Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם

doi: 10.3791/50047 Published: May 3, 2013

Summary

Autophagy היא תהליך בכל מקום שמאפשר לתאים לבזות ולמחזר חלבונים ואת האברונים. אנו מיישמים מיקרוסקופ פלואורסצנטי המתקדם כדי להמחיש ולכמת קטנים, אבל שינויים מהותיים, פיסיים הקשורים לאינדוקציה של autophagy, כולל הקמת וההפצה של autophagosomes וlysosomes, ומיזוגם בautolysosomes.

Abstract

סרטן הערמונית הוא הצורה המובילה של גידולים ממאירים בקרב גברים בארצות הברית בזמן ניתוח טומן בחובו סיכון משמעותי של חוסר אונים וחוסר שליטה, מסורתיים כימותרפיות גישות היו במידה רבה, לא הצליחו. טיפול הורמונלי הוא יעיל בשלב מוקדם, אבל לעתים קרובות לא מצליח עם ההתפתחות העתידית של גידולי הורמון עקשן. אנחנו כבר מתעניין בפיתוח תרופות למיקוד חסר מטבולי מסוימים של תאים סרטניים. לאחרונה הראינו כי תאים סרטניים בערמונית במיוחד חסרי אנזים (synthase argininosuccinate, או ASS) המעורבים בסינתזה של חומצת אמינו ארגינין 1. מצב זה גורם לתאים הסרטניים להיות תלוי בארגינין אקסוגני, והם עוברים לחץ מטבולי כאשר ארגינין החופשי תיגמר ידי ארגינין deiminase (ADI) 1,10. ואכן, יש לנו הראינו כי תאי ערמונית סרטניים אנושיים CWR22 RV1 נהרגים ביעילות על ידי עדי באפופטוזיס caspase-עצמאי וautopha האגרסיביGY (או macroautophagy) 1,2,3. Autophagy היא תהליך שימור אבולוציונית-המאפשר לתאים כדי לעכל חלבונים לא רצויים על ידי התמוטטות lysosomal במהלך רעב תזונתי 4,5. למרות המרכיבים החיוניים של מסלול זה הם מאופיינים היטב 6,7,8,9, היבטים רבים של המנגנון המולקולרי עדיין אינם ברורים - בפרט, מהו תפקידיו של autophagy במותו בתגובה של תאי סרטן ערמונית לאחר טיפול ADI ? על מנת לענות על שאלה זו, אנו נדרשים שיטת ניסוי כדי למדוד את הרמה וההיקף של תגובת autophagic בתאים - ומכיוון שאין סמנים מולקולריים ידועים במדויק יכול לעקוב אחר תהליך זה, בחרנו לפתח גישה מבוססת הדמיה, באמצעות מיקרוסקופיה 11,12. הקרינה 3D כמותית

שימוש בתאים CWR22Rv1 במיוחד שכותרתו עם בדיקות ניאון לautophagosomes וlysosomes, אנו מראים כי ערימות תמונת 3D רכשו עם או wiמיקרוסקופיה deconvolution defield (ומאוחר יותר, עם סופר רזולוציה, מיקרוסקופיה מובנה תאורה) יכולה ללכוד באופן ברור בשלבים הראשונים של האינדוקציה autophagy. עם יישומי ניתוח תמונה דיגיטליים זמינים מסחרי, אנחנו יכולים בקלות להשיג מידע סטטיסטי על מספר autophagosome ויזוזום, גודל, הפצה, ומידה מסוימת של colocalization מכל תא הדמיה. מידע זה מאפשר לנו לעקוב אחר ההתקדמות של autophagy בתאים חיים דווקא ומאפשר המשך החקירה שלנו לתוך התפקיד של autophagy בטיפול כימותרפי.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. חלק 1: תא תרבות וסימון חיסוני ניאון

  1. לגדול CWR22 RV1 תאים סרטניים בערמונית אדם על זכוכית coverslips (# 1.5 או עובי מיקרומטר 170) הוצב ב6 גם צלחות, עם RPMI (מדיאטק, VA) המכיל 10% בסרום שור עוברי (FBS) ו -1% פניצילין / סטרפטומיצין / גלוטמין.
  2. לגרום autophagy על ידי טיפול דגימות נבחרות עם ארגינין deiminase (ADI, 0.3 מיקרוגרם / מ"ל) שבנאגר מלוח פוספט (PBS).
  3. תקן תאים עם paraformaldehyde 4% (PFA, פישר סיינטיפיק, NH) מדולל PBS; 100 μl לכל coverslip, במשך 10 דקות ב RT.
  4. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
  5. Permeabilize תאים עם saponin 0.05% (Sigma, מיזורי) בHEPES (HBS) / BSA, 100 μl לכל coverslip, במשך 15 דקות ב RT.
  6. לפני חיסוני תיוג, דגימות בלוק עם 2.5% קזאין (Sigma, מיזורי) ברוורד / BSA, 100 μl לכל coverslip, לשעה 1 ב RT.
  7. דגירה תאים קבועים עם נוגדנים עיקריים מדוללים 2.5% קזאין / HBS / BSA, 100 μl לcoverslה-IP, O / N ב 4 ° C.
  8. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
  9. דגירה תאים קבועים עם נוגדנים משני מדולל 2.5% קזאין / HBS / BSA, 100 μl לכל coverslip, עבור שעה 1 ב RT.
  10. שטוף תאי 3x עם 1 מיליליטר HBS / BSA.
  11. הר coverslips הוכנה על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית רגילות עם זהב SlowFade או להאריך את מגיב זהב antifade (Invitrogen, CA) המכיל 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
  12. חותם קצות coverslip עם לק. לקבלת התוצאות הטובות ביותר הדמיה, לאפשר זמן (באופן אידיאלי O / N) לתקשורת אנטי לדעוך לחלחל יסודיות תאים.
  13. פני השטח coverslip נקיים עם מתנול ו / או כלורופורם.
  14. הוסף שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520 כאשר הדמיה על 37 מעלות צלזיוס, או 1.516 כאשר הדמיה ב RT) לעדשה האובייקטיבית 60x 1.42 NA (אולימפוס, יפן).
  15. שקופית עמדה על הבמה מיקרוסקופ ולהקים מוקד עם התאים של עניין.

2. חלק 2: הכנת תאים להדמית חיה

  1. לגדול CWR22 RV1 תאים המבטאים שרשרת ירוקה ניאון-חלבון בשילוב אור 3 (LC3-GFP) בתקשורת ובתרבות RPMI המכיל 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה על 35 מ"מ מנות תרבות פולי-D-ליזין מצופים זכוכית תחתונה (MatTek, MA). תאים צריכים להיות מצופה בצפיפות מספקת כדי להקל על התפשטות מהירה, אבל לא כל כך הרבה, כי תאים הם מגודל ופסע בכבדות על ידי הזמן של הדמיה.
  2. פנק את דגימות תאים שנבחרו עם עדי (0.3 מיקרוגרם / מ"ל) ב-PBS.
  3. כ 1 שעות לפני ההדמיה, לדלל 1.5 μl של 20 אדום DND-99 (Invitrogen, CA) עם Lysotracker מיליליטר RPMI. המכיל 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה. השתמש בפתרונות המכילים עדי לדגימות שנבחרו. חם בכל אמצעי התקשורת עד 37 מעלות צלזיוס לפני הוספה לצלחת התרבות.
  4. דגירה תאים עם RPMI המכיל Lysotracker האדום DND-99 עבור 15-45 דקות בשעה 37 ° C.
  5. כ -30 דקות לפני ההדמיה, הדלק את המתחם הסביבתי WeatherStation ולאפשר לאזן עד 37 ° C-CO 2 ו -5% (עם humidifאוויר IED).
  6. שטוף תאים עם PBS ולהחליף את התקשורת עם התקן RPMI המכיל רק 10% FBS ו -1% אנטיביוטיקה. הוסף לADI דגימות כפי שצוין.
  7. מנות מ"מ הר 35 coverglass-תחתונות התרבות במתאם מותאם אישית (Applied Precision, Inc, וושינגטון), ועמדה על הבמה מיקרוסקופ. השתמש בשמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי, ולמקם את המנה התרבות רכוב על הבמה.

3. חלק 3: מיקרוסקופית Deconvolution וניתוח

הפרוטוקול בסעיף זה מניח את השימוש במיקרוסקופ DeltaVision האישי DV deconvolution והנלווה SoftWorX יישום החבילה (Applied Precision, Inc, וושינגטון).

  1. הפעל מערכת מיקרוסקופ, כולל תחנת עבודה ורכישת בקר מכשיר. פתח את יישום Resolve3D כדי לאתחל את הבמה מיקרוסקופ והפעל את מקור אור קסנון. לאפשר 10 דקות למקור אור כדי להתחמם ולהגיע לתנאים יציבים.
  2. הוסףטיפה של שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.520 עבור דגימות חיות ב 37 מעלות צלזיוס או 1.516 לדגימות קבועות ב RT) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי, ודגימת שקופית מרכז (כיסוי פנים להחליק למטה) על פני העדשה האובייקטיבית.
  3. או באמצעות תאורה בהירת שדה או חיצונית ולהתמקד גס ידית כוונון, להעלות לאט עדשה האובייקטיבית עד חרוז שמן טבילה יוצר קשר עם מכסה זכוכית ההפוכה. (מנקודה זו, שכבת התאים צריכה לבוא אל מוקד תוך כמה סיבובים של קנס המיקוד להתאים ידית). כאשר עובדים עם דגימות קבועות על השקופיות, מומלץ להימנע מתאים בתוך או בקרבת אזורים עם כל בועות. בעת צפייה בשידור חי בדגימות עם צלחת זכוכית התחתונה, להימנע מהזזת העדשה האובייקטיבית מחוץ לגבולות של coverslip הזכוכית.
  4. יכול להיות מזוהה על ידי Autophagosomes eGFP אות (ירוק). Lysosomes מזוהה על ידי Lysotracker האדום (מדגם חי) או נוגדני ניאון אנטי Lamp1 (מדגם קבוע). גרעין תא מזוהה על ידי DAPI staining (מדגם קבוע).
  5. בחר תחום רצוי של נוף. באופן אידיאלי, תאים צריכים להפגין אות ניאון טובה בכל הערוצים המתאימים, ומספיק מחוברים ופרושים על פני השטח coverslip כך שהתוכן תאיים הם קל לדמיין. התאמות קטנות ברוחב X, Y ו-Z-מיקוד יכולות להיות נשלטו על ידי מחשב באמצעות ממשק Acquire3D. הגדר binning ל1x1 או 2x2, תלוי תחום רצוי של צפייה (ניתן לראות יותר תאים בתחום כאשר binning מוגדר 2x2).
  6. לתמונת נתונה דרך הבטן של תא, להגדיר את הפרמטרים חשיפה (למשל% עוצמת שידור וזמן חשיפה) כאלה שעוצמת פיקסל המקסימלי אינה עולה על 3,000 סעיפים. באופן כללי,% הולכה צריכה להיות מוגדרת נמוך ככל האפשר, מבלי להעלות את זמן החשיפה המקביל מעל 1 שניות. חזור על תהליך עבור כל צבע פלואורסצנטי להיות צילמו ועבור כל שדה נפרד של נוף כדי לקבל את התמונות באיכות הגבוהות ביותר.
  7. הגדר את upper ותחתונים גבולות של Z-המחסנית על ידי התאמת ההתמקדות רק מעט מעל החלק העליון והתחתון של מדגם התא, בהתאמה. המספר הכולל של תמונות בניתן Z-מחסנית יהיה ובכך ייקבע על ידי מגבלות אלה ועל ידי המרווח בין שכבות (ערך ברירת מחדל: 0.2 מיקרומטר).
  8. כדי למזער את ממצא תנועה במהלך רכישת תמונה, אנו ממליצים שנגדיר את המצב לרכישת התמונה "אורך גל אז Z-מחסנית" לדגימות קבועות, ו" Z-מחסנית אז אורך גל "לדגימות חיות.
  9. תמונות הקרינה הם deconvolved באמצעות SoftWorX (יישומי Precision, וושינגטון) ולאחר מכן נותחו באמצעות Volocity (אימפרוביזציה, החברה פרקין אלמר, MA).

4. חלק 4: סופר רזולוציה, מיקרוסקופית מובנה תאורה (OMX)

הפרוטוקול בסעיף זה חל על השימוש במיקרוסקופ התאורה מובנית OMX (יישומי Precision, וושינגטון).

  1. הפעל את כוח העיקרי ולייזרים רצויים (410 ננומטר, 488 ננומטר, ו / או 532 ננומטר). חכה ל20 ק"מn ללייזרים שהתייצבו תרמית.
  2. הוסף שמן טבילה (מקדמת שבירה 1.516 עבור דגימות קבועות ב RT) על עדשת 60x 1.42 NA האובייקטיבי. אם בועות נראות בטיפת השמן, לנקות האובייקטיבי ולהוסיף שמן שוב.
  3. הנח שקופיות מדגם על הבמה ובמידת צורך, לאפשר 10 דקות לתאים להתיישב על coverslip.
  4. לאתחל את תכנית הרכישה. השתמש בתאורת הקרינה כדי להתאים את הפוקוס עד שניתן לראות קווי המתאר חדים של התא. (יש להקפיד בכל העת כדי לצמצם את החשיפה של תאים לעירור הקרינה, ועד לרכישת התמונה בפועל).
  5. ניתן לרכוש סריקת פסיפס ספירלה לצפות בתצוגה מקדימה של אזורים גדולים יותר המדגם לבחור תאים או אזורים של עניין. מומלץ להשתמש בזמני חשיפה קצרים (1-10 אלפיות שנייה) ואת כוח עירור נמוך (0.1-1% העברת) בזמן סריקת המדגם או מציאת מטרות.
  6. זהה autophagosomes על ידי הקרינה ה-GFP-LC3. זהה lysosomes ידי Alexa פלואוריד 555 אנטי LAMP(חלבון קרום יזוזום הקשורים) וגרעין תא באמצעות DAPI (דגימות קבועות).
  7. בחר תנאי ניסוי כולל גל עירור, שטח תמונה (לדוגמא 512x512), עובי מחסנית, זמן חשיפה, ואחוז ההולכה לייזר. לקבלת תמונות סופר נפתרו, ודא שאפשרות התאורה מובנית מופעלת. למיקרוסקופיה deconvolution על OMX, בחר את אפשרות התאורה הקונבנציונלית.
  8. לקבלת התוצאות הטובות ביותר לשיקום, בחר תנאי ניסוי כאלה שספירת עוצמתו המרבית היא בין 10,000 ל -15,000 במהלך הרכישה. אם photobleaching הוא דאגה, ניתן להשתמש בהדמיה בחשיפה נמוכה (ספירה בין 5,000 ל 10,000). באופן אידיאלי, את הספירות לא צריכים להפחית יותר מגורם של שתיים במהלך כל הרכישה, ויש להימנע מירידות של יותר מגורם של ארבע. במידת צורך, להפחית את עובי הערימה כדי להבטיח ספירת העצמה מתמשכת. המצלמה מרווה ב64,000 ספירה, אז מקסימום באף פעם לא צריכה דריכות תעלה על זה. לקבלת דוגמיות טובה, מצאנו את תנאי הניסוי להיות 10 ~ 50 בזמן החשיפה אלפיות שני עם 1% שידור בלייזר. דגימות בהירות וphotostable שניתן הדמיה שוב ושוב עדיפות. כתם יציב נדרש לזמן לשגות, תמונות נפתרו העל.
  9. כדי להפחית את הרעש, מהירות קריאת נתונים 95MHz (אפשרות מהירות בינונית) וזמן רכישה של 2 אלפיות שני או יותר מומלץ. חפצים מוגברים מתקבלים בהדמיה המשוחזרת, כאשר המדגם נע במהלך הרכישה. בשל השפעה זו, חשיפות קצרות מומלצות לתאים שאינם חסיד או הנעים במהירות.
  10. הדמיה רבת ערוצים יכולה להתבצע בו זמנית או ברצף. בין דיבורים תשואות מצב רציפים והוא פחות וכך מומלץ.
  11. כדי להפחית photobleaching, זה מומלץ בדרך כלל לתמונה עם אורכי גל ארוכים יותר עירור ראשון (532 ננומטר, 488 ננומטר, ולאחר מכן 410 ננומטר). עם זאת, לתוצאות הניסוי שמוצגות באיור 3, צו זה היה הפוךד (ננומטר כלומר 48, 532 ננומטר ו 410 ננומטר) בשל photostability של מדגם המסוים הזה.
  12. הגדר את הגבול העליון / התחתון של Z-המחסנית על ידי הזזת הבמה מיקרוסקופ עד שהחלק העליון / התחתון של התאים הוא קצת מחוץ לפוקוס. המרחק הרצוי בין כל תמונה צריך להיות מוחזק קבוע ב0.125 מיקרומטר לסופר רזולוציה הדמיה, כתוכנה שיחזור לקחת את הערך הזה כברירת מחדל.
  13. לשחזר ערימות תמונה באמצעות SoftWorX (יישומי Precision, וושינגטון) ולנתח באמצעות Volocity 6.0 (פרקין אלמר, MA).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

רצף התמונות שמוצג באיור 1 מציג את השינויים הפיסיים המתרחשים בתאים במהלך CWR22 80 דקות הראשונה של האינדוקציה autophagy. בזה ומחקרים אחרים (לא מוצג) באופן עקבי ציינו: (1) תזוזה של הגרעין ממרכז התא; (2) הפחתה של נקודות מוקד הדבקה, וכן (3) טרנסלוקציה הכללית של autophagosomes וlysosomes לכיוון המרכז תא. בנוסף, אנחנו גם נצפו עלייה קטנה בcolocalization (מסומן בצהוב) בין autophagosomes (ירוק) וlysosomes (אדום), בנקודות זמן מאוחר יותר.

כהפגנה של cytometry מבוססת תמונה, השתמשנו Volocity ההדמיה הדיגיטלית יישום החבילה (גרסת 6.0, אימפרוביזציה / פרקין אלמר) לזהות, לספור, ולאסוף נתונים סטטיסטיים על autophagosomes וlysosomes שכותרתו בתמונות של CWR22 תאים שמוצגים איור 1. כפי שמוצג על ידי התרשימים באיור 2, המספר והגודל של לאהוא autophagosome (לאחר היווצרות והמראה הראשוני שלהם) לעשות להשתנות עם זמן: אחרי 80 דקות של השראת autophagy, חלה ירידה הדרגתית אך נקי במספר autophagosomes (איור 2 א) במקביל לגידול בגודל הממוצע של autophagosomes ( איור 2). בנוסף, חלה עלייה בmeasureable colocalization של autophagosomes וlysosomes, המבוססת על ניתוח מקדם המתאם של פירסון (איור 2 ג). יחדיו, ממצאים אלה הציעו כי על גירוי של autophagy, autophagosomes קטן רב הפתיל כדי ליצור autophagosomes גדול יותר לאורך זמן (איור 2 ד). בעוד איורים 1 ו -2 באו לידי ביטוי בתוצאות מחקר רק הדמיה יחידה, ויותר ניתוח כמותי קפדני, יהיה הצורך להסיק מסקנה ברורה, זה לא להמחיש את התכונות ויתרונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותית. אנחנו משתמשים בטכניקה זו באופן פעיל בouהחקירה של המנגנון והתהליך המולקולרי של autophagy הסלולרית R המשך.

איור 3 א מציג השוואת Side-by-צד של תמונות שנרכשו ושוחזרו ב DV מצב (המדומה widefield deconvolution, משמאל) לעומת מצב מובנה תאורה באמצעות מיקרוסקופ OMX (מימין). רזולוציה רוחב שופרה לעד 120 ננומטר, הרזולוציה כפולה של מיקרוסקופיה העקיפה מוגבלת הקונבנציונלית 14,15. colocalization בקנה מידה קטן של autophagosomes וlysosomes (איור 3, מסומנים בחצים) היו נראה בבירור עם מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ואילו הם היו בקושי ניכרו בדימות פלואורסצנטי הקונבנציונלית.

אחד היתרונות של שימוש מיקרוסקופית Deconvolution הוא לשחזר את כל התמונות למודל 3D שיחשוף מידע מרחבי מדויק יותר בין מולקולות שונות. סרט 1 מציג תמונה כוללת של CWR22 RV1 תא undergoiautophagy ng בשלב מאוחר יותר, שבו כמות משמעותית של colocalization בין autophagosome ויזוזום מתחילה להתרחש. מכתים דואר cadherin (כפי שמצוין בצבע לבן) חושף את קווי המתאר של תא המטרה. בסרט 2, הדגם המשוחזר 3D מספק פרטים מרחביים יותר של האיחוי בין autophagosomes וlysosomes (כפי שמצוין בצבע צהוב). אנו יכולים לראות בבירור את האינטראקציה בין LC3 אותות ירוקים ואותות יזוזום אדומים, ואת המיזוג של שני האותות כדי לייצר אותות צהובים.

איור 1
איור 1. זמן לשגות תמונות של CWR22 RV1 תאים שטופלו עם עדי. רצף תמונה מראה CWR22 RV1 תאים שטופלו עם עדי עבור 80 דקות. (2D תמונות המתקבלות מערימות תמונה מקוריות ידי הקרנת Z המרבית). מה עלי לעשותקו מקווקו ITE מייצג את קווי המתאר של התא, ובאזור האור המוצל מייצג את עמדתו של הגרעין.

איור 2
איור 2. ניתוח סטטיסטי. מגמות סטטיסטיים שהוצאו על ידי ניתוח רצף התמונות מוצגים באיור 1 כהפגנה שנתוני התמונה הוא כימות. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3
איור 3. הפצת Autophagosome ויזוזום בתא. א למעלה) Side-by-צד השוואה של תמונות שנרכשו ושוחזרו ב DV מצב (המדומה widefield deconvolution, משמאל) ומצב מובנה תאורה באמצעות מיקרוסקופ OMX (מימין). בר סולם מייצג 5 מיקרומטר. ב ' תחתון) colocalization קטן בקנה המידה של autophagosomes וlysosomes (מסומן בחצים).

סרט 1 וסרט 2. שחזור 3D של CWR22 Autophagy RV1 הסלולרי עובר. סרט זה ממחיש אינדוקציה autophagy נורמלית לאחר טיפול ADI. Z-מחסנית תמונות שוחזרו למודל 3 ממדים. סרט זה נוצר על ידי החלפה של התא 360 מעלות אופקית ואנכי של 360 מעלות. אות ירוק מייצג LC3, אות אדומה מייצגת יזוזום, אות לבנה מייצגת E-cadherin, ואות כחולה מייצגת את הגרעין. לחץ כאן לצפייה בסרט 1 או= "_blank"> לחץ כאן לצפייה בסרט 2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תוך ההתבוננות הישירה של תאים שכותרתו עם בדיקות ניאון נגד LC3 מקובל כשיטת סטנדרטית כדי לאשר תגובת autophagic 6, ההדמיה 3D הכמותי של אותה המערכת (כפי שעשינו) מספק מידע ופירוט חסר תקדים על התהליך המורכב של הסלולר autophagy . בפרט, אנו צופים כי מאות (אם לא אלפי) של autophagosomes בתאים חיים נוצרים בתוך 80 דקות של השראת autophagy. באופן דומה, אנו רואים שינויים מורפולוגיים מעניינים מאוד בחלוקת תאי lysosomal במהלך האינדוקציה autophagy. בתוך תא נתון, הירידה במספר autophagosome ואת הגידול המקביל בגודל הממוצע שלהם לאורך זמן, עולה כי autophagosomes לגדול על ידי מיזוג אחד עם השני, לפני ששילוב עם lysosomes לautolysosomes הטופס. דימות פלואורסצנטי 3D ברזולוציה גבוהה של תאי חיים מאפשרת לנו לחקור אם autophagosomes חייבת להגיע befor גודל קריטיתפיוזינג דואר עם lysosomes, או אם autophagy יכולה להמשיך פשוט בגודל פיזי קטן יותר. ואכן, בהתחשב במספר קטן מאוד autophagosomes שמופיעים עם הפעלה מוקדמת רק בגבול הרזולוציה של מיקרוסקופ deconvolution, והרבה יותר ברור נפתר על המיקרוסקופ מובנה התאורה 13 OMX, זה יכול להיות במקרה שחלק הארי של פעילות autophagic למעשה מתרחש ברמה זו.

היכולת לעקוב אחר תאים חיים במהלך autophagy היא חשובה וקריטית, שכן שינויים במספר והגודל של autophagosomes בתא נתון יכולים להיות קטנים, יחסית לווריאציות של פרמטרים אלה מתא לתא. על ידי לימוד תא בודד, חיים לאורך זמן - אנחנו יכולים להיות יותר בטוחים שהשינויים מורפולוגיים שאנו רואים הם תוצאה של תנאי ניסוי שונים, ולא סטטיסטי.

לבסוף, עם סמנים מולקולריים ספציפיים, אנחנו יכולים להחיל שיטות הדמיה אלה ללמודהיווצרות המוקדמת של autophagosomes, כדי להתחקות אחר המקור לממברנות autophagosomal, ולזהות אברונים אפשריים ו / או רכיבים תאיים שכבר הציפו באופן ספציפי בautophagosomes במהלך האינדוקציה autophagy. כמו כן, אנו מקווים כי גישה זו תאפשר לנו לחקור את תפקידו של autophagy בתא הישרדות ומוות של תאים, ולאפיין טובים יותר את ההשפעות של תרופות ומעכבים על autophagy פוטנציאליות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

תמיכת גרנט: NIH CA165263, NIH CA150197, NIH CA150197S1 (HJ קונג), NIH CA150197S1 (ע"א Changou), מרכז-0,120,999 PHY NSF Biophotonics מדע וטכנולוגיה (DL וולפסון, FYS צ'ואנג), DOD PC073420 (RJ מודגש), המחקר המועצה של נורבגיה, Leiv Eiriksson מסעות גרנט 209286/F11 (BS Ahluwalia). HJ קונג גם מכיר בתמיכת קרן אובורן קהילת סרטן הקרן. RJ מודגש גם מכיר את תמיכתה של מקדונלד 'ס י הקדש.

אנו מודים לד"ר ג'ני ויי-ג'ן קונג וד"ר בור ון וו בDesigneRx לאספקה ​​נדיבה של עדי.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Arginine Deiminase (ADI) DesigneRx
HEPES Sigma H4034
Casein Sigma C5890
Paraformaldehyde Fisher 4042
Saponin Sigma S4521
Alexa anti-mouse 555 Invitrogen A21422
Alexa anti-rabbit 647 Invitrogen A21244
LysoTracker Red DND-99 Invitrogen L7528
anti-Lamp1 DSHB H4A3
anti-Cadherin Cell Signaling #3195
SlowFade Gold Invitrogen S36936
35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate MatTek P35GC-1.5-1.4-C
No.1, 22 mm coverslip Corning #2865-22
Microscope slides Globe Scientific 1324G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Kim, R. H., Coates, J. M., Bowles, T. L., McNerney, G. P., Sutcliffe, J., Jung, J. U., Gandour-Edwards, R., Chuang, F. Y., Bold, R. J., Kung, H. J. Arginine deiminase as a novel therapy for prostate cancer induces autophagy and caspase-independent apoptosis. Cancer Res. 69, (2), 700-708 (2009).
  2. Miyazaki, K., Takaku, H., Umeda, M., et al. Potent growth inhibition of human tumor cells in culture by arginine deiminase purified from a culture medium of a Mycoplasma-infected cell line. Cancer Res. 50, 4522-4527 (1990).
  3. Takaku, H., Matsumoto, M., Misawa, S., Miyazaki, K. Anti-tumor activity of arginine deiminase from Mycoplasma argini and its growth-inhibitory mechanism. Jpn. J. Cancer Res. 86, 840-846 (1995).
  4. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Dev. Cell. 6, 463-477 (2004).
  5. Mizushima, N., Levine, B., Cuervo, A. M., Klionsky, D. J. Autophagy fights disease through cellular self-digestion. Nature. 451, 1069-1075 (2008).
  6. Kabeya, Y., Mizushima, N., Ueno, T. LC3, a mammalian homologue of yeast Apg8p, is localized in autophagosome membranes after processing. EMBO J. 19, 5720-5728 (2000).
  7. Pattingre, S., Espert, L., Biard-Piechaczyk, M., Codogno, P. Regulation of macroautophagy by mTOR and Beclin 1 complexes. Biochimie. 90, 313-323 (2008).
  8. Maiuri, M. C., Criollo, A., Tasdemir, E., et al. BH3-only proteins and BH3mimetics induce autophagy by competitively disrupting the interaction between Beclin 1 and Bcl-2/Bcl-X(L). Autophagy. 3, 374-376 (2007).
  9. Crighton, D., Wilkinson, S., O'Prey, J., et al. DRAM, a p53-induced modulator of autophagy, is critical for apoptosis. Cell. 126, 121-134 (2008).
  10. Dillon, B. J., Prieto, V. G., Curley, S. A., et al. Incidence and distribution of argininosuccinate synthetase deficiency in human cancers: a method for identifying cancers sensitive to arginine deprivation. Cancer. 100, 826-833 (2004).
  11. Dale, B. M., McNerney, G. P., Thompson, D. L., et al. Cell-to-cell transfer of HIV-1 via virological synapses leads to endosomal virion maturation that activates viral membrane fusion. Cell Host & Microbe. 10, (6), 551-562 (2011).
  12. Cogger, V. C., McNerney, G. P., Nyunt, T., et al. Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations. J. Struct. Biol. 171, (3), 382-388 (2010).
  13. York, A. G., Parekh, S. H., Nogare, D. D., et al. Resolution doubling in live, multicellular organisms via multifocal structured illumination microscopy. Nat. Methods. 9, (7), 749-754 (2012).
  14. Gustafsson, M. G. L. Surpassing the lateral resolution limit by factor of two using structured illumination microscopy. Journal of Microscopy. 198, 82-87 (2000).
  15. Shao, L., Kner, P., Rego, E. H., Gustaffson, M. G. Super-resolution 3D microscopy of live whole cells using structured illumination. Nat. Method. 8, (12), 1044-1046 (2011).
ניתוח כמותי של Autophagy באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי 3D מתקדם
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).More

Changou, C. A., Wolfson, D. L., Ahluwalia, B. S., Bold, R. J., Kung, H. J., Chuang, F. Y. S. Quantitative Analysis of Autophagy using Advanced 3D Fluorescence Microscopy. J. Vis. Exp. (75), e50047, doi:10.3791/50047 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter