Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Cilia-genererte strømning i Kupffer sin Vesikkel (KV) styrer venstre-høyre mønster av sebrafisk embryo. Her beskriver vi en teknikk å modulere genfunksjon spesifikt i kV celler. I tillegg viser vi hvordan å levere fluorescerende perler inn KV å visualisere fluidstrømning.

Abstract

Indre organer som hjerte, hjerne, og gut utvikle venstre-høyre (LR) asymmetrier som er kritiske for sine normale funksjoner en. Bevegelige flimmerhårene er involvert i å etablere LR asymmetri i virveldyr embryoer, inkludert mus, frosk, og sebrafisk 2-6. Disse "LR cilia 'generere asymmetrisk væskestrømmen som er nødvendig for å utløse en konservert asymmetrisk Nodal (TGF-β superfamily) signaliserer cascade i venstre lateral plate mesoderm, som er tenkt å gi LR mønster for utformingen organer 7. Derfor, for å forstå mekanismene bak LR mønster, er det viktig å identifisere gener som regulerer organiseringen av LR ciliated celler, motilitet og lengden LR cilia og deres evne til å generere robuste asymmetrisk flyt.

I sebrafisk embryo, er LR flimmerhårene ligger i Kupffer sin vesikkel (KV) 2,4,5. KV består av et enkelt lag av monociliated epitelcellersom omslutter en væskefylt hulrom. Fate kartlegging har vist at KV er avledet fra en gruppe av ~ 20-30 celler kjent som dorsal forløperen celler (DFCS) som vandrer på dorsal blastoderm marginen under epiboly stadier 8,9. Under tidlig somitt stadier, til DFCS klynge og skille ut ciliated epitelceller danne KV i tailbud av embryoet 10,11. Evnen til å identifisere og spore DFCS-i kombinasjon med optisk åpenhet og rask utvikling av sebrafisk embryo-make sebrafisk KV en utmerket modellsystem for å studere LR ciliated celler.

Interessant, stamfedre av DFC / KV celle avstamning beholde cytoplasmatiske broer mellom eggeplomme celle opp til 4 timers post-fertilisering (HPF), mens cytoplasmatiske broer mellom eggeplomme celle og andre embryonale celler tett etter to HPF 8. Dra nytte av disse cytoplasmatiske broer, har vi utviklet en scene-spesifikk injeksjon strategi om å levere morfolino oligonucleotides (MO) utelukkende DFCS og knockdown funksjonen til en målrettet genet i disse cellene 12. Denne teknikken skaper kimære embryoer som gen-funksjon er slått ned i DFC / KV avstamning utvikling i sammenheng med en vill-type embryo. Å analysere asymmetrisk strømning i KV, injiserer vi fluorescerende mikroperler i KV lumen og ta perle bevegelse ved hjelp videomicroscopy 2. Fluidstrømmen er lett visualisert og kan kvantifiseres ved å spore perle fortrengning over tid.

Her, ved hjelp av scenen-spesifikk DFC målrettede genet knockdown teknikk og injeksjon av fluorescerende mikroperler inn KV å visualisere flyten presenterer vi en protokoll som gir en effektiv tilnærming for å karakterisere rollen av en bestemt gen under KV utvikling og funksjon.

Protocol

Oversikt over Stage-spesifikke sebrafisk embryo injeksjoner

Antisens Morpholino oligonukleotider (MO), som binder seg til en målrettet mRNA og forstyrre protein uttrykk fra at avskrift, er mye brukt i gene knockdown (tap-av-funksjon) studier i sebrafisk 13,14. Gene Tools, tilbyr LLC MOS som er merket med enten karboksyfluorescens (avgir grønn fluorescens) eller lissamine (avgir rød fluorescens) for å oppdage MO i injisert embryoer med fluorescerende mikroskopi. Ved å injisere MO i eggeplomme cellen i forskjellige stadier av zebrafisk utvikling, er det mulig å levere den MO til bestemte avdelinger av embryoet (Tall 1A-F). MO injisert i eggeplomme mellom 1-4 celle stadier (0-1 HPF) legger inn alle embryonale celler (Tall 1A, D, D ') via forbindelser med eggeplomme som vedvarer inntil 32-celle stadiet 15 å lette Global knockdown. MO injisert i eggeplomme under midblastUla stadier (2,5-3 HPF) kan gå inn forfedrene til de DFCS (Tall 1B, E, E ') sannsynlig gjennom cytoplasmatiske broer 8 og knockdown genfunksjon spesielt i DFC / KV celle avstamning 12, uten å angi de fleste andre embryonale celler linjene . Som en viktig kontroll for å teste om genfunksjon kreves DFC / KV eller også i eggeplomme 12,16, er det også mulig å begrense MO til eggeplomme celle ved injisering mellom dome-30% epiboly stadier (~ 4,5 HPF) etter alle cytoplasmatiske bruer har stengt (Tall 1C, F, F '). Disse injeksjoner har vært brukt i kombinasjon for å analysere genfunksjon i DFC / KV celler 17-24. Å vurdere strømning i KV, er fluorescerende mikroperler injisert i KV lumen mellom 6-10 somitt stadier (12-14 HPF) og deretter umiddelbart avbildet med videomicroscopy (Tall 1G-J). Mikroperler er tilgjengelig som avgir rødt eller grønt fluorescens (eller begge), så det er mulig å bruke forskjelligekanaler til bilde fluorescerende mikroperler og MO.

1. Stage-spesifikk Injeksjon av Morpholinos (MO)

Injeksjon av MO inn sebrafisk embryo har blitt demonstrert tidligere 25,26. Her beskriver vi kort scene-spesifikke MO injeksjoner. Etter alle injeksjoner, er embryo overføres til en petriskål og inkubert ved 28,5 ° C.

  1. Global MO injeksjon: Samle embryo umiddelbart etter befruktning og laste dem inn i en injeksjon plate. Laste fluorescerende MO inn en kapillær nål og monter nålen på en microinjector (f.eks Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor). Bryt nålespissen og justere injeksjon innstillinger (trykk og / eller tid) for å lage en injeksjon dråpe som har et volum på en nl som beskrevet 25,26. Ved hjelp av en dissekere stereomikroskop, injisere en nl av MO inn eggeplomme (figur 1A) av ≥ 50 embryoer per eksperiment. Arbeide raskt for å fullføre injeksjoner av 4-cellers hjorte.
  2. DFC-målrettet MO injeksjon: Samle embryo umiddelbart etter befruktning og inkuber ved 28,5 ° C. Når embryoene har nådd 256-celle stadiet (~ 2,5 HPF), raskt laste dem inn i en injeksjon plate og deretter injisere en nl av fluorescerende MO i eggeplomme av ≥ 100 embryo mellom 256-celle og 1000-celle etapper (Figur 1B).
  3. Eggeplomme-målrettet MO injeksjon: Samle embryo umiddelbart etter befruktning og inkuber ved 28,5 ° C. På dome scenen (~ 4 HPF), legger embryoene inn en injeksjon plate og deretter injisere en nl av fluorescerende MO i eggeplomme av ≥ 100 embryoer mellom kuppelen og 30% epiboly stadier (figur 1C).

2. Velge Injiserte embryo for analyse

  1. Når MO injisert embryo nå 75%-epiboly scenen (8 HPF), fjern ubefruktet og døde embryoer og deretter skjermen lever embryoer under et fluorescerende disseksjonsmikroskop for distribusjon av fluorescerende MO. Da allow valgt embryo å utvikle seg 28,5 ° C.
    1. For global MO injeksjoner, velger embryo som har fluorescens jevnt fordelt i hele alle embryonale celler (figur 1D, figur 2A).
    2. For DFC målrettede MO injeksjoner, velger embryoer hvor fluorescerende MO har diffundert gjennom eggeplomme og vises konsentrert ved dorsal blastoderm margin (DFCS) (figur 1E, Fig. 2B). På dette stadium, kan det være vanskelig å visualisere fluorescerende DFCS grunnet lyse fluorescens i den underliggende eggeplomme. Ta vare å ekskludere embryoer hvor fluorescerende MO har inkorporert i embryonale celler unntatt DFCS eller forblir aggregert ved injeksjonsstedet (figur 2D).
    3. For eggeplomme-målrettet MO injeksjoner, velger embryoer som MO fluorescens er jevnt fordelt over hele eggeplomme og ikke observert i noen embryonale celler (Figur 1F, Figur 2C). Igjen, fjern embryo der fluorescerende MO forbliraggregert på injeksjonsstedet.
  2. Mellom 2-4-somitt stadier (~ 11 HPF), skjermen embryoer en gang under et fluorescerende mikroskop med høyere forstørrelse. Så la utvalgte embryo for å utvikle seg 28,5 ° C.
    1. For globale MO injeksjoner, sikre valgte embryoer har MO fluorescens jevnt fordelt i KV og alle embryonale celler (figur 1D ', figur 2E).
    2. For DFC-målrettet MO injeksjoner, nøye velge embryo som har MO fluorescens bare i KV celler og eggeplomme (figur 1E '). Transgene embryoer som uttrykker GFP i KV celler, for eksempel Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, kan hjelpe til med identifisering av embryoer som MO har blitt levert til KV celler (figur 2F). Kast embryoer med MO fluorescens i embryonale celler andre som KV celler.
    3. For eggeplomme-målrettet MO injeksjoner, velger embryo som har MO fluorescens utelukkende i eggeplomme (Figur 1F ': Figur2G).

3. Montering Embryoer å analysere Væskestrøm i KV

  1. Å analysere asymmetrisk strømning i KV om global MO, DFC-målrettet MO eller eggeplomme målrettede MO injisert embryo, nøye dechorionate ~ 20 embryoer mellom 4-6 somitt stadier (~ 11-12 HPF) med skarpe tang.
  2. Forbered 50 ml 1% lavtsmeltende punkt agarose og alikvot i 5 ml rør skal opprettholdes som en væske i et tørt bad på 42 ° C.
  3. Overfør ett embryo til et glass depresjon lysbilde (United Scientific Supplies, Inc.) og fjerne så mye av vannet som mulig. Immobilisere embryoet ved å tilsette nok varm 1% lavtsmeltende punkt agarose å bare dekke embryoet (for mye agarose kan forstyrre påfølgende avbildning). Som agarose stivner, kan du bruke pinsett til å plassere fosteret slik at KV vender opp (dorsal visning) (figur 1 H). Montering av 10 embryo med ett embryo per lysbilde. Arbeide raskt å sikre alle injeksjoner i neste trinn er kompleted av 10 somitt scenen (14 HPF).

4. Injeksjon av Fluorescent mikroperler inn KV

  1. Fortynn Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 mikron diameter mikrokuler (Polysciences, Inc.) til 1:50 i sterilt vann i en 1,5 ml Eppendorf-rør.
  2. Bland 01:50 fortynning av mikroperler grundig ved å trykke røret og laste 3 pl i en kapillær nål. Bruke samme microinjector brukes til MO injeksjoner (f.eks Harvard Apparatus PLI-90 Pico-injektor), bryte nålespissen med pinsett og justere injeksjon innstillingene for å oppnå minst mulig (<0,5 nl) injeksjon drop.
  3. Under et disseksjonsmikroskop, samstemmes nålen med KV lumen av første montert embryo. Stikk nålen inn i lumen og injisere et lite volum (<0,5 nl) av perler (Figur 1G). En liten nålespissen og små injeksjonsvolum er avgjørende for å unngå skade KV.
  4. Injisere alt montert embryoer. Når et embryo har vært injected, en dråpe sterilt vann kan legges på toppen av agarose å hindre at den tørker ut. Løpet av injeksjonene vil perlene ofte hindre nålen åpningen. Dette krever igjen bryte nålespissen og justere injeksjonsvolum ved å modulere trykket eller tidsinnstillingen for mikroinjeksjon anordningen. Erstatt nålen hvis det blir sløv nok til å forårsake betydelige skader under injeksjon.
  5. Skjermen injiserte embryoer for vellykket levering av perler under en oppreist fluorescerende stoff mikroskop (f.eks Zeiss AxioImager M1) med en 20X objektiv. Først finne ut om KV strukturen er intakt med lysfelt belysning (Figur 1J), og deretter bruke fluorescens å observere perlene. Velg embryo som perler er til stede og beveges inne i KV lumen. Kast embryoer med KV skade eller ingen flytende perler i KV. Det er lett å gå glipp av KV og levere perler til nærliggende vev eller underliggende eggeplomme. Hvis vellykket, mount another 10 embryoer og gjenta injeksjonsprosedyren.

5. Visualisering og analyse av KV Væskestrøm

  1. For hver valgt embryo med perler inni KV, tilsett en dråpe sterilt vann til å dekke agarose og deretter observere KV under oppreist fluorescerende stoff mikroskop med en 63x vann dipping objektiv (figur 1I). Alternativt kan et dekkglass påføres for bruk med ikke-vann dipping mål og / eller invertert mikroskoper.
  2. Bruk en høyhastighets kamera montert på mikroskopet (f.eks Zeiss AxioCamHSm) å spille inn en 10 sek film. Spille både perlene ved hjelp av fluorescerende kanal (ca 70 bilder / sek) og KV lumen med en lysfelt eller differensial interferens kontrast (DIC) kanal.
  3. Å visualisere alle perle bevegelser over tid, importer filmen av fluorescerende perler i ImageJ programvare (gratis nedlasting på http://rsb.info.nih.gov/ij/ ) ennd skape en maksimal projeksjon av alle fluorescerende signaler i filmen. Å utføre den maksimale anslaget i ImageJ, klikk på "Bilete → Stacks → Z prosjektet." I "Z-prosjektet"-vinduet, projisere alle skiver med projeksjon type "Max intensitet". Dette bildet kan bli overlagret på en DIC bilde av KV der perler ble fotografert (Fig. 3A-B).
  4. Bevegelser enkelte perler kan spores ved hjelp ImageJ. En plugin ("Manuell sporing") kan lastes ned på http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Åpne den fluorescerende perler filmen i ImageJ og kjør Manuell sporing funksjonen. I vinduet på Manuell sporing, sjekk "show parametre" og inndataparameterne for "tidsintervaller" og "x / y kalibrering". Manuelt velge perler som forblir i fokusplanet av filmen i ≥ 50 bilder og deretter spore ≥ 5 perler per embryo. Banen og hastighet av hver perle er generert av the-programvare (Tall 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Stage-spesifikke MO injeksjoner gi en nyttig tilnærming å analysere genfunksjon i bestemte avdelinger av embryoet. Figur 1 viser et flytskjema over de injeksjon strategier benyttes for å teste genfunksjon i DFC / KV celler og hvordan å introdusere fluorescerende perler å visualisere fluidstrømning i KV. Fordelingen av fluorescerende MO i vellykkede stadium-spesifikke injisert embryoer er vist skjematisk i figurene 1D-F og i levende embryoer i Figur 2. En mislykket MO injeksjon, der MO forblir aggregert i eggeplomme cellen, er vist i Figur 2D.

Vellykket injisert embryoer-velges basert på lokalisering av fluorescerende MO-kan monteres på de 4-6 somitt stadier for levering av fluorescerende mikroperler i KV lumen (Tall 1G-H) for å analysere fluidstrømning. Videomicroscopy brukes til å registrere perle bevegelser i KV (Tall 1I-J), som kan analyseres kvalitativt (figur 3a-b) eller kvantitativt (Tall 3C-E) ved hjelp ImageJ programvare. I en kontroll embryo med normal flyt, følger perler urviseren baner som kan visualiseres ved å gjøre en maksimal projeksjon av fluorescerende bead posisjoner over tid (figur 3A), eller ved å spore individuelle perler over tid (figur 3C). For å demonstrere tap av samordnet flyt, injisert vi embryoer med MO til knockdown Rho kinase 2b (Rock2b), som vi tidligere har vist forstyrrer flyten 18. I Rock2b MO injisert embryo, perler bevege seg tilfeldig i KV (figur 3B, D). ImageJ programmet ble brukt til å beregne farten individuelle perle spor. Den gjennomsnittlige hastigheten av 5 perler fra kontroll og Rock2b MO embryoer er vist i figur 3E.

es.jpg "src =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Figur 1. Oversikt over scenen-spesifikk MO injeksjoner og microbead injeksjon i KV. (A) Injeksjon av fluorescerende MO (rød) i eggeplomme ved 1-celle stadiet for global distribusjon av MO hele embryoet. (B) DFC-rettet MO injeksjon på 512-celle stadiet å laste MO inn DFC / KV celler. (C) Yolk målrettet MO injeksjon på 30%-epiboly scenen for å begrense MO til eggeplomme. (DF ') Skjematisk fremstilling av fordelingen av fluorescerende MO (rød) i vellykket injisert embryoer på 75% epiboly scenen (D, E, F) og 6 somitt scenen (D', E ', F') etter scene- spesifikke injeksjoner. MO akkumuleres i DFC / KV celle avstamning når injisert i 512-celle stadiet (piler i E, E '), men ikke når injisert ved 30% epiboly (piler i F, F'). (G) Injeksjon av fluorescerende mikroperler (grønn) i KV lumen. (H) En propelllig montert embryo med KV (pil) vender opp for microbead injeksjon. (I) Imaging perler bevegelse i KV med en oppreist mikroskop. (J) Høy forstørrelse av en intakt KV lumen injisert med mikroperler. Embryonale stadier og embryo tegninger er basert på ref. 28.

Figur 2
Figur 2. Valg av embryoer etter scene-spesifikke MO injeksjoner. (AC) Eksempler på utvalgte embryoer på 75% epiboly stadiet (8 HPF) hvori fluorescerende MO (rød) enten har innarbeidet i alle embryonale celler følgende globale MO injeksjon (A), diffus gjennom eggeplomme og DFCS (pil) følgende DFC målrettede MO injeksjon (B) eller forble i eggeplomme etter eggeplomme målrettede MO injeksjon (C). (D) Eksempel på en utelatt embryo der fluorescent MO samlet på injeksjonsstedet. (EG) Eksempler på fluorescerende MO (rød) fordeling i utvalgte embryoer ved 4-somitt scenen (11,5 HPF). DIC bilder identifisere KV lumen (pil) i transgene Tg (Dusp6: d2EGFP) embryoer som uttrykker GFP i KV celler 27. I det globale MO injiserte embryo, ble MO observert i KV og alle omkringliggende celler (E). I DFC-målrettet MO injisert embryo, MO samlokalisert med GFP i de fleste KV celler og var også til stede i underliggende eggeplomme kjerner (F). I eggeplomme målrettede embryo, ble MO funnet utelukkende i eggeplomme kjerner (G).

Figur 3
Figur 3. Kvalitative og kvantitative analyser av strømning i KV. (AB) For kvalitativ analyse av flyt, en maksimal projeksjon av en 10 sek film som viser bevegelse av alle fluorescent mikroperler injisert KV er overlagret en DIC bilde av KV lumen i en global kontroll MO (A) eller Rock2b MO (B) injisert embryo. (CE) å kvantifisere flyt, bevegelse av individuelle mikroperler (n = 5) ble sporet i en kontroll embryo (C) og Rock2b MO injisert embryoet (D) og som brukes til å beregne et gjennomsnitt limstrengen hastighet (E). Circles (CD) omtrentlige KV lumen grenser. Feilfelt (E) representerer ett standardavvik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruke scene-spesifikke injeksjoner for å målrette MO til DFC / KV celle avstamning er en god metode for å studere celle-autonomi genfunksjon og unngå mitogen fenotyper forårsaket av global gene knockdown. Imidlertid kan disse injeksjonene være teknisk utfordrende. Injeksjon av MO mellom 256-celle og 1000-celle stadier kan resultere i tre mulige utfall: 1) MO forblir samlet på injeksjonsstedet, 2) Mo diffunderer gjennom eggeplomme og går DFC / KV celler eller 3) Mo diffunderer gjennom eggeplomme og inngår DFC / KV celler og andre embryonale celler. Derfor velger embryoer som MO har flyttet utelukkende til DFC / KV celler er et viktig steg i dette eksperimentet. Det er viktig å merke seg at MO kan laste inn alle DFC / KV celler men ofte går bare et delsett av disse cellene 10. Årsakene underliggende denne mosaikken målretting forblir uklar, men kan gjenspeile variasjon i hvor effektivt MO kjøres gjennom eggeplomme og / eller tidspunktet for stenging av individual broer mellom eggeplomme og DFC forfedre. Vi har ikke funnet forhold som øker målretting effektivitet, men heller ha stolt på å velge embryo som de fleste av KV cellene har tatt opp MO. Suksessraten for å generere embryoer med MO i de fleste DFC / KV celler er typisk ~ 20-30%, men dette kan være ganske variabel fra dag til dag. Av denne grunn anbefaler vi å injisere så mange embryoer som mulig (≥ 100), og deretter nøye velge embryoene som har riktig fordeling av fluorescerende morfolino.

Kontroll eksperimenter er viktig for å tolke resultatene av DFC-målrettede injeksjoner. Feiljustering MO eller standard negative kontroll MO (fra Gene Verktøy, LLC) skal brukes for å kontrollere for ikke-spesifikke virkninger. I tillegg, siden DFC målrettede injeksjoner leverer MO til både eggeplomme og DFC / KV celle avstamning (figur 2F), er det viktig å bestemme om fenotyper i disse embryoer er på grunn av tap av genet moroDette skjer i DFC / KV celler eller i eggeplomme cellen. Sammenligning fenotyper i DFC målrettede embryoer med eggeplomme målrettede embryoer (Tall 2F-G) vil identifisere DFC / KV celle-spesifikke rammer. Selvfølgelig, kan noen gener fungere i begge DFC / KV celler og eggeplomme 16. Selv om vi fokuserer av MO-medierte tap-av-funksjon analyser her kan DFC målrettede injeksjonsteknikk og tilknyttede kontrollforsøk brukes til å vurdere en gevinst-av-funksjon ved å injisere syntetisk mRNA til overuttrykker et bestemt protein i DFC / KV avstamning 17,22,24,29. En smart tilpasning av denne tilnærmingen som brukes DFC-målrettet mRNA injeksjoner for å redde global MO knockdown bare i DFC / KV celler 30. Imidlertid bør det bemerkes at ikke alle mRNAs injisert på denne måte resulterer i ekspresjon av det kodede protein i DFCS og KV celler og viktige kontroller bør inkluderes for å vurdere nivået av protein ekspresjon og distribusjon.

Vellykket levering av microbeads inn i KV lumen å vurdere asymmetrisk strømning avhenger injisere perlene på optimale stadier under den raske utviklingen av transient KV orgel. Vi begynner montering embryo på 4-6 somitt stadier (~ 12 HPF) og deretter injisere mikroperler inn KV opp til 10 somitt scenen (14 HPF). Før 4 somitt stadiet er lumen ofte for små til å injisere, og på senere stadier (> 10 somites) injeksjonen blir vanskelig på grunn av KV flytte dypere inn i embryo. En begrensning av denne teknikken er som krever KV lumen å ekspandere til en størrelse som kan være vellykket injisert med mikroperler. I tilfeller der MO knockdown av et bestemt gen alvorlig forstyrrer KV organisasjon og / eller senker KV lumen størrelse (gjennomgått i ref.. 31) vil det være vanskelig, om ikke umulig, å analysen flyt bruke denne tilnærmingen.

Ved utarbeidelsen embryoer for injeksjon av mikroperler i KV, er det viktig å montere embryoet rett langs embryonale akse med KV vendt opp (figur 1H), Kan som embryo posisjon påvirker vinkelen at nålen går KV og vinkelen av imaging perler i KV. Det er også viktig å bruke en liten diameter injeksjonsnål og små injeksjonsvolum på mikroperler å unngå skade KV. Vi anbefaler å trene for å utvikle en jevn injeksjon slag for å sette nålen inn i KV, slipper perler og deretter raskt trekke nålen fra embryo. Når forholdene er optimale, er vi i stand til å kunne levere mikroperler til ~ 50% (n = 5/10) av den injiserte embryoer.

I sammendraget, scene-spesifikke MO injeksjoner og visualisering av mikroperler i KV gi en mulighet til å studere funksjonen av kandidat gener i LR ciliated celler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Fiona Foley for utmerket lab støtte og sebrafisk omsorg. Dette arbeidet ble støttet en AHA predoctoral fellesskap å GW (11PRE5730027) og NHLBI tilskudd til HJY (R01HL66292) og JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Developmental Biology genetikk cellebiologi Neuroscience Molecular Biology bioteknologi biofysikk Cilia sebrafisk, Gene Knockdown Teknikker venstre-høyre asymmetri cilia Kupffer er vesicle dyremodell
Analyse av gen-funksjon og visualisering av Cilia-generert Væskestrøm i Kupffer sin Vesikkel
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter