Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

أهداب ولدت في تدفق السوائل حويصلة كوبفر (KV) تسيطر على اليسار واليمين الزخرفة الجنين الزرد. هنا، نحن تصف تقنية لتعديل وظيفة الجين في الخلايا على وجه التحديد KV. وبالإضافة إلى ذلك، وتبين لنا كيفية توصيل الخرز الفلورسنت في KV لتصور تدفق السوائل.

Abstract

الأعضاء الداخلية مثل القلب والمخ والقناة الهضمية وتطوير اليسار واليمين (LR) عدم التماثل التي تعتبر بالغة الأهمية لمهامهم العادية 1. ويشارك في تأسيس أهداب متحركة LR التباين في الأجنة الفقارية، بما في ذلك الماوس، الضفدع، والزرد 2-6. هذه 'أهداب LR' غير المتماثلة توليد تدفق السوائل ما هو ضروري لاشعال الحفظ غير المتماثلة العقدية (TGF-β الفصيلة) يشير شلال في الأديم المتوسط ​​الجانبي الأيسر لوحة، والتي يعتقد على توفير المعلومات LR الزخرفة لتطوير أجهزة 7. وبالتالي، لفهم الآليات الكامنة وLR الزخرفة، لا بد من تحديد الجينات التي تنظم تنظيم خلايا مهدبة LR، والحركة وطول أهداب LR وقدرتها على توليد التدفق غير المتماثلة قوية.

في الجنين الزرد، وتقع في الحويصلة LR ​​أهداب كوبفر (KV) 2،4،5. وتتألف من KV طبقة واحدة من الخلايا الطلائية monociliatedأن أرفق التجويف مملوءة بسائل. وقد أظهرت الخرائط التي مشتق مصير KV من مجموعة من الخلايا المعروفة باسم 20-30 ~ رائد الخلايا الظهرية (DFCs) التي تهاجر في الهامش الأريمة الظهرية خلال مراحل اكتفار 8،9. خلال المراحل المبكرة الجسيدة، DFCs العنقودية وتفرق في الخلايا الظهارية مهدبة لتشكيل KV في tailbud الجنين 10،11. القدرة على تحديد وتعقب DFCs في تركيبة مع الشفافية البصرية والتطور السريع في الزرد الجنين، جعل الزرد KV نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخلايا المهدبة LR.

ومن المثير للاهتمام، من سلالة الأسلاف الخلية DFC / KV الاحتفاظ الجسور بين الخلية السيتوبلازمية صفار تصل إلى 4 ساعة بعد الإخصاب (HPF)، في حين الجسور حشوية بين الخلية والخلايا الجنينية صفار أخرى قريبة بعد 2 HPF 8. الاستفادة من هذه الجسور حشوية، وضعنا استراتيجية حقن المرحلة الخاصة لتقديم morpholino oligonucleotides (MO) حصريا لDFCs وضربة قاضية وظيفة الجين المستهدف في هذه الخلايا 12. هذه التقنية تخلق أجنة خيالية التي طرقت ظيفة الجين عليها في النسب DFC / KV النامية في سياق الجنين من النوع البري. غير المتماثلة لتحليل تدفق السوائل في KV، ونحن حقن microbeads الفلورسنت في التجويف KV وسجل الحركة باستخدام حبة videomicroscopy 2. هو تصور تدفق السوائل بسهولة ويمكن كميا من خلال تتبع التشريد حبة مع مرور الوقت.

هنا، وذلك باستخدام مرحلة محددة ضربة قاضية الجينات DFC التي تستهدف تقنية وحقن microbeads الفلورسنت في KV لتصور تدفق سنتطرق لبروتوكول يوفر نهجا فعالا لتوصيف دور جينات معينة أثناء نمو KV وظيفة.

Protocol

نظرة عامة على مسارح محددة حقن الأجنة الزرد

[أليغنوكليوتيد] العقاقير morpholino (MO)، الذي ربط إلى مرنا وتعطيل استهداف بروتين تعبير عن ذلك النص، وتستخدم على نطاق واسع في ضربة قاضية الجين (الخسارة من وظيفة) دراسات في الزرد 13،14. أدوات الجينات، LLC يقدم المنظمات الأعضاء التي يتم المفتاحية إما carboxyfluorescein (تنبعث الأخضر مضان) أو lissamine (تنبعث الأحمر مضان) للكشف عن MO في الأجنة حقن باستخدام المجهر الفلورسنت. عن طريق حقن MO في الخلية صفار في مراحل مختلفة من التنمية الزرد، فمن الممكن لتسليم MO إلى حجرات خاصة للجنين (أرقام 1A-F). MO حقنها في صفار بين مراحل الخلية 1-4 (0-1 HPF) يدخل جميع الخلايا الجنينية (أرقام 1A، D، D ') عبر اتصالات مع صفار التي لا تزال مستمرة حتى المرحلة 32-15 إلى الخلية تسهيل ضربة قاضية العالمية. حقن MO في صفار خلال midblastيمكن مراحل العلا (2.5-3 HPF) أدخل الأسلاف من DFCs (أرقام 1B، E، 'E) المحتمل من خلال الجسور حشوية 8 و ضربة قاضية وظيفة الجين على وجه التحديد في نسب الخلايا DFC / KV 12، دون الدخول معظم الأنساب الخلية الجنينية . كعنصر تحكم المهم لاختبار ما إذا كان يلزم وظيفة الجين في DFC / KV أو أيضا في صفار 12،16، فمن الممكن أيضا أن تقييد MO إلى الخلية عن طريق حقن صفار بين المراحل اكتفار قبة-30٪ (4،5 ~ HPF) بعد وأغلقت جميع الجسور حشوية (أرقام 1C، F، F '). وقد استخدمت هذه الحقن في تركيبة الجينات لتحليل وظيفة في DFC / KV الخلايا 17-24. لتقييم تدفق السوائل في KV، يتم حقن microbeads الفلورسنت في التجويف KV بين المراحل 6-10 الجسيدة (12-14 HPF) و. ثم تصويرها على الفور باستخدام videomicroscopy (أرقام 1G-J) Microbeads المتاحة التي تنبعث منها مضان أحمر أو أخضر (أو كليهما)، ولذلك فمن الممكن استخدام مختلفقنوات لصورة الفلورسنت microbeads وMO.

1. مرحلة محددة من حقن Morpholinos (MO)

وقد تجلى حقن الأجنة الزرد MO في وقت سابق 25،26. هنا، نحن تصف لفترة وجيزة مرحلة محددة الحقن MO. بعد كل حقن، يتم نقل الأجنة إلى طبق بتري وحضنت في 28.5 ° C.

  1. MO حقن العالمية: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب وتحميلها على لوحة الحقن. تحميل MO الفلورسنت في إبرة الشعرية وتركيب الإبرة في الصعود إلى microinjector (مثل هارفارد جهاز PLI-90-حاقن بيكو). كسر غيض إبرة الحقن وضبط إعدادات (الضغط و / أو الوقت) لإنشاء قطرة حقن يحتوي على حجم من 1 NL كما هو موضح 25،26. باستخدام stereomicroscope تشريح، وضخ من 1 NL MO في صفار (الشكل 1A) 50 ≥ الأجنة في التجربة. العمل بسرعة لاستكمال الحقن من الأيل 4-الخليةه.
  2. DFC التي تستهدف حقن MO: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضان 28.5 ° C. في عندما الأجنة قد وصلت إلى مرحلة 256-الخلية (~ 2.5 HPF)، تحميل بسرعة لهم في لوحة وحقن حقن ثم 1 NL من الفلورسنت MO في صفار من أجنة 100 ≥ بين المراحل 256-الخلية و 1،000 الخلية (الشكل 1B).
  3. صفار استهداف MO الحقن: جمع الأجنة مباشرة بعد الإخصاب واحتضان 28.5 ° C. في في المرحلة القبة (~ 4 HPF)، تحميل الأجنة في لوحة حقن ثم ضخها من 1 NL MO الفلورسنت في صفار من أجنة 100 ≥ بين القبة ومراحل اكتفار 30٪ (الشكل 1C).

2. اختيار الأجنة المحقونة لتحليل

  1. عندما MO حقن الأجنة تصل إلى مرحلة 75٪، اكتفار (8 HPF)، وإزالة الأجنة الميتة وغير مخصبة ثم الأجنة الشاشة يعيشون تحت المجهر الفلورسنت تشريح لتوزيع MO الفلورسنت. ثم ألواختيار الأجنة لتطوير ث 28.5 ° C. في
    1. لحقن MO العالمي، حدد الأجنة التي مضان موزعة بالتساوي في جميع أنحاء جميع الخلايا الجنينية (1D الشكل؛ 2A الشكل).
    2. لDFC التي تستهدف حقن MO، حدد الأجنة التي الفلورسنت MO قد ضعف في جميع أنحاء صفار ويبدو تتركز على هامش الأريمة الظهرية (DFCs) (الشكل 1E؛ الشكل 2B). في هذه المرحلة، يمكن أن يكون من الصعب تصور DFCs الفلورية بسبب مضان مشرق في صفار الأساسية. أن تحرص على استبعاد الأجنة التي MO الفلورسنت وقد أدرجت في الخلايا الجنينية غير DFCs أو لا يزال تجميعها في موقع الحقن (الشكل 2D).
    3. لصفار استهداف الحقن MO، حدد الأجنة التي يتم توزيعها بالتساوي في جميع أنحاء MO مضان صفار وليس لوحظ في أي الخلايا الجنينية (الشكل 1F؛ الشكل 2C). مرة أخرى، وإزالة الأجنة التي لا تزال MO الفلورسنتتجميعها في موقع الحقن.
  2. بين المرحله 2-4-الجسيدة (~ 11 HPF) الأجنة الشاشة، للمرة الثانية تحت المجهر الفلورسنت باستخدام أعلى التكبير. ثم السماح المحددة لتطوير الأجنة 28.5 ° C. في
    1. لحقن MO العالمية، وضمان الأجنة المحددة لها MO مضان موزعة بالتساوي في جميع KV والخلايا الجنينية (1D الشكل '؛ 2E الشكل).
    2. لDFC التي تستهدف حقن MO، حدد بعناية الأجنة التي لديها MO مضان فقط في الخلايا KV وصفار (الشكل 1E). الأجنة المعدلة وراثيا التي تعبر عن GFP في خلايا KV، مثل TG (Dusp6: d2EGFP) 27، يمكن أن تساعد في تحديد الأجنة التي تم تسليمها بنجاح MO إلى خلايا KV (الشكل 2F). تجاهل الأجنة مع مضان MO في الخلايا الجنينية خلايا أخرى KV ذلك.
    3. لصفار استهداف الحقن MO، حدد الأجنة التي لديها MO مضان حصرا في (صفار '1F الشكل: الشكل2G).

3. تصاعد الأجنة لتحليل تدفق السوائل في KV

  1. غير المتماثلة لتحليل تدفق السوائل في KV من MO العالمية، التي تستهدف DFC MO أو صفار استهداف الأجنة حقن MO، dechorionate بعناية ~ 20 بين 4-6 أجنة مراحل الجسيدة (~ 11-12 HPF) مع ملقط حاد.
  2. تجهيز 50 مل من 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز وقسامة إلى 5 مل أنابيب إلى الحفاظ عليها كسائل في حمام الجافة في 42 ° C.
  3. نقل جنين واحد إلى الشريحة الزجاجية الاكتئاب (معدات و مستلزمات المتحدة العلمية، وشركة) وإزالة أكبر قدر من الماء قدر الإمكان. شل الجنين عن طريق إضافة ما يكفي من الحارة 1٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز لتغطية مجرد الجنين (أكثر من اللازم يمكن أن تتداخل مع الاغاروز التصوير اللاحقة). كما الاغاروز يتصلب، استخدم ملقط لوضع الجنين بحيث يكون مواجها لها KV (عرض الظهرية) (الشكل 1H). تحميل 10 الأجنة مع جنين واحد لكل شريحة. العمل بسرعة لضمان أن جميع الحقن في الخطوة التالية هي كومبلeted من المرحلة الجسيدة 10 (14 HPF).

4. حقن Microbeads نيون في KV

  1. تمييع Fluoresbrite Multifuorescent 0.5 ميكرون قطر المجهرية (Polysciences، وشركة) إلى 1:50 في الماء المعقم في أنبوب إيبندورف 1،5 مل.
  2. مزج التخفيف من 1:50 microbeads بدقة من خلال الاستفادة من أنبوب وتحميل 3 ميكرولتر في إبرة الشعرية. باستخدام microinjector نفسها التي استخدمت لحقن MO (مثل هارفارد جهاز PLI-90-حاقن بيكو)، وكسر غيض إبرة مع ملقط وضبط إعدادات حقن لتوليد أصغر ممكن قطرة حقن (<0.5 NL).
  3. تحت المجهر تشريح، محاذاة الإبرة مع التجويف KV من أول جنين شنت. إدراج إبرة في التجويف وحقن كمية صغيرة (<0.5 NL) من الخرز (الشكل 1G). وهناك معلومات إبرة صغيرة وصغيرة الحجم حقن حاسمة لتجنب KV الضارة.
  4. حقن الأجنة جميع المحملة. وبمجرد أن الجنين injecteيمكن إضافة د، قطرة من الماء المعقم على رأس الاغاروز لمنعها من الجفاف. أثناء الحقن، وحبات كثيرا ما تعوق افتتاح الإبرة. هذا يتطلب إعادة كسر غيض إبرة وضبط حجم الحقن عن طريق تحوير أو الإعداد ضغط الوقت من جهاز حقن مكروي. استبدال الإبر إذا أصبح صريحا بما يكفي للتسبب في أضرار كبيرة خلال الحقن.
  5. شاشة الأجنة حقن لتسليم ناجحة من الخرز تحت المجهر المركب الفلورسنت تستقيم (مثل زايس AxioImager M1) باستخدام الهدف 20X. أولا، تحديد ما إذا كان هيكل KV سليمة باستخدام brightfield الإضاءة (الشكل 1J)، ثم استخدم مضان لمراقبة الخرز. حدد الأجنة التي الخرز موجودة وتتحرك داخل التجويف KV. تجاهل الأجنة مع الضرر KV أو لا الخرز عائمة في KV. فمن السهل أن تفوت KV وتسليم الخرز إلى الأنسجة المجاورة أو صفار الأساسية. إذا غير ناجحة، جبل شرجي10 THER الأجنة وكرر الإجراء الحقن.

5. التصور والتحليل تدفق السوائل KV

  1. لكل الجنين المحددة مع الخرز داخل KV، إضافة قطرة من الماء المعقم لتغطية الاغاروز ثم مراقبة KV تحت المجهر المركب باستخدام الفلورية تستقيم الهدف 63X غمس المياه (الشكل 1I). وبدلا من ذلك، يمكن تطبيق ساترة للاستخدام مع المياه غير غمس الأهداف و / أو المجاهر المقلوب.
  2. استخدام كاميرا عالية السرعة التي شنت على المجهر (مثل زايس AxioCamHSm) لتسجيل فيلم 10 ثانية. تسجيل كل من الخرز باستخدام قناة الفلورسنت (ما يقرب من 70 إطارات / ثانية) والتجويف KV باستخدام brightfield أو الفرق المقابل تدخل (DIC) القناة.
  3. لتصور جميع الحركات حبة مع مرور الوقت، استيراد الفيلم من الخرز الفلورسنت في صناعة البرمجيات يماغيج (تحميل مجاني في http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) أالثانية إنشاء الإسقاط الحد الأقصى لجميع إشارات الفلورسنت في الفيلم. لأداء الإسقاط الأقصى في يماغيج، انقر فوق "ملف → → Z الأكوام المشروع". في إطار "مشروع Z"، المشروع جميع شرائح مع نوع من الإسقاط "كثافة ماكس". ويمكن فرضه على هذه الصورة الصورة DIC من KV التي تم تصويرها حبات (أرقام 3A-B).
  4. يمكن تتبع تحركات الفردية باستخدام الخرز يماغيج. A المساعد يمكن ("تتبع يدوي") يتم تحميلها في http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . فتح الفيلم الخرز الفلورسنت في يماغيج وتشغيل الدالة تتبع يدوي. في نافذة تتبع يدوي، تحقق "معلمات عرض" ومعلمات الإدخال ل "فترات زمنية" و "س / ص المعايرة". حدد يدويا الخرز التي تبقى في المستوى البؤري للفيلم للإطارات 50 ≥ ثم تتبع ≥ 5 حبات في الجنين. يتم إنشاء المسار والسرعة في كل حبة من اله برنامج (أرقام 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

المرحلة الخاصة الحقن MO توفر نهجا مفيدا لتحليل وظيفة الجين في حجرات خاصة للجنين. الشكل 1 يمثل الرسم البياني للاستراتيجيات الحقن المستخدمة لاختبار وظيفة الجين في DFC / KV الخلايا وكيفية إدخال الخرز الفلورسنت لتصور تدفق السوائل في KV. يظهر توزيع MO الفلورية في مرحلة الأجنة الخاصة الناجحة حقن تخطيطي في أرقام 1D-F والأجنة الحية في في الشكل 2. حقنة MO غير ناجحة، والذي يظهر MO يبقى تجميعها في الخلية صفار، في 2D الشكل.

حقن الأجنة بنجاح مختارة على أساس توطين الفلورسنت MO-يمكن تركيبه في المراحل 4-6 الجسيدة لتسليم microbeads الفلورسنت في التجويف KV (أرقام 1G-H) لتحليل تدفق السوائل. ويستخدم لتسجيل الحركات Videomicroscopy حبة في KV (أرقام 1I-J)، التي ويمكن تحليل نوعي (أرقام 3A-B) أو كميا (أرقام 3C-E) باستخدام يماغيج البرمجيات. في الجنين التحكم مع التدفق الطبيعي، اتبع عكس الخرز المسارات التي يمكن تصور بجعل إسقاط الحد الأقصى من المناصب حبة الفلورسنت على مر الزمن (الشكل 3A) أو عن طريق تتبع الخرز الفردية على مر الزمن (الشكل 3C). لإثبات فقدان تدفق منسقة، ونحن حقن الأجنة مع MO لكيناز رو ضربة قاضية 2B (Rock2b)، ونحن قد أظهرت سابقا يعطل تدفق 18. MO في الأجنة المحقونة Rock2b والخرز تتحرك بشكل عشوائي في KV (أرقام 3B، D). تم استخدام برنامج يماغيج لحساب سرعة المسارات حبة الفردية. يظهر متوسط ​​سرعة من 5 حبات من السيطرة والأجنة Rock2b MO في الشكل 3E.

es.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
الشكل 1. نظرة عامة على حقن MO مرحلة محددة وحقن microbead إلى KV. (A) من حقن MO الفلورسنت (أحمر) في صفار في المرحلة 1-خلية للتوزيع العالمي من خلال MO الجنين. (B) DFC التي تستهدف حقن MO في مرحلة الخلية 512-MO لتحميل في DFC / KV الخلايا. (C) صفار استهداف MO في مرحلة حقن٪ اكتفار-30 إلى تقييد MO إلى الصفار. (DF ') تمثيل تخطيطي لتوزيع MO الفلورسنت (الحمراء) في الأجنة حقن بنجاح في هذه المرحلة اكتفار 75٪ (D، E، F)، والمرحلة الجسيدة 6 (D'، E، F ') مرحلة التالية محددة عن طريق الحقن. MO يتراكم في الخلية النسب DFC / KV عندما تم حقنها في المرحلة 512-الخلية (الأسهم في E، E ')، ولكن ليس عند حقنه في 30٪ اكتفار (الأسهم في F، F'). (G) حقن microbeads الفلورية (الخضراء) في التجويف KV. (H) دعامةشنت erly الجنين مع KV (السهم) للحقن مواجهة microbead. (I) حركة الخرز التصوير في KV باستخدام المجهر تستقيم. (J) تضخم عالية من التجويف KV سليمة مع حقن microbeads. وتستند مراحل الجنينية والجنين الرسومات على المرجع. 28.

الشكل 2
الشكل 2. اختيار الأجنة بعد الحقن مرحلة محددة MO. (AC) أمثلة مختارة من الأجنة في مرحلة اكتفار 75٪ (8 HPF) التي الفلورسنت MO (أحمر) وقد أدرجت إما في جميع الخلايا الجنينية بعد حقن MO العالمية (A)، تنتشر من خلال وصفار DFCs (السهم) بعد DFC ظلت تستهدف حقن MO (B) أو في صفار بعد حقن MO صفار استهداف (C). (D) مثال لاستبعاد الأجنة التي فلووتجميع rescent MO في موقع الحقن. (EG) أمثلة على توزيع الفلورسنت (أحمر) MO في اختيار الأجنة في مرحلة 4-الجسيدة (11.5 HPF). صور DIC تحديد التجويف KV (السهم) في تيراغرام المعدلة وراثيا (Dusp6: d2EGFP) الأجنة التي تعبر عن GFP في خلايا KV 27. MO في الجنين العالمية المحقونة، ولوحظ في MO KV وجميع الخلايا المحيطة بها (E). في DFC التي تستهدف حقن الجنين MO، MO شارك في ترجمة مع GFP في معظم الخلايا KV وكان حاضرا أيضا في النوى التي تقوم عليها صفار (F). في الجنين صفار استهداف، تم العثور MO حصرا في نوى صفار (G).

الشكل 3
الشكل 3. التحليلات الكمية والنوعية من تدفق السوائل في KV. (AB) للتحليل النوعي للتدفق، إسقاط الحد الأقصى لحركة 10 ثوانى يظهر الفيلم من جميع fluorescتم فرضه microbeads الأنف والحنجرة حقن KV على صورة DIC من التجويف KV في MO السيطرة العالمية (A) أو MO Rock2b (B) حقن الجنين. (CE) لقياس التدفق، وحركة الفرد وتعقب microbeads (ن = 5) في الجنين التحكم (C) وRock2b MO الجنين حقن (D) وتستخدم لحساب متوسط ​​السرعة حبة (E). الدوائر (CD) تقريبي حدود التجويف KV. أشرطة الخطأ (E) تمثل واحدة الانحراف المعياري.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

باستخدام الحقن مرحلة محددة لاستهداف MO لنسب الخلية DFC / KV هو نهج مفيد لدراسة الخلية للحكم الذاتي وظيفة الجين وتجنب الظواهر عديد المظاهر الناجمة عن ضربة قاضية الجينات العالمي. ومع ذلك، يمكن أن يكون تحديا هذه الحقن من الناحية الفنية. حقن MO بين المراحل 256-الخلية و 1،000 خلية يمكن أن يؤدي إلى ثلاث نتائج محتملة: 1) لا يزال MO تجميعها في موقع الحقن، 2) ينشر MO في جميع أنحاء صفار ويدخل DFC / KV الخلايا أو 3) في MO ينشر في جميع أنحاء صفار ويدخل DFC / KV الخلايا والخلايا الجنينية الأخرى. لذلك، واختيار الأجنة التي انتقلت MO حصرا على الخلايا DFC / KV هو خطوة رئيسية في هذه التجربة. من المهم أن نلاحظ أن MO يمكن تحميل في جميع الخلايا DFC / KV لكن في كثير من الأحيان يدخل مجموعة فرعية فقط من هذه الخلايا 10. الأسباب الكامنة وراء استهداف هذه الفسيفساء تزال غير واضحة، ولكن قد يعكس التباين في مدى كفاءة التحركات MO من خلال و / أو صفار توقيت إغلاق دائرة الهجرة والجنسيةividual الجسور بين الأسلاف وصفار DFC. لم نعثر على الظروف التي تستهدف زيادة الكفاءة، بل كانت تعتمد على اختيار الأجنة التي معظم الخلايا KV اتخذوا MO. هو عادة نسبة النجاح لتوليد أجنة مع MO في معظم DFC / KV الخلايا ~ 20-30٪، ولكن هذا يمكن أن يكون المتغير تماما من يوم لآخر. لهذا السبب، فإننا ننصح بالحقن كما عدد ممكن من الأجنة (≥ 100)، ومن ثم اختيار بعناية الأجنة التي لديها التوزيع المناسب للmorpholino الفلورسنت.

تجارب السيطرة ضرورية لتفسير نتائج DFC التي تستهدف حقن. وينبغي استخدام MO عدم تطابق معيار سلبي أو السيطرة MO (من أدوات جين، LLC) للتحكم عن آثار غير محددة. وبالإضافة إلى ذلك، منذ DFC التي تستهدف حقن تقديم MO إلى كل من صفار وDFC / KV النسب الخلية (الشكل 2F)، فمن المهم لتحديد ما إذا الظواهر في هذه الأجنة هي نتيجة لفقدان الجين من المرحction في DFC / KV الخلايا أو الخلية في صفار البيض. ومقارنة الظواهر في DFC التي تستهدف الأجنة مع صفار التي تستهدف الأجنة (أرقام 2F-G) تحديد DFC / KV خلية محددة يؤثر. بالطبع، قد تكون بعض الجينات تعمل في كل من الخلايا DFC / KV وصفار 16. على الرغم من أننا نركز من التحليلات الخسارة من وظيفة MO بوساطة هنا، يمكن استخدام تقنية الحقن DFC التي تستهدف السيطرة والتجارب المرتبطة لتقييم مكسب من بين وظيفة عن طريق حقن مرنا الاصطناعية إلى overexpress بروتين معين في DFC / KV نسب 17،22،24،29. واحد تكييف ذكية لهذا النهج المستخدمة DFC التي تستهدف حقن مرنا لانقاذ العالمية MO ضربة قاضية فقط في DFC / KV الخلايا 30. ومع ذلك، ينبغي الإشارة إلى أنه ينبغي إدراج جميع mRNAs وليس في حقن هذه النتيجة الطريقة التعبير عن البروتين المشفرة في DFCs والخلايا KV، والضوابط المهمة لتقييم مستوى البروتين التعبير والتوزيع.

نجاح تسليم microbeadق في التجويف KV لتقييم تدفق غير المتماثلة يعتمد على حقن الخرز في مراحل الأمثل خلال التطور السريع للجهاز KV عابرة. نبدأ أجنة في مراحل متزايدة الجسيدة 4-6 (~ 12 HPF) وحقن ثم microbeads إلى KV تصل إلى مرحلة الجسيدة 10 (14 HPF). قبل مرحلة الجسيدة 4، وغالبا ما يكون التجويف صغير جدا لحقن، وفي مراحل لاحقة (> 10 somites) الحقن يصبح من الصعب بسبب KV إلى عمق الجنين. واحد الحد من هذه التقنية هو أن يتطلب التجويف KV للتوسع في حجم التي يمكن حقنها بنجاح مع microbeads. في الحالات التي MO ضربة قاضية من جين معين يعطل بشدة KV منظمة و / أو يقلل حجم التجويف KV (مشاركة في المرجع 31) سيكون من الصعب، إن لم يكن من المستحيل، تدفق الفحص باستخدام هذا النهج.

عند إعداد الأجنة للحقن من microbeads إلى KV، فمن المهم لتحميل الجنين مستقيم على طول محور الجنينية مع KV مواجهة (الشكل 1H)، كما يمكن وضع الجنين تؤثر على الزاوية التي يدخل الإبرة KV وزاوية التصوير من الخرز في KV. من المهم أيضا لاستخدام إبرة الحقن العيار الصغير والصغيرة الحجم حقن microbeads لتجنب KV الضارة. نوصي ممارسة لوضع السكتة الدماغية حقن السلس لادخال الإبرة في KV، حرر الخرز ثم سحب الإبرة بسرعة من الجنين. عندما تكون الظروف المثلى، ونحن قادرون على تقديم بنجاح microbeads إلى 50٪ ~ (على سبيل المثال N = 5/10) من الأجنة المحقونة.

وباختصار، مرحلة محددة الحقن MO وتصور microbeads في KV فرصة لدراسة وظيفة الجينات في الخلايا مرشح LR مهدبة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

نشكر فيونا فولي للحصول على الدعم والرعاية ممتازة مختبر الزرد. وأيد هذا العمل زمالة AHA predoctoral لGW (11PRE5730027) والمنح NHLBI لHJY (R01HL66292) والنقابة (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 73، علم الوراثة، علم الأحياء الخلوي وعلم الأعصاب، علم الأحياء الجزيئية، الهندسة الحيوية، الفيزياء الحيوية، أهداب، واسماك الزرد
تحليل وظائف الجينات والتخيل ولدت سيليا من تدفق السوائل في حويصلة كوبفر
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter