Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Анализ функций генов и визуализации реснички, созданного потока жидкости в Vesicle Купфера

Published: March 31, 2013 doi: 10.3791/50038
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Cell and Developmental Biology, State University of New York, Upstate Medical University, 2Department of Neurobiology and Anatomy, Eccles Institute of Human Genetics, University of Utah

Summary

Реснички генерируемых потоков жидкости в Vesicle Купфера (KV) управляет левой-правой паттерна рыбок данио эмбрионов. Здесь мы описываем технику, чтобы модулировать функции гена в частности в КВ клеток. Кроме того, мы показываем, как доставить флуоресцентные шарики в KV для визуализации потока жидкости.

Protocol

Обзор этапа конкретным Инъекции эмбрионов данио рерио

Антисмысловые морфолино олигонуклеотидов (MO), которые связываются с целевой мРНК и нарушают экспрессию белка из этой стенограммы, которые широко используются в нокдаун гена (с потерей функции) исследования на рыбках данио 13,14. Гена Tools, LLC предлагает МО, помеченные как карбоксифлуоресцеина (испускает зеленая флуоресценция) или lissamine (испускает красная флуоресценция) для обнаружения MO вводят в эмбрионы с помощью флуоресцентного микроскопа. Вводя MO в клетку желток на разных стадиях развития рыбок данио, можно поставить MO конкретные отделения зародыша (рис. 1А-F). MO вводят в желтке между 1-4 ячейки этапа (0-1 HPF) входит во все эмбриональные клетки (рис. 1А, D, D ') по связям с желтком, которые сохраняются до 32-клеточной стадии от 15 до содействия глобальному нокдаун. MO вводят в желтке во время midblastула этапов (2.5-3 HPF) может войти в прародителями DFCs (рис. 1B, E, E '), вероятно, через цитоплазматические мостики 8 и функция нокдаун гена в частности, в DFC / KV клеточной линии 12, без ввода большинства других эмбриональных клеточных поколений . В качестве важного контроля для проверки функции гена требуется DFC / KV или же в желтке 12,16, это также можно ограничить MO к ячейке желток, вводя между куполом-30% эпиболии стадии (~ 4,5 HPF) после Все цитоплазматических мосты были закрыты (рис. 1С, F, F '). Эти инъекции были использованы в комбинации для анализа функции генов в DFC / KV клеток 17-24. Для оценки течения жидкости в КВ, люминесцентные микрошарики вводят в просвет между KV 6-10 сомитов этапов (12-14 HPF), а затем сразу отображаемого использованием видеомикроскопии (рис. 1G-J). Микрошарики доступны, которые излучают красный или зеленый цвет флуоресценции (или оба), так что можно использовать различныеканалы изображений флуоресцентных микросфер и МО.

1. Стадия конкретных Инъекции Morpholinos (MO)

Инъекции МО в эмбрионы рыбок данио было продемонстрировано ранее 25,26. Здесь мы кратко опишем стадию конкретных MO инъекций. После всех инъекций, эмбрионы переносят в чашку Петри и инкубировали при 28,5 ° C.

  1. Глобальная инъекции MO: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и загружать их в инъекции пластины. Загрузите флуоресцентные MO в капиллярных игл и установить иглу на микроинъектор (например, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-инжектор). Перерыв кончик иглы и настроить впрыск параметров (давления и / или времени), чтобы создать инъекции каплей, которая имеет объем 1 NL, как описано 25,26. Использование рассекает стереомикроскопа, вводят 1 NL МО в желток (рис. 1А) ≥ 50 эмбрионов в эксперименте. Работают быстро завершить инъекций по 4-элементной оленяе.
  2. DFC-целевых MO инъекций: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и инкубировать при 28,5 ° C. Когда эмбрионы достигли 256-клеточной стадии (~ 2,5 HPF), быстро загружать их в инъекции пластины, а затем вводят 1 NL люминесцентных MO в желтке ≥ 100 эмбрионов между 256-ячейки и 1000-клеточной стадии (Рис. 1В).
  3. Желток-целевых MO инъекций: Сбор эмбрионов сразу после оплодотворения и инкубируют при 28,5 ° C. На куполе этапе (~ 4 HPF), загрузить эмбрионов в инъекции пластины, а затем вводят 1 NL люминесцентных MO в желтке ≥ 100 эмбрионов между куполом и 30% эпиболии этапов (рис. 1С).

2. Выбор Injected эмбрионов для анализа

  1. Когда MO вводят эмбрионы достигают 75%-эпиболии этапе (8 HPF), удалить неоплодотворенные и мертвые эмбрионы, а затем экран живых зародышах под флуоресцентным микроскопом рассечение для распределения флуоресцентного МО. Тогда аллоW выбран эмбрионы развиваются в 28,5 ° C.
    1. Для глобальных MO инъекций, выберите эмбрионов, которые флуоресценции равномерно распределены в течение всего эмбриональные клетки (рис. 1D; рис. 2А).
    2. Для DFC-целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, в которых флуоресцентные MO была распространяется по всей желтком и, похоже, концентрируется на верхний край бластодерма (DFCs) (рис. 1E; рис. 2В). На данном этапе, это может быть трудно представить себе флуоресцентные DFCs из-за яркой флуоресценции в базовой желток. Позаботьтесь, чтобы исключить эмбрионов, в котором флуоресцентный MO включил в эмбриональных клетках, кроме DFCs или остается агрегируются в месте инъекции (рис. 2D).
    3. Для желтка целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, в которых MO флуоресценции равномерно распределены по всей желток и не наблюдается ни в эмбриональные клетки (рис. 1F, рисунок 2С). Опять же, удаления эмбриона, в котором флуоресцентный MO остаетсяагрегируются в месте инъекции.
  2. Между 2-4-сомитов стадии (~ 11 HPF), экран эмбрионов во второй раз под флуоресцентным микроскопом использованием большем увеличении. Тогда позвольте выбранные эмбрионы развиваются в 28,5 ° C.
    1. Для глобальных инъекции MO, обеспечить выбранный эмбрионы имеют MO флуоресценции равномерно распределены в КВ и все эмбриональные клетки (рис. 1D '; Рисунок 2E).
    2. Для DFC-целевых MO инъекции, тщательно выбрать эмбрионы, которые имеют MO флуоресценции только в КВ клетки и желток (рис. 1E). Трансгенные эмбрионы, которые выражают GFP в клетках КВ, таких как Tg (Dusp6: d2EGFP) 27, может помочь в идентификации эмбрионов, в которых MO был успешно доставлен на КВ клеток (рис. 2F). Откажитесь эмбрионов с MO флуоресценции в эмбриональных клеток других, что клетки КВ.
    3. Для желтка целевых MO инъекций, выберите эмбрионы, которые имеют MO флуоресценции исключительно в желтке (рис. 1F ": Рисунок2G).

3. Монтаж эмбрионов для анализа жидкости в KV

  1. Для анализа асимметричных потоков жидкости в KV глобального MO, DFC-целевых MO или желтком целевых MO вводят эмбрионы, тщательно dechorionate ~ 20 эмбрионов между 4-6 сомитов стадии (~ 11-12 HPF) с острыми щипцами.
  2. Подготовка 50 мл 1% низкой температурой плавления агарозы и аликвоты в 5 мл трубы, чтобы быть сохранены в виде жидкости в сухой ванне при температуре 42 ° C.
  3. Передача одного эмбриона на предметное стекло депрессии (United Научно Supplies, Inc) и удалить столько воды, сколько возможно. Остановите эмбриона, добавив достаточно теплым 1% низкой температурой плавления агарозы, чтобы только покрыть эмбриона (слишком много агарозы может помешать последующей визуализации). Как агарозном затвердевает, используйте щипцы для размещения эмбриона, что KV вверх (вид сверху) (рис. 1H). Установить 10 эмбрионов с одним эмбрионом на слайд. Работают быстро, чтобы убедиться, что все инъекции в следующем шаге, комплeted к 10 сомитов (14 HPF).

4. Инъекции Флуоресцентные микрошариков в KV

  1. Развести Fluoresbrite Multifuorescent 0,5 мкм диаметром микросфер (Polysciences, Inc) до 1:50 в стерильной воде в 1,5 мл трубки Эппендорф.
  2. Смешать 1:50 разбавление микрошарики тщательно, нажав на трубке и загрузить в 3 мкл капиллярной иглы. Используя тот же микроинъектор используется для МО инъекции (например, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-инжектор), разбить кончик иглы пинцетом и настроить впрыск настройки для создания минимально возможным (<0,5 п) раствор для инъекций капли.
  3. Под микроскопом рассечение, выровнять иглу с просветом KV первого установлены эмбриона. Вставьте иглу в просвет и вводить небольшого объема (<0,5 NL) из бисера (рис. 1Г). Небольшой совет иглы и небольшой объем впрыска имеют решающее значение для предотвращения повреждения КВ.
  4. Вводят всех подключенных эмбрионов. После того, как эмбрион был injecteд, капли стерильной воды могут быть добавлены в верхней части агарозы, чтобы предотвратить его от высыхания. В ходе инъекций, бусины часто препятствуют иглой отверстие. Это требует повторного нарушения иглы и регулировки объема впрыска путем модуляции давления или времени установки микроинъекции аппарата. Замените иглу, если она становится тупой достаточно, чтобы вызвать значительные повреждения во время инъекции.
  5. Экран вводят эмбрионы для успешной доставки из бисера под флуоресцентным микроскопом вертикальный соединения (например, Zeiss AxioImager M1) с использованием 20X цель. Во-первых, определить KV структура не повреждена использованием светлого освещения (рис. 1J), а затем с помощью флуоресценции для наблюдения за бусы. Выберите эмбрионы, в которых присутствуют бисером и перемещение внутри просвета кВ. Откажитесь эмбрионов с повреждением KV или нет плавающей бусины в КВ. Это легко упустить кВ и доставить бусины в близлежащие ткани или основной желток. В случае неудачи горе аноТам 10 эмбрионов и повторите процедуру инъекции.

5. Визуализация и анализ течения жидкости KV

  1. Для каждого выбранного эмбриона с бисером внутри К.В., добавить каплю стерильной воды, чтобы покрыть агарозы и затем наблюдать KV под флуоресцентным микроскопом вертикальный соединения с использованием 63x воды погружения цели (рис. 1Е). Кроме того, покровное может быть применена для использования с не-вода погружение целей и / или инвертированных микроскопов.
  2. Используйте высокоскоростные камеры, установленной на микроскоп (например, Zeiss AxioCamHSm) для записи 10 секунд фильма. Запишите как бусины помощью флуоресцентного канала (около 70 кадров / сек) и просвета KV использованием светлого или дифференциальный интерференционный контраст (DIC) канала.
  3. Чтобы визуализировать все движения шарика с течением времени, импортировать фильм флуоресцентные шарики в ImageJ программного обеспечения (скачать бесплатно на http://rsb.info.nih.gov/ij/ )ой создать максимальные проекции всех флуоресцентные сигналы в кино. Для выполнения максимальной проекции в ImageJ, нажмите кнопку "Изображение → стеки → Z проект". В "Z проекта" окна, проект все ломтики с проекционного типа "Max интенсивности". Это изображение можно наложить на изображение DIC КВ, в которой были обследованы бисера (рис. 3А-B).
  4. Движения отдельных бусин можно отслеживать с помощью ImageJ. Плагин ("Manual слежения") может быть загружен в http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html . Откройте флуоресцентные фильм бусины в ImageJ и запустить функцию ручного слежения. В окне Руководство слежения, установите флажок "Показать параметры" и входных параметров для "временных интервалов" и "X / Y калибровки". Ручной выбор бусин, которые остаются в фокальной плоскости фильм для ≥ 50 кадров, а затем отслеживать ≥ 5 бусин в зародыше. Путь и скорость каждого шарика порождается йэлектронной программного обеспечения (рис. 3 CD).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Стадия конкретных MO инъекции обеспечить полезный подход для анализа функции генов в конкретных отделениях эмбриона. Рисунке 1 представлена ​​блок-схема инъекций стратегии, используемые для тестирования функции генов в DFC / KV клеток и, как ввести флуоресцентных бусин для визуализации потока жидкости В КВ. Распределение флуоресцентных МО в успешном этапе конкретных вводят эмбрионы схематически показано на рис 1D-F и в живых эмбрионов на рисунке 2. Неудачной инъекции MO, в котором MO остается объединяются в ячейки желток, показан на рисунке 2D.

Успешно введены эмбрионы выбраны в зависимости от локализации флуоресцентной MO-может быть установлен на 4-6 сомитов этапах поставки флуоресцентных микросфер в KV просвета (рис. 1G-H) для анализа потока жидкости. Видеомикроскопии используется для записи движения шарика в КВ (рис. 1I-J), которая могут быть проанализированы качественно (рис. 3А-B) или количественно (рис. 3C-E) с использованием ImageJ программного обеспечения. В контрольной эмбриона с нормальным потоком, бисер последующей против часовой стрелки путей, которые могут быть визуализированы путем максимальной проекции флуоресцентные борта позиции с течением времени (рис. 3А) или путем отслеживания отдельные шарики с течением времени (рис. 3). Чтобы продемонстрировать потери скоординированного потока, мы вводили эмбрионов с МО в нокдаун Rho киназы 2b (Rock2b), который мы ранее показали, нарушает поток 18. В Rock2b MO впрыском эмбрионов, бисер двигаться в случайном порядке KV (рис. 3В, D). ImageJ программное обеспечение было использовано для расчета скорости отдельных шарик треков. Средняя скорость 5 бусин от контроля и Rock2b MO эмбрионов показано на рисунке 3E.

es.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50038/50038fig1.jpg "/>
Рисунок 1. Обзор этапе конкретных MO инъекций и Microbead инъекции в КВ. (Для инъекций) люминесцентных МО (красный) в желток на 1-клеточной стадии для глобального распространения МО по всему эмбриону. (B) DFC-целевых MO инъекции на 512-клеточной стадии, чтобы загрузить MO в DFC / KV клеток. (C) Желток-целевых MO инъекции в 30%-эпиболии этапе ограничиться MO в желтке. (DF) Схематическое изображение распределения флуоресцентного МО (красный) в успешно вводят эмбрионов на 75% эпиболии этапе (D, E, F) и 6 сомитов (D, E, F ') Следующий этап- конкретные инъекций. MO накапливается в DFC / KV клеточной линии при введении на 512-клеточной стадии (стрелки на Е, Е '), но не тогда, когда вводили на 30% эпиболии (стрелки на F, F'). (G) Введение флуоресцентных микросфер (зеленый) в просвет кВ. (H) опораerly установлен эмбриона с KV (стрелки) вверх по Microbead инъекций. (I) Imaging бисером движения в KV использованием прямой микроскоп. (J) Высокая увеличение просвета нетронутыми KV инъекции микросфер. Эмбриональной стадии зародыша и рисунки основаны на арт. 28.

Рисунок 2
Рисунок 2. Отбор эмбрионов после стадии конкретных MO инъекций. (AC) примеры выбранных эмбрионов на 75% эпиболии этапе (8 HPF), в котором флуоресцентный MO (красный) либо включены во все эмбриональные клетки после глобального инъекции MO (A), распространяется через желтком и DFCs (стрелка) после DFC ориентированную инъекции MO (B) или остались в желтке после желтка целевых MO инъекций (C). (D) Пример исключено эмбрион, в котором флуоресцентныйrescent MO агрегируются в месте инъекции. (EG) Примеры флуоресцентных МО (красный) распределение в отдельных эмбриона на 4-сомитов (11,5 HPF). DIC изображение определить KV просвет (стрелка) в трансгенных Tg (Dusp6: d2EGFP) эмбрионы, которые выражают GFP в клетках KV 27. В глобальном MO впрыском эмбриона, Миссури наблюдается в КВ и все окружающие клетки (E). В DFC-целевых MO впрыском эмбриона, МО совместно с GFP локализован в большинстве клеток КВ и также присутствует в ядрах, лежащих в основе желтка (F). В желтке ориентированных эмбриона, Миссури был найден исключительно в желтке ядер (G).

Рисунок 3
Рисунок 3. Качественный и количественный анализ течения жидкости в КВ. (AB) Для качественного анализа потока, максимальный выступ 10 сек фильм, показывающий движение всех fluorescных микросфер вводят в К. были наложены на изображение DIC КВ просвета в глобальной борьбе МО (A) или Rock2b МО (B) вводили эмбриона. (CE) Для количественной оценки потоков, движения отдельных микрочастиц (п = 5) был записан в управление эмбриона (C) и Rock2b MO вводили эмбриона (D) и используется для расчета средней скорости шарика (E). Круги (CD) приближенные KV просвет границ. Ошибка баров (E) представляют собой одно стандартное отклонение.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Использование стадии конкретных инъекций целевой MO к DFC / KV клеточной линии является полезным подходом к изучению клеточных автономии функции гена и избежать плейотропным фенотипа, вызванные глобальным нокдаун гена. Тем не менее, эти инъекции могут быть технически сложным. Инъекции MO между 256-ячейки и 1000-клеточной стадии может привести три возможных исхода: 1) МО остается агрегируются в месте инъекции, 2) МО диффундирует во всем желток и входит DFC / KV клеток или 3), MO диффундирует во всем желток и входит DFC / KV клеток и других эмбриональных клеток. Поэтому, выбирая эмбрионы, в которых MO переехал исключительно DFC / KV клеток является ключевым шагом в этом эксперименте. Важно отметить, что МО может загружать во все DFC / KV клеток, но часто попадает только часть этих клеток 10. Причины, лежащие в основе этой мозаики ориентации остаются неясными, но, возможно, отражает различия в том, насколько эффективно движется MO через желтка и / или сроков закрытия индividual мосты между желтком и DFC предшественников. Мы не нашли условия, которые повышают эффективность адресности, а полагаются на выбор эмбрионы, в которых большинство КВ клетки заняли МО. Шанс для создания эмбрионов с МО в большинстве DFC / KV клетки, как правило, ~ 20-30%, но это может быть весьма переменная со дня на день. По этой причине, мы рекомендуем инъекционных как много эмбрионов, насколько возможно (≥ 100), а затем тщательно подбирая эмбрионы, которые имеют соответствующее распределение флуоресцентных морфолино.

Контрольные эксперименты имеют жизненно важное значение для интерпретации результатов DFC-целевого инъекций. Несоответствие MO или стандартный отрицательный контроль MO (от Гена Tools, LLC) должны быть использованы для контроля за неспецифических эффектов. Кроме того, с DFC-целевого инъекций доставить MO как желток и DFC / KV клеточной линии (рис. 2F), важно определить, является ли фенотипов в этих эмбрионов в связи с потерей гена веселоие в DFC / KV клетках или в клетках желток. Сравнение фенотипов в DFC-целевого эмбрионов с желтком целевых эмбрионов (рис. 2F-G) будет определять DFC / KV ячейку конкретной влияет. Конечно, некоторые гены могут функционировать как в DFC / KV клетки и желток 16. Хотя мы ориентируемся МО-опосредованной потерей функции анализы здесь, DFC-целевой метод инъекции и связанные с ними контрольные эксперименты могут быть использованы для оценки избыточной функции путем введения синтетической мРНК сверхэкспрессировать частности белка в DFC / KV линии 17,22,24,29. Один умный адаптации этого подхода, используемого DFC-целевой мРНК инъекции, чтобы спасти глобальную нокдаун MO только в DFC / KV клеток 30. Тем не менее, следует отметить, что не все мРНК вводят таким образом результат в выражении кодируемого белка в DFCs и КВ клеток, и важные элементы управления должны быть включены для оценки уровня экспрессии белка и распределения.

Успешная доставка Microbeadа в KV просвет для оценки асимметричного потока зависит от инъекционного бисером на оптимальном этапах быстрого развития переходного органа кВ. Мы начинаем монтаж эмбрионов на стадии 4-6 сомитов (~ 12 HPF), а затем вводят в микрошарики кВ до 10-сомитов (14 HPF). До 4-сомитов, просвет часто слишком малы, чтобы придать, а на более поздних стадиях (> 10 сомитов) инъекции становится трудно из-за KV продвигались все дальше на эмбрион. Одним из ограничений данного метода является то, что требуется просвет KV расширить до размеров, которые могут быть успешно вводили микрошарики. В случаях, когда MO нокдаун конкретного гена серьезно нарушает KV организации и / или уменьшает просвет KV размер (в обзоре. 31) будет трудно, если не невозможно, для анализа потока с использованием этого подхода.

При подготовке эмбрионов для инъекции микросфер в КВ, важно установить эмбрион прямо вдоль оси с эмбриональными KV вверх (рис. 1H), Как эмбрион позиция может повлиять на угле, что игла входит кВ и угол изображения бусины в КВ. Важно также использовать малокалиберной иглы для инъекций и небольшой объем инъекции микросфер, чтобы избежать повреждения КВ. Мы рекомендуем практикующие развивать плавности хода инъекции, чтобы вставить иглу в КВ, отпустите шарики, а затем быстро отвести иглу из эмбриона. Когда условия являются оптимальными, мы можем успешно доставить микрошарики до ~ 50% (например, N = 5/10) вводимого эмбрионов.

Таким образом, стадия конкретных MO инъекций и визуализации микрошариков в KV предоставить возможность для изучения функций генов-кандидатов в LR ресничных клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Мы благодарим Фионы Фоли за отличную поддержку лаборатории и рыбок данио помощи. Эта работа была поддержана AHA predoctoral стипендии для GW (11PRE5730027) и NHLBI гранты HJY (R01HL66292) и JDA (R01HL095690).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Standard Control oligo-Lissamine tagged Gene Tools, LLC
Custom Rock2b morpholino oligo Gene Tools, LLC
Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 micron Microspheres Polysciences, Inc. 24054

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sutherland, M. J., Ware, S. M. Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus. Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).
  2. Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut. Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).
  3. Nonaka, S., et al. Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein. Cell. 95 (6), 829-837 (1998).
  4. Essner, J. J., et al. Conserved function for embryonic nodal cilia. Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).
  5. Kramer-Zucker, A. G., et al. Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis. Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).
  6. Schweickert, A., et al. Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus. Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).
  7. Tabin, C. J. The key to left-right asymmetry. Cell. 127 (1), 27-32 (2006).
  8. Cooper, M. S., D'Amico, L. A. A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation. Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).
  9. Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula. Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).
  10. Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).
  11. Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish. Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).
  12. Amack, J. D., Yost, H. J. The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry. Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).
  13. Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).
  14. Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. A primer for morpholino use in zebrafish. Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).
  15. Kimmel, C. B., Law, R. D. Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells. Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).
  16. Arrington, C. B., Yost, H. J. Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo. Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).
  17. Caron, A., Xu, X., Lin, X. Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle. Development. 139 (3), 514-524 (2012).
  18. Wang, G., et al. The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish. Development. 138 (1), 45-54 (2011).
  19. Aamar, E., Dawid, I. B. Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish. Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).
  20. Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia. Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).
  21. Schneider, I., et al. Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning. Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).
  22. Matsui, T., et al. Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).
  23. Shu, X., et al. Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning. Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).
  24. Esguerra, C. V. Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination. Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).
  25. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
  26. Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (27), e1113 (2009).
  27. Molina, G., et al. Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages. Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).
  28. Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
  29. Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning. Development. 135 (1), 75-84 (2008).
  30. Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish. Development. 138 (2), 291-302 (2011).
  31. Matsui, T., Bessho, Y. Left-right asymmetry in zebrafish. Cell Mol. Life Sci. , (2012).

Tags

Биология развития выпуск 73 генетики клеточной биологии неврологии молекулярной биологии биотехнологии биофизики реснички данио рерио, лево-правой асимметрии реснички Vesicle Купфера животной модели
Анализ функций генов и визуализации реснички, созданного потока жидкости в Vesicle Купфера
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D.… More

Wang, G., Yost, H. J., Amack, J. D. Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle. J. Vis. Exp. (73), e50038, doi:10.3791/50038 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter