-function beoordelen door het injecteren synthetische mRNA een bepaalde proteïne in de DFC / KV overexpressie lineage 17,22,24,29. Een slimme aanpassing van deze aanpak gebruikt DFC-doelwit-mRNA injecties aan de mondiale MO knockdown te redden alleen in DFC / KV cellen 30. Er moet echter worden opgemerkt dat niet alle mRNA geïnjecteerd op deze wijze tot expressie van het gecodeerde eiwit in DFC en KV cellen en belangrijke controles moeten worden genomen op het niveau van eiwitexpressie en distributie beoordelen.

Succesvolle levering van microbeads in het lumen KV asymmetrische stromen beoordelen afhankelijk van het injecteren van de korrels bij optimale stadia tijdens de snelle ontwikkeling van de voorbijgaande KV orgaan. We beginnen montage embryo's in de 4-6 somiet fase (~ 12 HPF) en injecteer in microbeads KV tot de 10 somiet fase (14 hpf). Vóór de 4 somiet fase het lumen is vaak te klein te injecteren, en in latere stadia (> 10 somieten) het injecteren moeilijk door KV bewegen dieper in de embryo. Een beperking van deze techniek is dat vereist KV lumen te breiden tot een grootte die goed worden geïnjecteerd met microbolletjes. Wanneer MO knockdown van een bepaald gen ernstig verstoort KV organisatie en / of vermindert KV lumen grootte (beoordeeld in ref. 31) het moeilijk, zo niet onmogelijk, om stroom assay met deze benadering.

Bij de voorbereiding voor injectie van embryo microbeads in KV, is het belangrijk om de embryo monteren recht langs de embryonale as KV naar boven (figuur 1H), Kunnen van invloed zijn als embryo de positie van de hoek die de naald KV en de hoek van de beeldvorming kralen in KV komt. Het is ook belangrijk om een ​​klein kaliber injectienaald en klein injectievolume van microbeads gebruiken om schadelijke KV voorkomen. Wij raden het oefenen om een ​​soepele injectie slag om de naald in KV ontwikkelen, laat de kralen en dan snel de naald terug te trekken uit het embryo. Wanneer de omstandigheden optimaal zijn, zijn we in staat om met succes microbolletjes te leveren aan ~ 50% (bijvoorbeeld n = 5/10) van de geïnjecteerde embryo's.

Samengevat stadium-specifieke MO injecties en visualisatie van microbeads in KV een gelegenheid om de functie van kandidaatgenen in LR gecilieerde cellen te bestuderen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgments

Wij danken Fiona Foley voor uitstekende lab ondersteuning en zebravis zorg. Dit werk werd ondersteund een AHA predoctorale beurs GW (11PRE5730027) en NHLBI subsidies aan HJY (R01HL66292) en JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Developmental Biology Genetica Cellular Biology Neuroscience Moleculaire Biologie Bio-ingenieur Biofysica Cilia zebravis, Gene Knockdown Technieken links-rechts asymmetrie trilharen Kupffer's Blaasjes diermodel
Analyse van gen-functie en visualisatie van Cilia-gegenereerde Fluid Flow in Blaasjes Kupffer&#39;s
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter