GFP टैग या व्यक्ति में प्रोटीन autofluorescent संरचनाओं का जीना इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल<em> ड्रोसोफिला</em> Oocytes में वर्णित है.
ड्रोसोफिला oocyte cytoskeletal समारोह, सेल, संगठन और organelle संरचना और समारोह के रूप में मौलिक सवालों की जांच के लिए एक बहुमुखी प्रणाली के रूप में स्थापित किया गया है. विभिन्न GFP टैग प्रोटीन की उपलब्धता का मतलब है कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं मिनट या घंटे के कोर्स पर जीवित कोशिकाओं, और इस तकनीक का उपयोग करने में नजर रखी जा सकती है, RNP परिवहन, उपकला morphogenesis, और ऊतक remodeling जैसे प्रक्रियाओं महान विस्तार में वर्णित किया गया ड्रोसोफिला oocytes 1,2 में.
म्यूटेंट के एक अमीर प्रदर्शनों की सूची के साथ संयुक्त वीडियो इमेजिंग प्रदर्शन करने की क्षमता जीन और प्रक्रियाओं की एक विशाल विविधता अविश्वसनीय विस्तार में जांच करने के लिए अनुमति देता है. ऐसा ही एक उदाहरण ooplasmic स्ट्रीमिंग, की प्रक्रिया जो मध्य – oogenesis 3,4 में initiates है. Cytoplasmic vesicles के इस जोरदार आंदोलन microtubule और 5 kinesin पर निर्भर है और एक उपयोगी व्यवस्था प्रदान करता हैइन चरणों में cytoskeleton समारोह की जांच के लिए मंदिर.
मैं यहाँ रहने वाले वस्तुतः किसी भी confocal माइक्रोस्कोपी सेटअप का उपयोग oocytes के समय चूक इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं.
ड्रोसोफिला oocytes और कोशिकाओं और subcellular घटकों के समारोह में संगठन से संबंधित सवालों की एक किस्म को संबोधित करने के लिए एक बहुमुखी मॉडल व्यवस्था कर रहे हैं. प्रोटीन समारोह की पूरी समझ प्रोटीन व्यवहार के दोनों स्थानिक और लौकिक पहलुओं की निगरानी की आवश्यकता है. दोनों इमेजिंग सिस्टम और आनुवंशिक Drosophilists के लिए उपलब्ध उपकरण के क्षेत्र में अग्रिम लिए भी छोटे प्रयोगशालाओं में रहने वाले oocytes में उच्च गुणवत्ता इमेजिंग प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए यह संभव बनाते हैं. यहाँ मैं देर oogenesis कि आनुवंशिक पृष्ठभूमि की एक किस्म के साथ संयोजन के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है प्रोटीन समारोह की जांच के मध्य के दौरान GFP टैग या autofluorescent प्रोटीन और संरचनाओं के व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल रूपरेखा.
इस प्रोटोकॉल में मैं प्रक्रिया है जिसके द्वारा oocytes इमेजिंग और बुनियादी confocal सेटिंग्स कि फ्लोरोसेंट प्रोटीन और संरचनाओं के समय चूक वीडियो के अधिग्रहण सक्षम हो जाएगा के लिए तैयार कर रहे हैं का वर्णन करता है. अतिरिक्त detaioocyte तैयारी पर रास Weil एट अल द्वारा वर्णित हैं 6. एक मक्खी प्रोटीन है कि endogenously एक्सॉन फँसाने के माध्यम से टैग किया गया है व्यक्त उपभेदों की एक विस्तृत विविधता 8 उपलब्ध हैं, और असीम रूप से अधिक प्रोटीन वेरिएंट और इंजीनियर हो सकता है मक्खियों reintroduced.
जीवित ऊतक के साथ काम करने में, नमूनों की स्वास्थ्य सर्वोपरि महत्व का है. चरण 10B से अंडे कक्षों अनिवार्य रूप से एक स्वायत्त 11 फैशन में oogenesis को पूरा करने के लिए, उन्हें अल्पावधि इमेजिंग अध्ययन के लिए आदर्श बना सकते हैं. केयर कई महत्वपूर्ण कदम में लिया जाना चाहिए करने के लिए उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त कर सकते हैं. विच्छेदन के दौरान यह महत्वपूर्ण है संभव के रूप में छोटे रूप में अंडाशय और oocytes में हेरफेर, और विच्छेदन और इमेजिंग के पूरा होने के बीच समय की राशि को कम करने. आदर्श रूप में, एक छोटे से विच्छेदन स्टेशन है कि confocal गुंजाइश घरों में एक ही कमरे में स्थित होना चाहिए, और एक बार में केवल एक कुछ अंडे कक्षों imaged किया जाना चाहिए. यहाँ की सिफारिश (5-8) यह सुनिश्चित करता है कि विच्छेदन समय कम से कम है जबकि अच्छी गुणवत्ता की छवियों को प्राप्त करने की संभावना को अधिकतम. मैं छवियों की एक छोटी श्रृंखला पर कब्जा करने के लिए छवि गुणवत्ता का आकलन और पुष्टि करते हैं कि कब्जा सेटिंग्स अनुकूलित कर रहे हैं, एक लंबे समय चूक अनुक्रम कब्जा करने से पहले सलाह देते हैं. सबसे सॉफ्टवेयर व्यक्तिगत तख्ते बचाया जा करने की अनुमति देता है, और इन छवियों को तो 12 ImageJ या अन्य सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के तरीके की एक किस्म में विश्लेषण किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
NIH क्षेत्र कार्यक्रम से इस काम GM096076 अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |