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Biology

El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Los cilios generada por el flujo de líquido en la vesícula Kupffer (KV) controla de izquierda a derecha del patrón del embrión de pez cebra. Aquí se describe una técnica para modular la función de genes específicamente en células KV. Además, se muestra cómo entregar perlas fluorescentes en KV para visualizar el flujo de fluido.

Abstract

Los órganos internos como el corazón, el cerebro y el intestino desarrollar izquierda-derecha (LR) las asimetrías que son críticos para sus funciones normales 1. Cilios Motile están involucrados en el establecimiento de LR asimetría en embriones de vertebrados, incluyendo ratón, rana, pez cebra y 2-6. Estos 'cilios LR, generar un flujo de fluido asimétrico, que es necesario para desencadenar una conservadas nodal asimétrica (TGF-β superfamilia) cascada de señalización en el mesodermo de la placa lateral izquierda, que se cree que proporcionan información LR patrones para el desarrollo de órganos 7. Por lo tanto, para entender los mecanismos subyacentes a los patrones LR, es esencial para identificar los genes que regulan la organización de las células ciliadas LR, la motilidad y la longitud de los cilios LR y su capacidad para generar el flujo asimétrico robusto.

En el embrión de pez cebra, LR cilios se encuentran en la vesícula Kupffer (KV) 2,4,5. KV se compone de una sola capa de células epiteliales monociliatedque encierran un lumen lleno de líquido. Mapeo de destino ha demostrado que KV se deriva de un grupo de ~ 20-30 células conocidas como células precursoras dorsales (CFD) que migran en el margen blastodermo dorsal durante las etapas epibolia 8,9. Durante las etapas tempranas somite, cluster CFD y se diferencian en células epiteliales ciliadas para formar KV en la tailbud del embrión 10,11. La capacidad de identificar y rastrear las CFD-en combinación con la transparencia óptica y el rápido desarrollo del pez cebra embriones de pez cebra KV hacer un excelente sistema modelo para estudiar las células ciliadas LR.

Curiosamente, los progenitores del linaje de células DFC / KV retener puentes citoplasmáticos entre la célula de yema de hasta 4 horas después de la fertilización (hpf), mientras que los puentes citoplásmicos entre la célula de yema y otras células embrionarias después de cerrar 2 hpf 8. Aprovechando estos puentes citoplasmáticos, hemos desarrollado una estrategia de inyección etapa específica para entregar morfolino oligonucleotides (MO) exclusivamente a las CFD y desmontables la función de un gen diana en estas 12 células. Esta técnica crea embriones quiméricos en los que se tocaron la función de genes en el linaje DFC / KV desarrollo en el contexto de un embrión de tipo salvaje. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV, inyectamos microesferas fluorescentes en la luz y el movimiento KV registro perla usando videomicroscopy 2. El flujo de fluido se visualiza fácilmente y se puede cuantificar mediante el seguimiento de desplazamiento talón con el tiempo.

Aquí, utilizando la etapa específica de DFC orientada técnica gen desmontables y la inyección de microesferas fluorescentes en KV para visualizar el flujo, se presenta un protocolo que proporciona un enfoque eficaz para caracterizar el papel de un gen en particular durante el desarrollo y la función KV.

Protocol

Visión general de la etapa específica de embriones de pez cebra inyecciones

Oligonucleótidos antisentido de morfolino (MO), que se unen a un ARNm objetivo e interrumpir la expresión de proteínas de transcripción que, son ampliamente utilizados en gen desmontables (pérdida de función) en el pez cebra estudios 13,14. Gene Herramientas, LLC ofrece OMs que están etiquetados con cualquiera de carboxifluoresceína (emite fluorescencia verde) o lisamina (emite fluorescencia roja) para detectar MO en embriones inyectados usando microscopía fluorescente. Mediante la inyección de MO en la célula de yema en diferentes etapas de desarrollo del pez cebra, es posible entregar el MO a compartimientos específicos del embrión (Figuras 1A-F). MO inyectado en la yema entre las etapas 1-4 de células (0-1 hpf) entra en todas las células embrionarias (Figuras 1A, D, D ') a través de conexiones con la yema de que persisten hasta la etapa de 32 células 15 para facilitar la caída global. MO inyectado en la yema durante midblastetapas ULA (2,5-3 hpf) puede entrar en los progenitores de los CFD (Figuras 1B, E, E ') probablemente a través de puentes citoplásmicos 8 y función de los genes desmontables específicamente en el linaje de células DFC / KV 12, sin entrar en linajes embrionarios mayoría de las otras células . Como un importante control para comprobar si la función del gen se requiere en DFC / KV o también en la yema de 12,16, también es posible restringir MO a la célula mediante la inyección de yema entre las etapas epibolia cúpula-30% (~ 4,5 hpf) tras todos los puentes citoplasmáticos han cerrado (Figuras 1C, F, F '). Estas inyecciones se han utilizado en combinación para analizar la función de genes en DFC / KV células 17-24. Para evaluar el flujo de fluido en KV, microperlas fluorescentes se inyecta en el lumen KV entre las etapas 6-10 somite (12-14 HPF) y luego inmediatamente imágenes utilizando videomicroscopía (Figuras 1G-J). Microperlas están disponibles que emiten fluorescencia roja o verde (o ambos), por lo que es posible utilizar diferentescanales a imagen fluorescente microperlas y MO.

1. Fase específica de Inyección de Morpholinos (MO)

La inyección de MO en embriones de pez cebra se ha demostrado previamente 25,26. A continuación, describimos brevemente etapa específica de inyecciones MO. Después de todas las inyecciones, los embriones se transfieren a una placa de Petri y se incubaron a 28,5 ° C.

  1. Global inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fertilización y cargarlos en una placa de inyección. Carga fluorescente MO en una aguja capilar y montar la aguja en un microinyector (por ejemplo, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector). Romper la punta de la aguja y ajustar los parámetros de inyección (presión y / o el tiempo) para crear una caída de inyección que tiene un volumen de 1 nl como se describe 25,26. Usando un estereomicroscopio de disección, inyectar 1 nl de MO en la yema (Figura 1A) de ≥ 50 embriones por experimentar. Trabaje con rapidez para completar las inyecciones por el ciervo de 4 celdase.
  2. DFC-dirigido inyección MO: Recoger embriones inmediatamente después de la fecundación y se incuba a 28,5 ° C. Cuando los embriones se han llegado a la etapa 256-celular (~ 2,5 hpf), rápidamente a cargar en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre las etapas 256-celulares y 1.000 células-(figura 1B).
  3. Yema orientados MO inyección: Recoger inmediatamente después de la fecundación de embriones e incubar a 28,5 º C. En la etapa de cúpula (~ 4 hpf), cargar los embriones en una placa de inyección y luego inyectar 1 nl de MO fluorescente en la yema de ≥ 100 embriones entre la cúpula y el 30% epibolia etapas (Figura 1C).

2. Selección de embriones inyectados para el Análisis de

  1. Cuando MO inyectado embriones llegar a la fase 75%-epibolia (8 hpf), retirar los embriones fertilizados y embriones muertos y luego de pantalla que viven bajo un microscopio de disección fluorescente para la distribución de la MO fluorescente. Entonces allow seleccionado para desarrollar embriones a 28,5 ° C.
    1. Para mundial inyecciones MO, seleccionar embriones que han fluorescencia uniformemente distribuidos a lo largo de todas las células en embriones (Figura 1D; Figura 2A).
    2. Para DFC-dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que fluorescente MO ha difundido a través de la yema y parece concentrarse en el margen blastodermo dorsal (CFD) (Figura 1E; Figura 2B). En esta etapa, puede ser difícil de visualizar las CFD fluorescentes debido a la fluorescencia brillante en la yema subyacente. Tenga cuidado de excluir embriones en los que el fluorescente MO ha incorporado en las células embrionarias que no sean las CFD o permanece agregados en el sitio de inyección (Figura 2D).
    3. Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar embriones en los que MO fluorescencia se distribuye uniformemente a lo largo de la yema y no se observó en las células embrionarias (Figura 1F; Figura 2C). Una vez más, eliminar embriones en los que la fluorescencia se mantiene MOagregados en el sitio de inyección.
  2. Entre las etapas 2-4-somite (~ 11 hpf), embriones pantalla una segunda vez bajo un microscopio de fluorescencia utilizando un mayor aumento. Luego permita embriones seleccionados para desarrollar a 28,5 ° C.
    1. Para globales inyecciones MO, asegurar embriones seleccionados tienen MO fluorescencia distribuida uniformemente en KV y todas las células embrionarias (Figura 1D '; Figura 2E).
    2. Por DFC-dirigido inyecciones MO, seleccione cuidadosamente los embriones que tienen fluorescencia MO sólo en las células KV y la yema (Figura 1E '). Embriones transgénicos que expresan GFP en células KV, tales como Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, puede ayudar en la identificación de los embriones en el que MO ha sido entregado correctamente a las células kV (Figura 2F). Deseche los embriones con MO fluorescencia en las células embrionarias otras que las células KV.
    3. Para yema dirigida inyecciones MO, seleccionar los embriones que tienen fluorescencia MO exclusivamente en la yema ('Figura 1F: Figura2G).

3. Los embriones de montaje para analizar el flujo de líquido en KV

  1. Para el análisis de flujo de fluidos asimétrica en KV mundial de MO, MO DFC-dirigido o yema orientada embriones inyectados MO, cuidadosamente dechorionate ~ 20 embriones de 4-6 somite etapas (~ 11-12 HPF) con pinzas cortantes.
  2. Preparar 50 ml de 1% de bajo punto de fusión de agarosa y alícuota en tubos de 5 ml a ser mantenidos como un líquido en un baño seco a 42 ° C.
  3. Transferir un embrión a una diapositiva de la depresión de vidrio (Reino Suministros Científicos, Inc.) y retirar la mayor cantidad de agua posible. Inmovilizar el embrión mediante la adición de suficiente caliente 1% de bajo punto de fusión de agarosa para cubrir sólo el embrión (demasiado agarosa puede interferir con la formación de imágenes posterior). A medida que la agarosa se ​​solidifica, utilice unas pinzas para colocar el embrión de tal manera que se KV hacia arriba (vista dorsal) (Figura 1H). Montar 10 embriones con un embrión por diapositiva. Trabaje con rapidez para asegurar que todas las inyecciones en el siguiente paso es complpuestó por el somite etapa 10 (14 HPF).

4. La inyección de microperlas fluorescentes en KV

  1. Diluir Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 micras de diámetro microesferas (Polysciences, Inc.) a 1:50 en agua estéril en un tubo Eppendorf de 1,5 ml.
  2. Mezcle la dilución 1:50 de microesferas a fondo tocando el tubo de carga y 3 l en una aguja capilar. Utilizando el mismo microinyector utilizado para MO inyecciones (por ejemplo Harvard Apparatus PLI-90 Pico-inyector), romper la punta de la aguja con un fórceps y ajustar la configuración de inyección para generar el menor posible (<0,5 nl) gota inyección.
  3. Bajo un microscopio de disección, alinear la aguja con la luz KV del primer embrión montado. Insertar la aguja en el lumen y se inyecta un volumen pequeño (<0,5 nl) de las perlas (Figura 1G). Una punta de la aguja pequeña y pequeño volumen de inyección son críticos para evitar KV perjudicial.
  4. Inyectar todos los embriones montados. Una vez que un embrión ha sido injected, una gota de agua estéril se puede añadir en la parte superior de la agarosa para evitar que se seque. Durante el curso de las inyecciones, las perlas a menudo obstruya la abertura de la aguja. Esto requiere volver a romper la punta de la aguja y ajustando el volumen de inyección por la modulación de la presión o de ajuste de tiempo del aparato de microinyección. Vuelva a colocar la aguja si pierde filo suficiente para causar un daño significativo durante la inyección.
  5. Pantalla de los embriones inyectados para la entrega exitosa de perlas con un microscopio compuesto fluorescente vertical (por ejemplo, Zeiss AxioImager M1) usando un objetivo 20X. En primer lugar, determinar si la estructura está intacta KV usando iluminación de campo claro (Figura 1J), y luego usar de fluorescencia para observar las perlas. Seleccionar embriones en los que las cuentas están presentes y se mueve dentro del lumen KV. Deseche los embriones con daño KV o no cuentas flotantes en KV. Es fácil pasar por alto KV y entregar cuentas a los tejidos cercanos o la yema subyacente. Si no tiene éxito, montaje another 10 embriones y repita el procedimiento de inyección.

5. Visualización y Análisis de Flujo de Fluidos KV

  1. Para cada embrión seleccionado con los granos dentro KV, añadir una gota de agua estéril para cubrir la agarosa y luego observar KV bajo el microscopio compuesto fluorescente vertical utilizando un objetivo de inmersión de agua 63X (Figura 1I). Alternativamente, un cubreobjetos se puede aplicar para su uso con objetivos de no inmersión de agua y / o microscopios invertidos.
  2. Utilice una cámara de alta velocidad montado en el microscopio (Zeiss AxioCamHSm por ejemplo) para grabar una película de 10 segundos. Registrar tanto las perlas usando el canal de fluorescencia (aproximadamente 70 cuadros / seg) y el lumen KV utilizando un campo claro o de contraste de interferencia diferencial (DIC) de canal.
  3. Para visualizar todos los movimientos de cuentas con el tiempo, importar la película de perlas fluorescentes en ImageJ software (descarga gratuita en http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) unand crear una proyección máxima de todas las señales fluorescentes en la película. Para realizar la proyección máxima en ImageJ, haga clic en "Imagen → → Pilas proyecto Z". En el "Proyecto Z" de la ventana, proyectar todos los cortes con el tipo de proyección de "intensidad máxima". Esta imagen puede ser superpuesta sobre una imagen DIC de la KV en la que las perlas fueron imágenes (Figuras 3A-B).
  4. Los movimientos de las perlas individuales pueden ser rastreados usando ImageJ. Un plugin ("Tracking Manual") se puede descargar en http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Abra la película perlas fluorescentes en ImageJ y ejecutar la función de seguimiento manual. En la ventana de seguimiento manual, revise los "parámetros" y muestran los parámetros de entrada para los "intervalos de tiempo" y "x / y calibración". Seleccione manualmente los granos que quedan en el plano focal de la película durante ≥ 50 cuadros y luego un seguimiento de ≥ 5 cuentas por embrión. La trayectoria y la velocidad de cada perla se genera por the software (Figuras 3 CD).

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Representative Results

Específicos Stage-inyecciones MO proporcionar un enfoque útil para analizar la función de genes en compartimentos específicos del embrión. Figura 1 presenta un diagrama de flujo de las estrategias de inyección usados ​​para probar la función de genes en DFC / KV células y cómo introducir perlas fluorescentes para visualizar el flujo de fluido en KV. La distribución de MO fluorescente en exitosos específicos etapa-embriones inyectados se muestra esquemáticamente en las figuras 1D-F y en embriones vivos en la Figura 2. Un éxito inyección MO, en la que el MO sigue siendo agregadas en la célula de yema de huevo, se muestra en la Figura 2D.

Con éxito embriones inyectados-seleccionados en base a la localización de MO-fluorescente se puede montar en las etapas 4-6 somite para la entrega de microperlas fluorescentes en el lumen KV (Figuras 1G-H) para analizar el flujo de fluido. Videomicroscopia se utiliza para registrar los movimientos de talón en KV (Figuras 1I-J), el cual se pueden analizar cualitativamente (Figuras 3A-B) o cuantitativamente (Figuras 3C-E) utilizando el software ImageJ. En un embrión de control con flujo normal, perlas de seguimiento en sentido antihorario caminos que pueden ser visualizados mediante una proyección máxima de posiciones de perlas fluorescentes con el tiempo (Figura 3A) o mediante el seguimiento de las perlas individuales en el tiempo (Figura 3C). Para demostrar la pérdida del flujo coordinada, se inyecta embriones con MO a knockdown Rho quinasa 2b (Rock2b), que ya hemos demostrado interrumpe el flujo 18. En Rock2b embriones inyectados con MO, perlas se mueven al azar en KV (Figuras 3B, D). ImageJ software se utiliza para calcular la velocidad de pistas individuales de talón. La velocidad media de 5 perlas de control y de embriones Rock2b MO se muestra en la Figura 3E.

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Figura 1. Descripción general de la etapa específica de MO inyecciones y la inyección de microesferas en KV. (A) Inyección de MO fluorescente (rojo) en la yema en la etapa 1-célula para la distribución global de MO en todo el embrión. (B) DFC-dirigido inyección MO en la etapa 512-celular para cargar MO en DFC / KV células. (C) con yema dirigida inyección MO en 30%-epibolia etapa limitar MO a la yema. (DF ') Representación esquemática de la distribución de MO fluorescente (rojo) en embriones con éxito inyectó en la fase 75% epibolia (D, E, F) y la etapa de somite 6 (D', E ', F') siguiente etapa- inyecciones específicas. MO se acumula en el linaje de células DFC / KV cuando se inyecta en la etapa 512-celular (flechas en E, E '), pero no cuando se inyecta a 30% epibolia (flechas en F, F'). (G) La inyección de microesferas fluorescentes (verde) en el lumen KV. (H) A propembrión adecuadamente montado con KV (flecha) hacia arriba para la inyección de microesferas. (I) las perlas de imágenes en movimiento KV utilizando un microscopio vertical. (J) de alta magnificación de un lumen KV intactos inyectados con microperlas. Etapas embrionarias de embriones y dibujos se basan en la ref. 28.

Figura 2
Figura 2. La selección de embriones siguientes etapas específicas de inyecciones MO. (AC) Ejemplos de embriones seleccionados en la etapa 75% epibolia (8 HPF) en el que fluorescente MO (rojo) o bien ha incorporado en todas las células embrionarias siguiente global inyección MO (A), difundido a través de la yema y las CFD (flecha) después de DFC orientada por inyección MO (B) o se mantuvo en la yema de huevo después de yema orientada MO inyección (C). (D) Ejemplo de un embrión excluidos en la que el fluorescent MO agregados en el sitio de inyección. (EG) Ejemplos de fluorescente MO (rojo) distribución en los embriones seleccionados en la etapa de 4 somites (11,5 HPF). DIC imágenes identificar el lumen KV (flecha) en transgénico Tg (Dusp6: d2EGFP) embriones que expresan GFP en células KV 27. En el mundial embrión inyectado MO, MO se observó en KV y todas las células circundantes (E). En el DFC-dirigido embrión inyectado MO, MO co-localizada con GFP en la mayoría de las células KV y también estaba presente en los núcleos subyacentes yema de huevo (F). En el embrión de yema orientada, MO se encuentra exclusivamente en los núcleos de yema de huevo (G).

Figura 3
Figura 3. Los análisis cualitativos y cuantitativos de flujo de fluido en KV. (AB) Para el análisis cualitativo de flujo, una proyección máxima de un movimiento película 10 sec mostrando de todo fluorescmicroperlas rentes inyectados en KV se ha superpuesto sobre una imagen DIC del lumen KV en un control global MO (A) o MO Rock2b (B) embrión inyectado. (CE) para cuantificar el flujo, el movimiento de microperlas individuales (n = 5), se realiza el seguimiento en un embrión de control (C) y Rock2b embrión MO inyectado (D) y se utiliza para calcular una velocidad promedio de talón (E). Circles (CD) aproximar las fronteras KV Lumen. Las barras de error (E) representan una desviación estándar.

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Discussion

Usando etapa específica de inyecciones para apuntar MO con el linaje celular DFC / KV es un enfoque útil para el estudio de células autonomía de la función de genes y fenotipos pleiotrópicos evitar causados ​​por caída génica global. Sin embargo, estas inyecciones pueden ser técnicamente difícil. La inyección de MO entre las etapas de 256 y 1.000 células por células puede dar lugar a tres resultados posibles: 1) el MO sigue siendo agregadas en el sitio de inyección, 2) se difunde en toda la yema de MO y entra DFC / KV células o 3) el MO difunde en toda la yema y entra DFC / KV células y otras células embrionarias. Por lo tanto, la selección de embriones en los que se ha movido MO exclusivamente a las células DFC / KV es un paso clave en este experimento. Es importante señalar que MO puede cargar en todas las células DFC / KV pero a menudo entra en sólo un subconjunto de estas células 10. Las razones que subyacen a este mosaico focalización siguen sin estar claros, pero puede reflejar la variabilidad en la eficiencia con que se mueve el MO a través de la yema de huevo y / o el momento del cierre de individual puentes entre la yema y progenitores DFC. No hemos encontrado condiciones que aumentan la eficiencia de la focalización, sino que más bien se han basado en la selección de embriones en los que la mayoría de las células KV han tomado MO. La tasa de éxito para la producción de embriones con MO en la mayoría de los DFC / KV células es típicamente ~ 20-30%, pero esto puede ser muy variable de día a día. Por esta razón, se recomienda inyectar los embriones como sea posible (≥ 100), y luego, con cuidado la selección de los embriones que tienen una distribución adecuada de fluorescente morfolino.

Los experimentos de control son vitales para la interpretación de los resultados de DFC orientados inyecciones. Un desajuste o MO MO estándar negativo de control (de Gene Herramientas, LLC) se debe utilizar en el control de los efectos no específicos. Además, puesto que DFC orientados inyecciones MO entregar a la yema y la DFC / KV linaje de células (Figura 2F), es importante para determinar si los fenotipos en estos embriones se deben a la pérdida de diversión gencción en DFC / KV células o en la célula de yema. Comparando fenotipos en DFC orientados embriones con yema de orientación embriones (Figuras 2F-G) identificará DFC / KV específico de las células afecta. Por supuesto, algunos genes pueden funcionar tanto en las células DFC / KV y la yema 16. Aunque nos centramos de MO mediadas por la pérdida de función de los análisis aquí, la técnica de inyección DFC-dirigida y asociados experimentos de control se puede utilizar para evaluar una ganancia de función mediante la inyección de ARNm sintético para sobreexpresar una proteína particular en la DFC / KV linaje 17,22,24,29. Una adaptación inteligente de este enfoque utiliza DFC-dirigido inyecciones de ARNm para rescatar mundial MO desmontables sólo en DFC / KV células 30. Sin embargo, debe tenerse en cuenta que no todos los mRNAs inyectados en este resultado manera en la expresión de la proteína codificada en CFD y células KV, y controles importantes deben ser incluidos para evaluar el nivel de expresión de la proteína y la distribución.

Entrega exitosa de microperlass en el lumen KV para evaluar el flujo asimétrico depende de la inyección de las perlas en las etapas óptimas durante el rápido desarrollo del órgano KV transitoria. Comenzamos embriones de montaje en las etapas 4-6 somite (~ 12 hpf) y luego inyectarse en microperlas KV hasta la fase de somite 10 (14 HPF). Antes de la etapa de somite 4, el lumen a menudo es demasiado pequeña para inyectar, y en etapas posteriores (> 10 somites) la inyección se hace difícil debido a KV mueve más profundamente en el embrión. Una limitación de esta técnica es que requiere que el lumen KV para expandirse a un tamaño que pueda ser inyectado con éxito con microperlas. En los casos en MO desmontables de un gen particular interrumpe severamente organización KV y / o reduce el tamaño de la luz KV (revisado en ref. 31) que será difícil, si no imposible, ensayo de flujo utilizando este enfoque.

En la preparación de embriones para la inyección de microesferas en KV, es importante para montar el embrión recto a lo largo del eje embrionario con KV hacia arriba (Figura 1H), Cuya posición embrión puede afectar el ángulo que la aguja entra en KV y el ángulo de perlas de formación de imágenes en KV. También es importante la utilización de una aguja de inyección de calibre pequeño y pequeño volumen de inyección de microesferas de evitar KV perjudicial. Recomendamos la práctica para desarrollar una carrera de inyección suave para insertar la aguja en KV, liberar el talón y luego rápidamente retraer la aguja a partir del embrión. Cuando las condiciones son óptimas, que son capaces de llevar el éxito de microperlas a ~ 50% (por ejemplo n = 5/10) de los embriones inyectados.

En resumen, la etapa específica de las inyecciones de MO y la visualización de microperlas en KV brindará la oportunidad de estudiar la función de genes en las células ciliadas LR.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Damos las gracias a Fiona Foley para el apoyo y la atención excelente laboratorio de pez cebra. Este trabajo recibió el apoyo de una beca predoctoral para AHA GW (11PRE5730027) y las subvenciones a HJY NHLBI (R01HL66292) y JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Biología del Desarrollo número 73 Genética Biología Celular Neurociencias Biología Molecular Bioingeniería Biofísica Cilia pez cebra, Técnicas de derribo Gene asimetría izquierda-derecha cilios vesícula Kupffer modelo animal
El análisis de la función génica y visualización de los cilios-generó un flujo de líquido en la vesícula Kupffer
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Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

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