Cardiac Stress Test geïnduceerd door dobutamine en bewaakt door hartkatheterisatie in Muizen

Summary

We beschrijven het protocol een cardiale stress test geïnduceerd door dobutamine en gevolgd door hartkatheterisatie in normale muizen voeren. Ook laten we zien de toepassing ervan op subklinische hart-en vaatziekten willen onthullen, hoog vet dieet-geïnduceerde obese muizen.

Abstract

Dobutamine een β-adrenerge agonist met een affiniteit hoger receptor uitgedrukt in het hart (β ₁₎ dan receptoren tot expressie gebracht in de slagaders (β _2). Bij systemisch toegediend, het verhoogt de cardiale vraag. Zo, dobutamine ontmaskert abnormaal hartritme of ischemische gebieden mogelijk risico van infarct.

Monitoring van de hartfunctie tijdens een cardiale stress test kan worden uitgevoerd door ofwel ecocardiography of hartkatheterisatie. Dit laatste is een invasieve maar accurate en techniek die de eerste.

Cardiale stress test geïnduceerd door dobutamine en gecontroleerd door hartkatheterisatie uitgevoerd zoals hier beschreven kan, in een experiment, het meten van de volgende hemodynamische parameters: hartslag (HR), systolische druk, diastolische druk, eind-diastolische druk, maximale overdruk ontwikkeling (dP / dtmax) en de maximale negatieve persure ontwikkeling (dP / dt _min), bij aanvang omstandigheden onder toenemende doses dobutamine.

Zoals verwacht, in normale muizen zagen we een dobutamine dosis-gerelateerde toename in HR, dP / dt _max en dP / dt _min. Bovendien, bij de hoogste geteste dosis (12 ng / g / min) de hartdecompensatie vetrijke dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen was ontmaskerd.

Protocol

Protocol is goedgekeurd door de Ethische Commissie van Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo.

I. Voorbereiding Dobutamine Infusion

1. Los 10 mg van dobutamine in 20 ml van gedestilleerd steriel water, teneinde een voorraadoplossing van 500 ug / ml dobutamine verkrijgen. Aliquot en bewaar bij -20 ° C. Deze oplossing kan tenminste gedurende 3 maanden.
2. Ontdooien een hoeveelheid dobutamine stock oplossing bij kamertemperatuur.
3. Verdun dobutamine stock oplossing in steriele 0,9% NaCl, om dobutamine werkoplossing, welke concentratie wordt berekend volgens de formule verkregen: dobutamine (ug / ml) = lichaamsgewicht x 0,2.
4. Vul een 1 ml spuit 29Gx1 / 2 "met dobutamine werkoplossing.
5. Steek de naald van de spuit in een 20 cm PE-10 buis.
6. Stel de spuit in de infusiepomp volgens instructies van de fabrikant.
7. Stel de helling infusie in een stapNaar stap format met een toename van 10 pl / min per stap, 6 treden.

II. Voorbereiden druksensor

1. Om signaal drift, dompel druksensor in steriel water minimaliseren bij 37 ° C gedurende ten minste 15 minuten. Niet weken de catheter meer dan 0,5 cm diep, teneinde te voorkomen dat hydrostatische druk beïnvloedt de druksensor.
2. Elektronisch kalibreren de druksensor bij 25 en 100 mmHg. Elektrisch ingangsvermogen (Volt) omgezet in druksignaal (mmHg).
3. Zet de sampling rate van 2 k / s en gebruik de filter low pass met een afgesneden bij 100 Hz. Stel druksignaal op nul mmHg.
4. Markeer de catheter 15 mm van de punt. Ver naar het hart bereiken vanaf het inbrengpunt werd geschat door echocardiografie, de aanwezigheid van de catheter in de linker ventricule.

III. Voorbereiding Muis voor catheterisatie

1. Gewicht C57BL / 6 mannelijke muizen, 30-32 weken oud.
2. Injecteer intraperitoneaal 60 ug / kg ketamine en 4 ug / kg xylazine ^1. Opmerking: Andere anesthetica kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld: 350 - 450 ug / kg avertin, 50 ug / kg pentobarbital of 1,5 - 2% isofluraan ^2-3.
3. Scheer de nek met een elektrisch scheerapparaat.
4. Plaats de verdoofde muis in rugligging op een voorverwarmde isothermische verwarmingsplaat. Zet haar ledematen met papier tape.
5. Voer een teen knijpen om volledige sedatie te bevestigen.
6. Steek voorzichtig een rectale sonde om de lichaamstemperatuur te controleren. Met behulp van vaselinized sonde wordt aanbevolen.
7. Als de lichaamstemperatuur verschilt van 37 ° C ± 0,5 ° C, stel deze dan via de verwarmingsplaat.
8. Zet de muis snuit in de buurt van de zuurstoftoevoer.
9. Plaats de muis halsgebied onder de stereomicroscoop.

IV. Data Acquisition

1. In de LabChartPro 7-software, selecteert u een kanaal voor druk registratie en een kanaal voor de hartslag (HR)registratie. Voor deze laatste, selecteert u de optie "Cyclic Metingen" en setup meting als tarief.
2. Voor de druk kanaal in te stellen de schaal bereik: 0 tot 150 mmHg.
3. Voor HR kanaal in te stellen schaal bereik: 200 tot 600 slagen per minuut.
4. Druk op de startknop om de registratie te starten.
5. Plaats commentaar geven procedures uitgevoerd, bijvoorbeeld: anesthesie administratie, de start van dobutamine infusie dobutamine concentratie, ademhaling verandert.

V. hartkatheterisatie ^4,5

1. Voer een kleine incisie aan de rechterkant bij de kaak. Met een schaar te scheiden van de huid-musculaire bindweefsel.
2. Voer een longitudinale sectie (1,5 - 2 cm) aan de rechterzijde van de trachea. Scheid het bindweefsel, vet en spier met gebogen forceps, teneinde de rechter halsslagader bij de trachea bloot.
3. Plaats een expander in het dier rechterkant de halsslagader bloot. Pulsatielepressie van het hart vergemakkelijkt de identificatie van de slagader. De halsader, die donkerrood, aan de rechterkant.
4. Scheid de slagader van aangrenzende weefsels met gebogen forceps. De nervus vagus, die lijkt op een witte draad, ligt langs de slagader.
5. Knip een 20 cm stuk 6/0 zijden draad en "dubbel" het.
6. Steek de "dubbele" draad onder de slagader van links naar rechts. Knip de draad om afzonderlijke uiteinden te verkrijgen.
7. Pass derde draad (10 cm) onder de slagader.
8. Bind een strakke knoop in de draad geplaatst in de buurt van het hoofd, en een losse een in de meer distale draad.
9. Bind een losse knoop in het midden draad, en bevestig het rechter uiteinde van de middelste draad naar de verwarming pad met een papieren tape.
10. Halsslagader vochtig houden door druppelen steriele 0,9% NaCl. Droog overtollige vloeistof met een wattenstokje.
11. Strek de onderste draad met een hemostaat klem.
12. Bepaal de positie van de hemostaat schaar door pinching de huid van de buik, het strekken van de bovenste draad, om bloedstroom af te sluiten. Controleer of bindweefsel rond de slagader is verwijderd. De slagader moet vol bloed en beroofd van puls. Voorkom discussies van het produceren van een belasting op de slagader.
13. Een doorsnede nick onderaan de arterie met een Vannas micro-schaar. Bloeddruppels worden gemorst.
14. Katheter in de halsslagader. Zorg ervoor dat u de hele druksensor te introduceren. Controleer of er geen bloedverlies.
15. Pas de middelste draad knoop, om de katheter op zijn plaats. Niet te veel veel, de druksensor is zeer broos.
16. Laat de hemostaat schaar van het dier buik.
17. Houd de katheter met de hand en druk de middelste draad om bloed te voorkomen. Opmerking: slagader moet vol bloed.
18. Start de opname druksignalen.
19. Wanneer de katheter in, dearteriële druksignaal schommelt 60-70 tot 100-120 mmHg. De vorm van de druk-signaal wordt weergegeven in figuur 1.A. Opmerking: als u op belangstelling, op dit tijdstip kunt u arteriële druk opnemen als signaal stabiel gedurende tenminste 5 minuten. HR waarden werden verkregen door de druk golfvormen overweegt een interval van 30 sec van opnamesignaal. Het is mogelijk om ook een ECG methode voor directe meting van HR volgens het onderzoek doelen.
20. Druk de catheter tot een verandering in de vorm van het druksignaal (Fig. 1.B) observeren. Zodra de katheter in de linker ventrikel, het druksignaal schommelt tussen 0 tot 100-120 mmHg. Als het moeilijk is om de catheter te schuiven, knijpen dier kist met twee vingers.
21. Continu controle ademhalingsfrequentie, lichaamstemperatuur, anesthesie-niveau en druksignaal. Ieder van hen moet stabiel blijven.

VI. Infusie van Dobutamine

1. Introduceer een PE-10 buis in de ader. Controleer of de bloedstroom niet geblokkeerd bewegen achteruit de zuiger.
2. Dobutamine infusie begint met 10 pl / min en eindigt met 60 pl / min. In elke stap wordt de infusiesnelheid gedurende 2 min ^6.
3. Na de laatste dosis dobutamine, euthanaseren het dier met een overdosis van anesthesie.

VII. Data-analyse

1. Voor data-analyse, kiest u het deel van de geregistreerde gegevens van uw interesse. Zorg ervoor dat u een tijdsinterval na te gaan waar de druk-signaal is stabiel.
2. Selecteer het pictogram Setup in de bloeddruk module. Geef het geselecteerde type van druk-signaal.
3. Automatisch wordt de LabChartPro 7-software displays bedoel, maximaleen minimale waarden voor HR, systolische druk (P _max), diastolische bloeddruk (P _min), eind-diastolische druk (EDP), maximale overdruk ontwikkeling (dP / dtmax) en de maximale onderdruk ontwikkeling (dP / dt _min). Bovendien kan cardiale parameters worden afgebeeld op de druk trace.

Representative Results

De bloeddruk signaal wordt bepaald door systolische en diastolische druk. Wanneer de druksensor in de linker ventrikel, de druk (LVP) golfvorm wordt gekenmerkt door een daling tot nul diastolische druk en het uiterlijk van de linker atriale contractie voor ventrikel contractie (figuur 1). Bij referentietoestand, ketamine-xylazine verdoofd normale muizen hadden HR van 280 ± 24, P _max van 107 ± 8, P _min 5 ± 1, EDP van 14 ± 2, dP / dt _max van 6081 ± 365 en dP / dt _min van 5230 ± 526.

Zoals te zien in figuur 2, in normale muizen LVP en HR geleidelijk verhoogd langs dobutamine infusie en genormaliseerd na de infusie te stoppen. Zoals verwacht, de hemodynamische parameters geëvalueerd in een toegenomen dobutamine dosisafhankelijke wijze (figuur 3). Zo dobutamine chronotrope (HR toename) en positief in otropic (LVP en dP / dt _max toename) effecten worden aangetoond.

Vergeleken met normale muizen, in vetrijke dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen zagen we een lagere toename van HR en dP / dt _max bij cardiale stress wordt geïnduceerd, is statistisch significant bij de hoogste doses dobutamine getest (figuur 4). Deze verschillen werden niet waargenomen uitgangssituatie (0 ng / g / min).

Figuur 1. Arterial (A) en ventriculaire (B) drukmeter verkregen na catheterisatie van normale muizen. Hemodynamische parameters werden bepaald door representatieve LVP versus de tijd hartcycli. Representatieve gegevens van 5 dieren. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

ENT ">
Figuur 2. LVP (A) en HR (B) toont tijdens dobutamine infusie in normale muizen. Representatieve gegevens van 5 dieren.

Figuur 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) en dP / dt _min (D) tijdens dobutamine infusie in normale muizen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. n = 5

Figuur 4. HR (A) en dP / dt _max (B) tijdens dobutamine infusie in normale en hoge vet dieet-geïnduceerde zwaarlijvige muizen. Gegevens worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Cardiale stress test veroorzaakt door dobutamine en gecontroleerd door hartkatheterisatie is bewerkelijk. Niettemin volgens het protocol hier beschreven en met een korte tijd van training is het mogelijk zes hemodynamische parameters in een experiment dat ongeveer een uur.

De kritische stappen van het protocol hier gepresenteerde zijn de cannulations van de bloedvaten. Wat de canulatie van de halsslagader dient uitgevoerde insnijding groot zijn dat de drie weefsellagen van de slagader, en groot genoeg om de doorgang van de katheter mogelijk te breken. Wat de cannulatie van halsader, terwijl het risico op bloeding laag, de mogelijkheid vene hoog. Zo protocol herhaalbaarheid hangt ruimschoots aan de standaardisatie van de gebruikte knikken strategie.

Het minimaliseren van de impact van de depressieve effect van verdoving, hypothermie en hypoxie moeten worden voorkomen en, indien nodig, corrigerendeted. Ademhaling ritme moet worden houden regelmatig, omdat diep of onregelmatige ademhaling beïnvloedt LVP opname.

Gebruikt Dobutamine doses worden aangepast aan de: i) toedieningsweg (intraveneus: 0,5 tot 40 ng / g / min ^7,8, intraperitoneaal: 1 tot 1,5 ug / g / min ^9,10), ii) magnitude van cardiale dysfunctie en iii) ethiologie van cardiale veranderingen.

En last but not least, drie praktische adviezen: i) bij dieren met een overvloed aan vetweefsel rond de halsader, kan een kleine hoeveelheid bloed uit te komen, om de incisie grenzen te sporen; ii) houdt het werkgebied te bevochtigen omdat de canulatie procedure is eenvoudiger wanneer de katheter goed gesmeerd; iii) tagging de katheter vergemakkelijkt de visualisatie onder de microscoop.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF