Summary
クッパー胞の繊毛で生成された流体の流れ（KV）はゼブラフィッシュ胚の左右パターン形成を制御します。ここでは、KVの細胞に特異的に遺伝子の機能を調節するための手法について説明します。また、流体の流れを可視化するためにKVに蛍光ビーズを提供する方法を示しています。
Abstract
例えば、心臓、脳、腸などの内臓が正常な機能にとって重要である1左右（LR）非対称性を開発しています。運動性繊毛はLRの確立に関与しているマウス、カエル、ゼブラフィッシュ2月6日を含む、脊椎動物の胚の非対称性。これらの'のLR繊毛は'器官7を開発するためのLRパターニング情報を提供すると考えられている左側側板中胚葉、内カスケードのシグナル伝達に保存された非対称節点（TGF-βスーパーファミリー）をトリガすることが必要である非対称の流体の流れを生成します。このように、LRのパターニングのメカニズムを理解するためには、それはLR繊毛細胞の組織、LRの繊毛の運動性と長さと堅牢な非対称フローを生成する能力を制御する遺伝子を同定することが不可欠である。
ゼブラフィッシュ胚に、LR繊毛でクッパー胞（KV）2,4,5に配置されています。 KVはmonociliated上皮細胞の単層で構成されていますそれは液体で満たされた腔を囲みます。運命のマッピングはKVが被包ステージ8,9の間に背の胚盤葉縁に移行背先駆細胞（DFCが）として知られている〜20から30細胞群に由来することが示されている。初期の体節の段階では、DFCは、クラスタと繊毛上皮細胞への分化は、胚10,11の尾芽にKVを形成する。ゼブラフィッシュの光学的透明性と迅速な開発とDFCはインの組み合わせを特定して追跡する能力ゼブラKV LR繊毛細胞を研究するための優れたモデル系胚作る。
興味深いことに、DFC / KV細胞系列の前駆細胞は卵黄細胞と2 HPF 8後の近い他の胚細胞の間に細胞質の橋のに対し、最大4時間、受精後（HPF）に卵黄細胞の間に細胞質の橋を保持します。これらの細胞質の橋を生かし、我々は、モルホリノoligonucleを提供するためにステージ固有の注射戦略を策定DFCは、ノックダウン、これらのセル12における標的遺伝子の機能にもっぱらotides（MO）。この手法は、遺伝子の機能が野生型胚の文脈で発展DFC / KV系統でノックダウンさせたキメラ胚を作成します。 KVにおける不斉の流体の流れを分析するために、我々は、KVルーメンとビデオ顕微鏡2を使用してレコードビーズ運動に蛍光マイクロビーズを注入します。流体の流れを簡単に可視化され、時間をかけてビーズの変位を追跡することにより定量することができる。
ここでは、ステージ固有のDFC-標的遺伝子ノックダウン技術と流れを可視化するためのKVへの蛍光ビーズの注入を使用して、我々は、KVの発達と機能の間の特定の遺伝子の役割を特徴付けるための効果的なアプローチを提供するプロトコルを提案する。
Protocol
ステージ固有のゼブラフィッシュ胚注射の概要
標的mRNAに結合し、その転写物からのタンパク質発現を破壊アンチセンスモルフォリノオリゴヌクレオチド（MO）は、広く研究がゼブラフィッシュ13,14で（機能喪失型）遺伝子のノックダウンで使用されています。遺伝子ツールは、LLCは、蛍光顕微鏡を用いて注入胚でMOを検出するためにカルボキシフルオレセイン（緑色の蛍光を発する）またはリサミン（赤色蛍光を発する）のいずれかでタグ付けされたMOを提供しています。ゼブラフィッシュの開発のさまざまな段階で卵黄セルにMOを注入することによって、それは、胚の特定の区画（ 図1A-F）にMOを提供するのは可能です。 1から4細胞の段階（0-1 HPF）との間で卵黄に注入されたMOは、グローバルなノックダウンを容易にするために、32細胞期15日まで存続する卵黄との接続を介してすべての胚細胞（ 図1A、D、D '）に入ります。 MOはmidblast中に卵黄に注入ULAステージは（2.5から3 HPF）他のほとんどの胚細胞系譜を入力せずに、DFC / KV細胞系統12に特異的に細胞質の橋8およびノックダウン遺伝子機能を通じてそうDFCの前駆細胞（ 図1B、E、E '）を入力することができます。卵黄12,16でも遺伝子の機能がDFC / KVで必要かどうかをテストしたりするための重要な制御として、それは後にドーム30パーセント被包段（約4.5 HPF）の間に注入することによって、卵黄細胞にMOを制限することもできますすべての細胞質の橋が（ 図1C、F、F '）を閉鎖した。これらの注射はDFC / KV細胞17から24における遺伝子機能を解析するために組み合わせて使用されている。 KV内の流体の流れを評価するために、蛍光マイクロビーズは6から10体節のステージの間にKVの内腔に注入され（12-14 HPF）、その後すぐにビデオ顕微鏡（ 図1G-J）を用いて画像化。ビーズは赤または緑色蛍光（あるいはその両方）を放出が利用可能であるので、それは別のを使用することが可能である画像蛍光マイクロビーズおよびMOへのチャネル。
1。モルフォのステージ固有のインジェクション（MO）
ゼブラフィッシュ胚にMOの注入は、以前25,26実証されている。ここでは、簡単にステージ固有のMO注入を説明します。すべての注射後、胚をシャーレに移し、28.5℃でインキュベートした。
- グローバルMO注入：直ちに受精後の胚を採取し、注入プレートにロードします。キャピラリー針に蛍光MOを読み込み、マイクロインジェクター（ 例えばハーバード装置PLI-90ピコインジェクタ）に針をマウントします。針の先端を破って25,26に記載されているように 1 nlの体積を有する射出ドロップを作成するために注入設定（圧力および/ または時間）を調整します。解剖顕微鏡を使って、卵黄にMOの1 nlを注入する（ 図1A）実験あたり≥50胚の。 4セルクワガタで注射を完了するには、迅速に作業電子。
- DFC-標的のMO注入：28.5にて直ちに受精後の胚を採取し、インキュベート℃に胚は256細胞期（約2.5 HPF）に達したときに、迅速に注入プレートにそれらをロードします（ 図 256セル、1,000細胞ステージ間≥100胚の卵黄中に蛍光MOの1 nlを注入する1B）。
- 卵黄ターゲティングMO注入：28.5で受精直後、インキュベートした後に胚を収集℃にドームステージ（〜4 HPF）で、注入プレートに胚をロードしてから、ドームと30％の被包段（ 図1C）の間≥100胚の卵黄に蛍光MOの1 NLを注入します。
2。分析のために注入胚を選択する
- MOは胚（8 HPF）は75％で被包段階に達する注入すると、蛍光MOの配布のための蛍光解剖顕微鏡下で受精卵と死亡胚を削除してから、画面生きた胚。その後、アロwは28.5で開発するために胚を選択℃を
- グローバルMOの注射については、蛍光均等にすべての胚細胞（;図2A図1D）全体に分布している胚を選択します。
- DFC-標的ミズーリ注射用、蛍光MOは卵黄に拡散しており、背胞胚マージン（DFCが）（;図2B図1E）に集中して現れる胚を選択します。この段階では、それは、基本的な卵黄で明るい蛍光による蛍光DFCを可視化することが困難な場合があります。蛍光ミズーリにDFC以外の胚細胞に取り込まれたまま、または注射部位（ 図2D）で集計していた胚を除外するように注意してください。
- 卵黄をターゲットとしたMOの注射については、ミズーリ蛍光が均一に卵黄全体に分布し、任意の胚細胞（;図2C図1F）で観察されていない胚を選択します。繰り返しになりますが、蛍光MOが残存する胚を取り除く注射部位に集約されます。
- 2-4-体節ステージ（〜11 HPF）、画面の胚より高い倍率を用いた蛍光顕微鏡下で二回目の間に。次に、選択した胚は28.5で開発することができ℃、
- グローバルMOの注射の場合は、選択した胚は、MO蛍光が均等にKVとすべての胚細胞（;図2E図1D '）で配布があることを確認します。
- DFC-標的ミズーリ注射については、慎重にのみKV細胞と卵黄（ 図1E '）でMOの蛍光を有する胚を選択します。そのようなTG（Dusp6：d2EGFP）などのKV細胞でGFPを発現するトランスジェニック胚27は 、ミズーリが正常KV細胞（ 図2F）に配信された胚の識別に役立ちます。 KVの細胞は他の胚細胞のMO蛍光を持つ胚を廃棄します。
