En protokoll for direkte avbildning av GFP-merket proteiner eller autofluorescent strukturer i enkelte<em> Drosophila</em> Oocytter er beskrevet.
Drosophila oocyte er etablert som et allsidig system for å undersøke grunnleggende spørsmål som cytoskeletal funksjon, celle organisasjon, og organelle struktur og funksjon. Tilgjengeligheten av ulike GFP-merket proteiner gjør at mange cellulære prosesser kan overvåkes i levende celler i løpet av minutter eller timer, og bruker denne teknikken, har prosesser som RNP transport, epithelial morphogenesis og vev remodeling blitt beskrevet i stor detalj i Drosophila oocytter 1,2.
Evnen til å utføre video bildebehandling kombinert med et rikt repertoar av mutanter gir en enorm variasjon av gener og prosesser for å bli undersøkt med utrolige detaljer. Et slikt eksempel er prosessen med ooplasmic streaming, som initierer på midten oogenesen 3,4. Dette sprek bevegelse av cytoplasmatiske vesikler er microtubule og kinesin-avhengige 5 og gir nyttige system for å undersøke cytoskjelettet funksjon på disse trinnene.
Her har jeg samlet en protokoll for tidsinnstilte avbildning av levende oocytter med nesten alle konfokalmikroskopi oppsett.
Drosophila oocytter er et allsidig modell system for adressering en rekke spørsmål knyttet til funksjon og organisering av celler og subcellulære komponenter. En fullstendig forståelse av protein funksjon krever overvåking av både romlige og tidsmessige aspekter ved protein atferd. Fremskritt i både imaging-systemer og de genetiske verktøy tilgjengelig for Drosophilists gjør det mulig for selv små laboratorier for å utføre høy kvalitet imaging eksperimenter i levende oocytter. Her vil jeg skissere en protokoll for å analysere atferden til GFP-merket eller autofluorescent proteiner og strukturer under midten til slutten av oogenesen som kan brukes i forbindelse med en rekke genetiske bakgrunn for å sondere protein funksjon.
I denne protokollen beskriver jeg den prosessen som oocytter er forberedt for bildebehandling og de grunnleggende confocal innstillinger som vil gjøre kjøp av tid lapse video av fluorescerende proteiner og strukturer. Ytterligere details for oocytten forberedelse er beskrevet av Weil et al. 6 Et bredt utvalg av fly-stammer som uttrykker proteiner som er stemt endogent tagget via ekson-fangst er tilgjengelig 8, og uendelig mer protein varianter kan være konstruert og gjeninnføres til fluer.
I arbeidet med levende vev, er helsen til prøvene av overordnet betydning. Egg kamre fra scenen 10B kan fullføre oogenesen i en hovedsak selvstendig mote 11, noe som gjør dem ideelle for kortsiktige imaging studier. Care må tas ved flere viktige tiltak for å få data av høy kvalitet. Under disseksjonen er det viktig å manipulere eggstokkene og oocytter så lite som mulig, og for å redusere mengden av tid mellom disseksjon og ferdigstillelsen av bildebehandling. Ideelt sett bør en liten disseksjon stasjonen bli plassert i samme rom som huser confocal omfang, og bare noen få egg kamre gangen skal avbildes. Tallet anbefalt her (5-8) Sikrer at disseksjon tid er minimert samtidig maksimere sannsynligheten for å oppnå gode bilder. Jeg anbefaler å ta en kort serie med bilder for å vurdere bildekvaliteten og bekrefter at fangst innstillingene er optimalisert, før du tar en lengre tid lapse sekvens. Det meste av programvaren tillater individuelle rammer for å bli frelst, og disse bildene kan deretter bli analysert i en rekke måter ved hjelp av ImageJ 12 eller annen programvare.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av stipend GM096076 fra NIH AREA programmet.
Name | Company | Catalog number | Comments |
Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
#5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
Silicon grease | Sigma Aldrich | Z273554-1EA | |
Glass-bottom Petri dishes | MatTek | P35G-0-20-C |