En protokol til direkte billedvisning af GFP-mærkede proteiner eller autofluorescerende strukturer i de enkelte<em> Drosophila</em> Oocytter er beskrevet.
Drosophila oocyt er blevet oprettet som et alsidigt system til undersøgelse grundlæggende spørgsmål såsom cytoskeletal funktion, celle organisation, og organel struktur og funktion. Tilgængeligheden af forskellige GFP-mærkede proteiner betyder, at mange cellulære processer kan overvåges i levende celler i løbet af minutter eller timer, og anvendelse af denne teknik, har processer såsom RNP transport, epithelial morfogenese, og vævsremodellering blevet beskrevet meget detaljeret i Drosophila oocytter 1,2.
Evnen til at udføre video imaging kombineret med et rigt repertoire af mutanter gør en imponerende vifte af gener og processer, der skal undersøges med utrolige detaljer. Et sådant eksempel er processen med ooplasmic streaming, som begynder ved midten oogenesen 3,4. Denne energisk bevægelse af cytoplasmiske vesikler er mikrotubuli og kinesin-afhængig 5 og giver en nyttig sysmet til at undersøge cytoskeleton funktion på disse stadier.
Her vil jeg præsentere en protokol for tid bortfalder billeddannelse af levende oocytter bruger stort set alle konfokal mikroskopi setup.
Drosophila oocytter er et alsidigt model system til at tackle en række spørgsmål i relation til funktion og organisering af celler og subcellulære komponenter. En fuldstændig forståelse af protein funktion kræver overvågning af både rumlige og tidsmæssige aspekter af protein adfærd. Fremskridt i både billeddannende systemer og de genetiske værktøjer til rådighed for Drosophilists gør det muligt for selv små laboratorier til at udføre høj kvalitet billeddannelse eksperimenter i levende oocytter. Here I skitserer en protokol for at analysere adfærden af GFP-mærkede eller autofluorescerende proteiner og strukturer i midten og slutningen-oogenesen, der kan anvendes i forbindelse med en række forskellige genetiske baggrunde for at undersøge proteinfunktion.
I denne protokol I beskriver den proces, hvor oocyter bliver forberedt til billeddannelse og de grundlæggende konfokale indstillinger, der vil muliggøre køb af tidsforskydningen video af fluorescerende proteiner og strukturer. Yderligere Details på oocyt fremstilling er beskrevet af Weil et al. 6 En bred vifte af flyve stammer, der udtrykker proteiner, der er endogent mærket via exon-indfangning fås 8, og uendeligt mere proteinvarianter kan konstrueres og genindføres i fluer.
I arbejdet med levende væv, er sundheden af prøverne af afgørende betydning. Egg kamre fra scenen 10B kan udfylde oogenesen i en i det væsentlige autonom mode 11, hvilket gør dem ideelle til kortsigtede billeddiagnostiske undersøgelser. Der skal udvises forsigtighed ved flere vigtige skridt til at få data af høj kvalitet. Under dissektion er det vigtigt at manipulere æggestokke og oocyter så lidt som muligt, og for at minimere tidsrummet mellem dissektion og afslutningen af billeddannelse. Ideelt set skal en lille dissektion station placeres i det samme rum, der huser den konfokale omfang, og kun nogle få æg kamre ad gangen skal afbildes. Antallet anbefales her (5-8) Sikrer, at dissektion tid er minimeret samtidig maksimere sandsynligheden for at opnå god kvalitet billeder. Jeg anbefaler at fange en kort serie af billeder til at vurdere billedkvalitet og bekræfter, at capture indstillinger optimeres, før du tager en længere tid bortfalder sekvens. De fleste software giver de enkelte frames for at blive frelst, og disse billeder kan derefter blive analyseret i en række forskellige måder ved hjælp af ImageJ 12 eller anden software.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af tilskud GM096076 fra NIH AREA program.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |