Summary
细胞自噬是一个无处不在的进程，使细胞蛋白质和细胞器的降解和回收利用。我们采用先进的荧光显微镜可视化和量化小，但必要的，与诱导自噬相关的物理变化，包括自噬体和溶酶体的形成和分布，以及他们融合成autolysosomes。
Abstract
手术虽然带有明显的阳痿和尿失禁的风险，前列腺癌是美国男性恶性肿瘤之间的主要形式，传统的化疗方法已基本成功。激素治疗是有效的，在早期阶段，但往往失败，并最终发展为激素难治性肿瘤。我们一直有兴趣在开发针对特定的肿瘤细胞代谢缺陷的疗法。我们最近发现，前列腺肿瘤细胞的特异性缺乏一种酶（精氨琥珀酸合成酶，或ASS）的合成中所涉及的氨基酸精氨酸1。这种情况会导致肿瘤细胞变得依赖于外生精氨酸，他们经过代谢应激游离精氨酸耗尽时由精氨酸脱亚胺酶（ADI）1,10。事实上，我们已经表明，人类前列腺癌细胞CWR22 RV1有效地杀死ADI依赖caspase的细胞凋亡和积极autophaGY（或macroautophagy）1,2,3。细胞自噬是一种进化上保守的过程，使细胞代谢多余的蛋白质在营养饥饿4,5溶酶体破裂。虽然这一途径的重要组成部分，良好的特点6,7,8,9，很多方面的分子机制仍不清楚-特别是，什么是自噬作用的前列腺癌细胞死亡响应ADI治疗后？为了解决这个问题，我们需要的实验方法来衡量的水平和程度在细胞中的自噬反应 - 因为没有已知的分子标记物，可以准确地跟踪这个过程中，我们选择了开发基于成像的方法，使用定量三维荧光显微镜11,12的 。
使用专门CWR22Rv1细胞自噬体和溶酶体的荧光探针标记，我们证明了收购3D图像栈或者无线defield卷积显微镜（以及后来的超高分辨率，结构照明显微镜），可以清晰地捕捉到自噬诱导的早期阶段。市售数字图像分析的应用程序，我们可以很容易地获得统计信息自噬体和溶酶体的数量，规模，分布和程度从任何成像细胞共存。这个信息让我们能够精确地跟踪在活细胞自噬的进展，使我们继续调查自噬作用在癌症化疗。
Protocol
1。第1部分：细胞培养，免疫荧光标记
- CWR22 RV1人前列腺肿瘤细胞生长在盖玻片（＃1.5或170微米厚）置于6孔培养板中，含有10％胎牛血清（FBS）和1％青霉素/链霉素/谷氨酰胺的RPMI（敏达，VA）。
- 引起细胞自噬与精氨酸脱亚胺酶（ADI，0.3微克/毫升）的磷酸盐缓冲盐水（PBS）处理选定的样品。
- 固定细胞，用4％多聚甲醛（PFA，Fisher Scientific公司，NH）在PBS中稀释，将100μl每盖玻片，在RT下10分钟。
- 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
- 通透细胞用0.05％皂甙（Sigma公司），HEPES（HBS）/ BSA，加入100μl每盖玻片，在RT下的15分钟。
- 免疫标记，块样品与2.5％的酪蛋白（Sigma公司），每盖玻片100微升，HBS / BSA 1小时RT之前。
- 孵育固定细胞主要抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每coversl 100微升IP，O / N在4°C。
- 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
- 固定细胞孵育二次抗体稀释在2.5％酪蛋白/ HBS / BSA，每100微升盖玻片，在室温下1小时。
- 用1毫升HBS / BSA洗涤细胞3次。
- SlowFade金制备的盖玻片，在显微镜玻片安装或延长Gold抗淬灭试剂（Invitrogen，CA），含有4'，6 - 二脒-2 - 苯基吲哚（DAPI）。
- 指甲油密封盖玻片边缘。为了获得最佳的成像效果，让时间（理想的O / N）为防褪色媒体的彻底渗透细胞。
- 清洁盖玻片的表面与甲醇和/或氯仿。
- 浸油（折射率1.520成像时，在37°C或1.516成像时，在RT）60X 1.42 NA物镜（奥林巴斯，日本）。
- 滑动感兴趣的细胞在显微镜舞台上，并建立重点。
2。第2部分：准备细胞实时成像
- 长大无缝线路22 RV1细胞表达绿色荧光蛋白偶联型轻链3（LC3-GFP）的RPMI培养基中，在35 mm的聚-D-赖氨酸涂覆的玻璃底培养皿（MatTek，MA）中含有10％FBS和1％抗生素。应接种于细胞足够的密度，方便快速扩散，但没有那么多细胞覆盖，成群成像时。
- 治疗选择与ADI（0.3微克/毫升）的PBS的细胞样本。
- 约1小时，在成像之前，稀释红色LysoTracker DND-99（Invitrogen公司，CA），用20毫升的RPMI 1.5微升。含有10％FBS和1％抗生素。使用的解决方案，包含ADI选定样本。预热到37°C前加入培养皿所有媒体。
- 与红的RPMI含有LysoTracker的DND-99 15-45分钟，在37°C孵育
- 约30分钟，在成像之前，打开的WeatherStation环境围封，并允许平衡到37℃和5％CO 2的（humidif与IED的空气）。
- 用PBS洗涤细胞，并与标准的RPMI只含有10％FBS和1％抗生素更换介质。 ADI表示样品。
- 安装35毫米盖玻片底培养皿定制适配器（应用精密公司，WA），并在显微镜舞台上的位置。 60X 1.42 NA物镜用浸油（折射率1.520），并在舞台上的位置安装的培养皿。
3。第3部分：反卷积显微镜和分析
该协议在本节中假定DeltaVision的个人DV卷积显微镜和相关的应用程序套件（应用精密公司，WA）SoftWorX使用。
- 打开显微镜系统，包括采集工作站和仪器控制器。打开Resolve3D应用初始化显微镜阶段，并开启氙灯光源。允许光源的热身和达到稳定的条件下为10分钟。
- 添加滴浸油（折射率1.520活样品在37℃或固定的样品在RT 1.516）60X 1.42 NA物镜，在物镜的中心滑动试样（盖玻片正面朝下）。
- 无论是使用明视场或外部照明和粗调调节旋钮，慢慢地提高胎圈浸油物镜，直到与倒置的玻璃盖接触。 （从这点来说，应该成为焦点的细胞层内几圈微调对焦调节旋钮）。当使用固定的样品在幻灯片上，它被建议，以避免细胞内或附近有气泡的任何领域。当观看直播样品上的玻璃底菜，避免移动物镜玻璃盖玻片的边界之外。
- 自噬体可以识别eGFP的信号（绿色）。溶酶体确定由LysoTracker红（现场采样）或反灯泡1荧光抗体（固定样本）。细胞的细胞核用DAPI圣发现癌宁（固定样本）。
- 选择理想的视野。理想的情况下，细胞应具有良好的荧光信号在所有适当的渠道，并充分地附着盖玻片表面上摊开，使细胞内的内容是很容易想象的。侧的x，y和z聚焦在小的调整，可以控制由计算机使用Acquire3D接口。设置分级1X1或2x2的，这取决于所需的视场（更多的细胞中可以看出分级设置为2x2的领域）。
- 对于一个给定的图像通过一个电池的中部，设置最大像素强度不超过3000个计数的曝光参数（ 例如 ％的发送功率和曝光时间）。一般情况下，％透光率应尽可能低的设置，相应的曝光时间在1秒内没有提高。重复此过程，每个荧光色进行成像，并为每个单独的视野，以获得最高质量的图像。
- 设置在u稍稍调整焦点分别在顶部和底部的细胞样品，Z堆栈PPER和下限。 Z堆栈中的图像的总数，从而来确定这些限制和层与层之间的间距（默认值：0.2微米）。
- 为了最大限度地减少运动伪影，图像采集过程中，我们建议设置图像“波长，那么Z-Stack的”用于固定试样，“Z-Stack的波长”现场样品采集模式。
- 荧光图像反褶积使用SoftWorX（应用精密，WA）以后分析使用VoloCITY（即兴，现在上Perkin Elmer公司，MA）。
4。第4部分：超高分辨率，结构照明显微镜（OMX）
本节中的协议适用于使用结构照明显微镜OMX（应用精密，WA）。
- 接通主电源和所需的激光器（410纳米，488纳米，和/或532纳米）。等待20英里n为激光热稳定。
- 浸油（用于固定试样在室温下的折射率1.516）60X 1.42 NA物镜。如果气泡出现在油滴，清洁的目的，并再次添加机油。
- 如将样品幻灯片的舞台上，并在必要时，允许10分钟的细胞在盖玻片上定居。
- 初始化收购方案。使用荧光照明，直到锋利的细胞轮廓可以看出，调整的重点。 （在任何时候都应该小心，以尽量减少暴露的细胞荧光激发，直到实际图像采集）。
- 螺旋拼接扫描可以获取的样品预览较大的地区，选择单元格或地区的利益。建议使用短的曝光时间（1-10毫秒），低激磁功率（0.1-1％传输），同时扫描样品或寻找目标。
- GFP-LC3荧光识别自噬。识别溶酶体的Alexa Fluor 555抗LAMP（溶酶体相关膜蛋白）和细胞核用DAPI（固定的样品）。
- 选择的实验条件，包括激发波长，图像区域（ 例如，512×512），堆栈的厚度，曝光时间，激光透射百分率。对于超分辨图像，确保结构照明选项启用。在OMX卷积显微镜，选择传统的照明选项。
- 为了获得最佳的重建结果中，选择的实验条件下，例如，在采集过程中在10,000和15,000之间的最大强度计数。漂白如果是一个问题，也可以使用在一个较低的曝光（5000和10000之间的数）的成像。理想情况下，不应该减少计数超过整个采集过程中的两个因素，应避免超过四个因素的减少。如果有必要，减少组的厚度，以确保持续的强度计数。相机饱和，所以在64,000计数最大张力不应该超过此值。为了获得良好的样本，我们发现1％的激光传输的实验条件下，10〜50毫秒的曝光时间。可以反复成像明亮的和耐光样品的首选。需要一个稳定的污渍时间推移，超分辨图像。
- 为了减少噪音，95MHz读出速度（中等速度选项）和采集时间为2毫秒或以上推荐。增加文物得到重建成像，当样品在收购移动。由于这个影响，短期风险，建议非贴壁或快速移动的细胞。
- 多通道成像可以同时或依次进行。顺序模式产量减少串扰和建议。
- 为了减少光漂白，一般建议图像较长的激发波长（532纳米，488纳米和410纳米）。然而，对于在图3所示的实验结果，该顺序是反向。（ 即 48纳米，532纳米和410纳米）由于这个特定样品的光稳定性。
- 设置上限/下限的Z堆栈的顶部/底部的细胞移动显微镜阶段，直到稍微失焦。在0.125微米的超分辨率成像所需的每幅图像之间的距离应保持不变，重建软件借此为默认值。
- 图像重建栈使用SoftWorX（应用精密，WA）和分析使用的6.0 VoloCITY（Perkin Elmer公司，MA）。
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Representative Results
图1中所示的图象序列显示在第一个80分钟的自噬诱导的在CWR22细胞发生的物理变化。在这方面和其他的研究（图中未示出）中，我们持续观察到：（1）核内的位移相差的小区中心;（2）减少了粘着点，以及（3）朝向中心的自噬体和溶酶体一般易位细胞。此外，我们还观察到自噬体和溶酶体（绿色）（红色）之间的共存小幅增加（黄色），在稍后的时间点。
基于图像流式细胞仪作为示范，我们使用VoloCITY的数字成像应用程序套件（版本6.0，即兴/ Perkin-Elmer公司），以识别，计数，收集统计数据标记的自噬体和溶酶体在CWR22细胞的图像图1。在图2中的图表所示，吨的数量和大小的他自噬体（后，他们最初的形成和外观）不随时间变化的：自噬感应80分钟后，有一个渐进的，但在自噬体的净减少（ 图2A）的自噬体的平均规模，并相应增加（ 图2B）。此外，有一个可测量的增加，自噬体和溶酶体中的共定位，皮尔逊相关系数分析（ 图2C）的基础上。总之，这些研究结果表明，自噬刺激后，无数的小自噬体融合形成较大的自噬体随着时间的推移（ 图2D）。虽然图1和图2反映了只有一个单一的成像研究的结果，更严格的定量分析，将需要作出肯定的结论，但它并说明定量荧光显微镜的特征和优点。我们正在积极使用这种技术，在欧细胞自噬的分子机制及过程ŗ继续调查。
图3A显示了图像获取和使用OMX显微镜（右）在DV模式（模拟怀德菲尔德卷积，左）与结构化照明模式重建并排侧比较。横向分辨率提高到高达120纳米，传统的有限衍射显微镜14,15两倍的分辨率。小规模的自噬体和溶酶体（ 图3B，用箭头表示）共存显然超高分辨率显微镜，而他们几乎没有明显与传统的荧光成像。
使用解卷积显微镜的优点之一是重建所有的图像转换为3D模型，将揭示不同分子间的更精确的空间信息。 电影1示出了整体画面的CWR22 RV1的细胞undergoi伍自噬在稍后的时间点，其中显着的量之间的共存自噬体和溶酶体开始发生。 E-cadherin的染色（如以白色为主色调）显示靶细胞的轮廓。在电影中 ，三维重建模型自噬体和溶酶体（黄色表示）之间的融合提供了更多的空间细节。我们可以清楚地看到绿色LC3信号和红色溶酶体信号，两个信号的合并可产生黄色信号之间的相互作用。
图1。时间推移图像，CWR22 RV1细胞治疗与ADI CWR22 RV1细胞治疗与ADI公司的80分钟的图像序列。 （2D图像从原始图像栈获得最大的Z轴投影）。 WH伊特虚线表示的轮廓的光的阴影区域代表的细胞，核的位置。
图2。通过分析图像序列如图1所示，作为示范的图像数据量化统计分析。提取统计趋势。 点击这里查看大图 。
图3。自噬体和溶酶体细胞分布。首页）侧端比较获得的图像和使用OMX显微镜（右）在DV模式（模拟怀德菲尔德卷积，左）和结构化照明模式重建。标尺为5微米。底部）小规模的自噬体和溶酶体（用箭头表示）共存。
电影1，电影2。 CWR22 RV1细胞发生自噬的三维重建。这部电影说明ADI治疗正常后诱导自噬。 Z-Stack的图像重建成3维模型。这部电影所产生的细胞360°水平和360°垂直旋转。绿色信号代表LC3，红色信号表示溶酶体，白色信号代表E-cadherin的，蓝色信号代表细胞核。 点击这里查看或电影1=“_blank”>点击此处查看电影2。
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Discussion
虽然被广泛接受为一个标准的方法来确认自噬反应6相同的系统（因为我们已经做了），定量三维成像提供了前所未有的信息和细节的复杂过程，细胞自噬对LC3荧光探针标记细胞直接观察。特别是，我们观察到自噬诱导后80分钟内，数百（如果不是数千）在活细胞中的自噬体形成。同样，我们观察到在自噬诱导溶酶体舱室的分布非常有趣的形态学变化。在一个给定的单元格，在自噬体的数量减少，并随着时间的推移他们的平均大小相应增加，表明自噬体的增长大融合与对方相结合的与溶酶体形成autolysosomes的之前。高分辨率三维荧光活细胞成像，让我们去调查，自噬是否必须达到一个临界尺寸江前ê与溶酶体融合，还是自噬可进行简单的在一个较小的物理尺寸。事实上，由于一些非常小的自噬体出现早期活化后，只是在反褶积显微镜的分辨率极限，更清楚在OMX结构照明显微镜13的解决，它可能的情况下，实际上大量的自噬活性发生在这个水平。
能够监测活细胞的自噬过程中是极其重要的，作为自噬体在给定的小区的数量和大小的变化，可以是小的，这些参数的变化相对于从细胞到细胞。通过研究一个单一的，随着时间的推移活细胞 - 我们可以肯定的是，我们观察到的形态变化是由于实验条件，而不是统计方差。
最后，具有特定的分子标记，我们可以应用这些成像技术研究早期形成自噬体，追本溯源的autophagosomal膜的，并找出可能的细胞器和/或细胞内的组件，已专门在自噬体吞噬在细胞自噬诱导。我们也希望，这种方法将使我们研究自噬作用在细胞生存和细胞死亡，并更好地表征潜在的药物和自噬抑制剂的影响。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
格兰特支持，国家科学基金会，美国国立卫生研究院NIH CA165263 CA150197：NIH CA150197S1（HJ功夫），：NIH CA150197S1（CA Changou）PHY-0120999 中心生物光子学科学与技术 （DL欧胜，庄花园街），国防部PC073420（RJ大胆），研究挪威理事会，：儿子里夫埃埃里克森旅游格兰特209286/F11（BS阿鲁瓦莉）。 HJ功夫也承认奥本社区癌症基金的支持。 RJ大胆也承认J.麦当劳养老的支持。
我们感谢珍妮博士伟仁西贡博士和吴柏文DesigneRx慷慨供给ADI。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Arginine Deiminase (ADI) | DesigneRx | ||
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Casein | Sigma | C5890 | |
| Paraformaldehyde | Fisher | 4042 | |
| Saponin | Sigma | S4521 | |
| Alexa anti-mouse 555 | Invitrogen | A21422 | |
| Alexa anti-rabbit 647 | Invitrogen | A21244 | |
| LysoTracker Red DND-99 | Invitrogen | L7528 | |
| anti-Lamp1 | DSHB | H4A3 | |
| anti-Cadherin | Cell Signaling | #3195 | |
| SlowFade Gold | Invitrogen | S36936 | |
| 35 mm poly-d-lysine coated glass bottom plate | MatTek | P35GC-1.5-1.4-C | |
| No.1, 22 mm coverslip | Corning | #2865-22 | |
| Microscope slides | Globe Scientific | 1324G |
References
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