- 図：卵黄をターゲットとした、MO注入については、卵黄（ 図1F 'で排他的にミズーリ蛍光を有する胚を選択する2G）。
3。 KV内の流体の流れを分析するために取り付けた胚
- グローバルMOのKVで非対称流体の流れを分析するには、MOまたは卵黄ターゲティングMO注入胚をDFCはターゲティング、慎重dechorionate〜鋭いピンセットで4から6体節段階（〜11月12日HPF）との間に20胚。
- 42℃で乾燥したお風呂で液体として維持するための5 mlチューブ℃に1％低融点アガロースとアリコート50mlを準備
- ガラスうつ病スライド（米国科学用品株式会社）への転送1つの胚と多くの水の可能な限り除去する。ただ（あまりアガロースがその後の画像に干渉することができます）胚をカバーするのに十分な暖かい1％低融点アガロースを追加することで、胚を固定。アガロースが固まるように、そのようなそのKVは（ 図1H）（背側）を向いている胚を配置するためにピンセットを使用しています。スライドごとに1つの胚で10胚をマウントします。次のステップで、すべての注射はCOMPLであることを確認するために迅速に働く10体節期（14 HPF）によりeted。
4。 KVに蛍光マイクロビーズの注射
- 1.5mlのエッペンドルフチューブに滅菌水で1:50にMultifuorescent 0.5ミクロン径の微小球を（ポリサイエンス社）Fluoresbrite希釈します。
- チューブをタップして、徹底的にマイクロビーズの1:50希釈液を混合し、キャピラリーニードルに3μlをロードします。ミズーリ注射（ 例えばハーバード装置PLI-90ピコインジェクタ）に使用されるのと同じマイクロインジェクターを使用して、ピンセットで針の先端を破って、可能な限り小さい（<0.5 NL）注射降下を生成するために注射の設定を調整します。
- 解剖顕微鏡下では、最初にマウント胚のKVのルーメンと針の位置を合わせます。内腔に針を挿入し、ビーズの少量（<0.5 NL）（ 図1G）を注入。小さな針の先端と小さな注入量は、有害KVを避けるために重要です。
- マウントされているすべての胚を注入します。胚はinjecteされたらdは、滅菌水の滴が乾燥からそれを防ぐためにアガロースの上に追加することができます。注射の過程で、ビーズはしばしば針の開口部をふさがれます。これは、針の先端を再分割することと、マイクロインジェクション装置の調節圧力または時間設定によって注入量を調整する必要があります。それは注射中に重大な損傷を引き起こすのに十分な鈍になった場合に、針を交換してください。
- 画面直立蛍光化合物顕微鏡（ 例えばツァイスAxioImager M1）の下にビーズの正常な配信のために注入された胚は、20X対物レンズを使用。まず、KVの構造が明視野照明を（ 図1J）を使用して、無傷であるかどうかを判断し、次にビーズを観察する蛍光を使用します。ビーズが存在し、KVのルーメン内を移動させた胚を選択します。 KVの損傷やKVでないフローティングビーズと共に胚を破棄します。それはKVを逃すと周辺組織または基礎卵黄にビーズを送達するために簡単です。失敗した場合、マウントあの熱10胚および注入手順を繰り返します。
5。 KVの流体の流れの可視化と分析
- KVの内側にビーズと、選択した各胚については、アガロースをカバーし、その後63X水浸対物レンズ（ 図1I）を使用して、直立蛍光化合物の顕微鏡下でKVを観察するために滅菌水の滴を追加します。あるいは、カバースリップは非水浸漬の目的および/または倒立顕微鏡で使用するために適用することができます。
- 10秒の動画を撮影するために（ 例えばツァイスAxioCamHSm）顕微鏡に搭載されたハイスピードカメラを使用しています。明または微分干渉コントラスト（DIC）チャネルを用いた蛍光チャネル（約70フレーム/秒）とKVの内腔を用いてビーズの両方を記録します。
- 時間をかけてすべてのビーズの動きを可視化するために、ImageJのソフトウェア（無償でダウンロード中に蛍光ビーズのムービーを読み込むhttp://rsb.info.nih.gov/ij/ ）ndはムービー内のすべての蛍光シグナルの最大投影を作成します。 ImageJの中で最大の投影を実行するには、クリックして "イメージ→スタック→Zプロジェクトを。" "Zプロジェクト"ウィンドウで、 "最大輝度"の投影タイプを持つすべてのスライスを投影。この画像は、ビーズが撮像されたKV（ 図3A-B）のDIC像に重ね合わせることができます。
- 個々のビーズの動きはImageJを使用して追跡することができます。プラグイン（ "マニュアルトラッキング"）でダウンロードすることができますhttp://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html 。 ImageJの中に蛍光ビーズムービーを開き、マニュアルトラッキング機能を実行します。マニュアルトラッキングのウィンドウで、 "時間間隔"と "x / yのキャリブレーション"の "ショーパラメータ"と入力パラメータを確認してください。手動≥50フレームの映画の焦点面に残っているビーズを選択してから、胚あたり≥5ビーズを追跡します。各ビーズのパスと速度は目によって生成されeソフトウェア（ 図3 CD）。
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Representative Results
ステージ固有のMO注入胚の特定区画における遺伝子機能を解析する上で有効なアプローチを提供します。 図1は、DFC / KV細胞における遺伝子機能をテストするために、流体の流れを可視化する蛍光ビーズを導入する方法使用済みの注射戦略のフローチャートを提示KVインチ成功した段階特異注入胚の蛍光MOの分布は、 図1D-Fに、 図2でライブ胚における模式的に示されている。ミズーリままで卵黄細胞に集約されている失敗したMO注入は、 図2Dに示されています。
成功裏に注入された蛍光の局在に基づく胚が選ばれ、MO-ができる流体の流れを分析するためにKVの内腔への蛍光ビーズを送達するための4から6体節の段階（ 図1G-H）でマウントすることができます。ビデオ顕微鏡はKVのビーズの動きを（ 図1I-J）は、記録するために使用され質的に分析した（ 図3A-B）または定量（ 図3C-E）は 、ImageJのソフトウェアを使用することができます。通常の流れと制御の胚では、ビーズは、時間の経過とともに蛍光ビーズの位置の最大値投影（ 図3A）を作ることによって、または時間（ 図3C）の上に個々のビーズを追跡することにより、可視化することができ、反時計回りの経路をたどる。協調の流れの損失を実証するために、我々は我々が以前に流れを乱す18が示されているノックダウンRhoキナーゼ2B（Rock2b）に付MO胚を注入した。 Rock2b MO注入された胚では、ビーズは、KV（ 図3B、D）にランダムに移動。 ImageJのソフトウェアは個々のビーズのトラックの速度を計算するために使用された。コントロールとRock2bミズーリ胚から5ビーズの平均速度は、 図3Eに示す。
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図1。 KVにステージ固有ミズーリ注射やマイクロビーズインジェクションの概要。胚全体MOの世界的な分布のために、1セルの段階で黄身に蛍光ミズーリ（赤）（A）の注射。 （B）を512細胞段階におけるDFC-標的のMO注入DFC / KV細胞にMOをロードする。 （C）が30％被包段階で卵黄をターゲットとした、MO注入は卵黄にMOを制限する。 （DF '）75％被包段（D、E、F）と6体節期に正常に注入胚の蛍光ミズーリ（赤）の分布の模式図（D'、E '、F'）次のステージ特定の注射。 '（Fの矢印、F）は被包30％で注入されたときではないが、512細胞期（E、Eの矢印）'に注入されたとき、MOはDFC / KV細胞系列に蓄積されます。 KVの内腔への蛍光マイクロビーズ（G）を注入（緑）。 （H）プロプerly KV（矢印）はマイクロビーズ注入のために上向きにして胚を装着。正立顕微鏡を用いたKV（I）におけるイメージングビーズの動き。マイクロビーズを注入した無傷のKVの内腔の（J）は高倍率。胚形成期および胚の図面は、refに基づいています。 28。
図2。ステージ固有のMO注射後の胚の選択。蛍光MO（赤）のいずれかのDFC以下卵黄およびDFC（矢印）を介して拡散し、グローバルのMO注入（）に続いてすべての胚細胞に組み込まれているで75％被包ステージ（8 HPF）で選択された胚の交流（AC）の例ターゲットとしたMO注入（B）または卵黄をターゲットとした、MO注入（c）以下の卵黄に残りました。 （D）におけるフッ除外胚の例rescent MOは注射部位に集約されます。 4体節期（11.5 HPF）で選択された胚の蛍光ミズーリ（赤）ディストリビューション（例）例。 27 KVの細胞内でGFPを発現することを胚：DIC画像は、トランスジェニックTG（d2EGFP Dusp6）のKVルーメン（矢印）を識別します。グローバルMO注入された胚では、MOはKVとその周りの細胞（E）で観察された。 DFC-MO注入された胚をターゲットに、MO最もKVの細胞でGFPと共局在し、また、卵黄核（F）を根底に存在していた。卵黄をターゲットとした胚では、MOは卵黄核（G）に独占的に発見された。
図3。 KV内の流体の流れの定性·定量分析。 （AB）の流れの定性分析、すべてfluorescの10秒ムービーを示す運動の最大投影についてKVに注入ENT MicroBeadsは、グローバル制御（MO）でKV腔またはRock2b MO（B）を注入された胚のDIC像に重畳されています。 （CE）（n = 5）をコントロール胚（C）とRock2b MO注入胚（D）で追跡され、平均粒子速度（E）を計算するために使用された個々のマイクロビーズの流れ、動きを定量化する。サークル（CD）のおおよそのKVの内腔の境界。エラーバー（E）は、1標準偏差を表す。
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Discussion
DFC / KV細胞系譜にMOをターゲットにステージ固有の注射を使用すると、遺伝子機能の細胞自律性を検討し、全体的な遺伝子ノックダウンによって引き起こされる多面的な表現型を回避するための有用なアプローチである。しかし、これらの注射は技術的に挑戦することができます。 1）MOは卵黄全体2）MOの拡散、注射部位で集計ままおよびDFC / KVセルまたは3に入る）MO：256セル、1,000細胞ステージ間のMOの注入は、3つの可能な結果をもたらすことができ卵黄を通して拡散およびDFC / KV細胞および他の胚細胞に入る。したがって、MOはDFC / KV細胞に排他的に移動した胚を選択すると、この実験の重要なステップです。それは、MOはすべてのDFC / KV細胞にロードできることに注意することは重要ですが、多くの場合、これらのセル10のサブセットのみを入力します。ターゲティングこのモザイクの根底にある理由は不明のままですが、卵黄および/またはINDの閉鎖の時期を通じて、いかに効率的にMOの動きの変動を反映しているかもしれない卵黄およびDFC前駆細胞の間ividual橋。我々は、条件を発見していないその増加は効率をターゲットではなく、KV細胞のほとんどはMOを取り上げている胚を選択することに頼ってきた。 DFC / KV細胞の大部分でMOと胚を生成するための成功率は20〜30％を一般的に〜ですが、これは日々非常に可変にすることができます。このような理由から、私たちは可能な限り多くの胚（≥100）のように注入した後、慎重に蛍光モルホリノの適切な分布を持つ胚を選択することをお勧めします。
対照実験は、DFCをターゲットとした注射の結果を解釈するために不可欠です。ミスマッチMOや標準陰性コントロールMOは（ジーン·ツールから、LLC）の非特異的効果を制御するために使用されるべきである。 DFCをターゲットとした注射は卵黄およびDFC / KV細胞系譜（ 図2F）の両方にMOを届けるので、加えて、それはこれらの胚の表現型は、遺伝子の楽しみの喪失に起因しているかどうかを判断することが重要であるDFC / KV細胞や卵黄細胞内でction。卵黄をターゲットとした胚（ 図2F-G）と、DFC標的胚の表現型を比較すると、DFC / KV細胞特異的に影響を識別します。もちろん、いくつかの遺伝子はDFC / KV細胞や卵黄16の両方に機能することができる。我々がここでミズーリ媒介機能喪失分析の焦点が、DFC-標的注入法および関連する制御実験はDFC / KVの中の特定のタンパク質を過剰発現するように合成したmRNAを注入することにより、機能獲得性を評価するために使用することができます系統17,22,24,29。このアプローチの一つの巧妙な適応だけDFC / KVセル30のグローバルMOのノックダウンを救うために、DFC標的mRNAの注射を使用していました。しかし、DFCのとKV細胞、および重要なコントロールでエンコードされたタンパク質の発現は、この方法の結果に注入されないすべてのmRNAがタンパク質の発現と分布のレベルを評価するために含まれるべきであることに留意すべきである。
マイクロビーズの正常な配信非対称の流れを評価するためにKVの内腔へのsは一時的なKVの臓器の急速な発展中の最適な段階でビーズを注入することに依存します。我々は4-6体節段階（〜12 HPF）で固定胚を開始してから最大10体節期（14 HPF）にKVにマイクロビーズを注入します。前に4体節期に、内腔がしばしば注入するには小さすぎる、と後期段階（> 10体節）で注入が原因でKVが胚に深く移動することが困難になる。この技術の1つの制限は、KVの内腔が正常MicroBeadsで注入することができる大きさに拡大する必要があるということです。例ではどこに特定の遺伝子のMOノックダウンは厳しくKVの組織を破壊する、そして/または、それがこのアプローチを使用してアッセイの流れに、難しい、不可能ではないでしょう（refに見直しました。31）KVの内腔のサイズを減らすことができます。
KVにマイクロビーズを注入するための胚を準備するとき、それはまっすぐKVは（ 図1Hを上向きにして胚軸に沿って胚をマウントすることが重要である）、胚の位置と針はKVとKVの撮像ビーズの角度を入力した角度に影響を与えることができる。 KV損傷を避けるために、小口径の注射針とビーズの小注入量を使用することも重要である。我々は、KVに針を挿入するためにスムーズな射出ストロークを開発するための練習をお勧めしますビーズを解放した後、速やかに胚から針を引っ込める。条件が最適である場合、我々は正常に注入された胚の約50％（ 例えば、n = 5月10日）にビーズをお届けすることができます。
要約すると、ステージ固有のMO注射やKVにおけるマイクロビーズの可視化は、LR繊毛細胞における候補遺伝子の機能を研究する機会を提供します。
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Disclosures
特別な利害関係は宣言されません。
Acknowledgments
私たちは、優れた研究室のサポートやゼブラフィッシュのケアのためのフィオナ·フォーリーに感謝します。この作品は、GWにAHAの博士号を取得する前のフェローシップ（11PRE5730027）とHJY（R01HL66292）と防衛庁（R01HL095690）へNHLBIの助成金をサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Standard Control oligo-Lissamine tagged | Gene Tools, LLC | ||
| Custom Rock2b morpholino oligo | Gene Tools, LLC | ||
| Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres | Polysciences, Inc. | 24054 |
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