Test de stress cardiaque induite par la dobutamine et surveillé par cathétérisme cardiaque chez la souris

Summary

Nous décrivons le protocole pour effectuer un test de stress cardiaque induite par la dobutamine et surveillés par cathétérisme cardiaque chez les souris normales. En outre, nous montrons son application à démasquer la maladie cardiaque infraclinique en haute teneur en graisses régime alimentaire induits par les souris obèses.

Abstract

La dobutamine est un agoniste β-adrénergique avec une plus grande affinité pour le récepteur exprimé dans le cœur (β ₁₎ que pour les récepteurs exprimés dans les artères (β _2). Lorsque administré par voie systémique, il augmente la demande cardiaque. Ainsi, la dobutamine démasque rythme anormal ou zones ischémiques potentiellement le risque d'infarctus.

Surveillance de la fonction cardiaque pendant un test d'effort cardiaque peut être effectuée par l'une ou ecocardiography cathétérisme cardiaque. Cette dernière est une technique invasive mais plus précis et informatif que le premier.

Test de stress cardiaque induite par la dobutamine et surveillés par cathétérisme cardiaque réalisé comme décrit ici permet, en une seule expérience, la mesure des paramètres hémodynamiques suivants: fréquence cardiaque (FC), la pression systolique, la pression diastolique, la pression télédiastolique, maximale pression positive développement (dP / dt max) et maximale négatifs dans la presseure développement (dP / dt _min), à des conditions de base et sous des doses croissantes de dobutamine.

Comme on s'y attendait, chez des souris normales, nous avons observé une dobutamine liée à la dose augmentation de la FC, dP / dt _max et dP / dt _min. En outre, à la plus forte dose testée (12 ng / g / min), la décompensation cardiaque de haute teneur en graisses régime alimentaire induits par les souris obèses a été démasqué.

Protocol

Protocole a été approuvé par le comité d'éthique de Facultad de Medicina Clinica Alemana Desarrollo-Universidad del.

I. Préparation de la perfusion de dobutamine

1. Dissolvez 10 mg de dobutamine dans 20 ml d'eau distillée stérile, afin d'obtenir une solution stock de 500 pg / ml dobutamine. Aliquoter et conserver à -20 ° C. Cette solution peut être utilisée au moins pendant 3 mois.
2. Décongeler une aliquote de la solution mère dobutamine à la température ambiante.
3. Diluer la solution mère stérile dobutamine dans NaCl à 0,9%, afin d'obtenir la dobutamine solution de travail, dont la concentration est calculée en utilisant la formule: dobutamine (pg / ml) = poids corporel x 0,2.
4. Remplir une seringue de 1 ml 29Gx1 / 2 "avec la solution de travail dobutamine.
5. Insérez l'aiguille de la seringue dans un 20 cm PE-10 tube.
6. Ajuster la seringue dans la pompe à perfusion en suivant les instructions du fabricant.
7. Mettre en place la perfusion rampe lors d'une étapeÀ l'étape de format avec une augmentation de 10 pi / min pour chaque étape, pour 6 étapes.

II. Préparation du capteur de pression

1. Pour minimiser la dérive du signal, capteur de pression se plonger dans de l'eau stérile à 37 ° C pendant au moins 15 min. Ne pas faire tremper le cathéter de plus de 0,5 cm de profondeur, afin d'éviter que la pression hydrostatique affecte le capteur de pression.
2. Électronique calibrer le capteur de pression à 25 et 100 mmHg. Électrique d'entrée (V) est converti en signal de pression (mm de Hg).
3. Réglez la fréquence d'échantillonnage de 2 k / s et d'utiliser le filtre passe-bas avec une coupe à 100 Hz. Réglez signal de pression à zéro mmHg.
4. Marquer le cathéter 15 mm de la pointe. Lointain à atteindre le coeur du point d'introduction a été estimé par échocardiographie, la détection de la présence de la sonde dans le ventricule gauche.

III. Préparation de souris de cathétérisme

1. Poids souris C57BL / 6 mâles, 30-32 semaines d'âge.
2. Injecter par voie intrapéritonéale 60 ug / kg de kétamine et de 4 mg / kg de xylazine ^1. Remarque: d'autres anesthésiques pourraient être utilisés, par exemple: 350 - 450 mg / kg avertin, 50 ug / kg de pentobarbital ou de 1,5 à 2% ^2-3 isoflurane.
3. Raser le cou avec un rasoir électrique.
4. Placez la souris anesthésiée en position couchée sur une plaque chauffante isotherme chauffée. Sécuriser ses membres un ruban de papier.
5. Effectuer un pincement de l'orteil pour confirmer la sédation complète.
6. Insérez doucement une sonde rectale pour surveiller la température du corps. En utilisant une sonde vaselinized est recommandé.
7. Si la température du corps varie de 37 ° C ± 0,5 ° C, réglez via la plaque chauffante.
8. Placez la souris près du museau alimentation en oxygène.
9. Placez la région du cou de la souris sous la loupe binoculaire.

IV. Acquisition de données

1. Dans le LabChartPro 7 du logiciel, sélectionnez un canal pour l'enregistrement de pression et un canal de la fréquence cardiaque (HR)d'inscription. Dans ce dernier cas, sélectionnez l'option «Mesures cycliques" et la mesure que le taux de configuration.
2. Pour le canal de pression définir la plage de l'échelle: 0 à 150 mmHg.
3. Pour HR canal réglé plage d'échelle: 200 à 600 bpm.
4. Appuyez sur la touche Start pour commencer l'enregistrement.
5. Insérez des commentaires indiquant les procédures effectuées, par exemple: l'administration d'anesthésie, le début de la perfusion de dobutamine, la concentration la dobutamine, la respiration changements.

V. Cathétérisme cardiaque ^4,5

1. Effectuez une petite incision sur le côté droit près de la mâchoire. Avec des ciseaux séparer le tissu conjonctif de la peau musculaire.
2. Effectuer une dissection longitudinale (1,5 - 2 cm) sur le côté droit de la trachée. Séparez le tissu conjonctif, la graisse et le muscle avec des pinces courbes, afin d'exposer l'artère carotide droite près de la trachée.
3. Placez une extension dans le côté animal droit d'exposer l'artère carotide. Pulsatilepression générée par le coeur facilite l'identification de l'artère. La veine jugulaire, qui est rouge foncé, est sur la droite.
4. Séparer l'artère de tissus adjacents avec une pince courbe. Le nerf vague, qui ressemble à un fil blanc, se trouve le long de l'artère.
5. Coupez un morceau de 20 cm de fil 6/0 de soie et "double" il.
6. Passez le "double" fil sous l'artère de gauche à droite. Couper le fil, afin d'obtenir des extrémités séparées.
7. Passez un troisième fil (10 cm) au-dessous de l'artère.
8. Faire un noeud serré dans le filet placé près de la tête, et un lâche dans le fil plus distale.
9. Faire un noeud lâche dans la ligne médiane, et fixer l'extrémité droite de la ligne médiane de la garniture de chauffage avec une bande de papier.
10. Gardez l'artère carotide humide en laissant tomber stérile à 0,9% de NaCl. Séchez l'excès de liquide avec des cotons-tiges.
11. Étirer le fil inférieur avec une pince hémostatique.
12. Fixer la position de la pince hémostatique à ciseaux par pinching la peau de l'abdomen, l'étirage du fil supérieur, de manière à obstruer le flux sanguin. Vérifier que le tissu conjonctif autour de l'artère a été éliminée. L'artère doit être pleine de sang et privés de pouls. Empêcher fils de produire une force de couple sur l'artère.
13. Faire une section transversale entaille près du fond de l'artère avec une Vannas micro-ciseaux. Gouttes de sang sera versé.
14. Insérer le cathéter dans l'artère carotide. Assurez-vous d'introduire le capteur de pression entier. Vérifiez qu'il n'y a aucune perte de sang.
15. Sans forcer, ajustez le nœud ligne médiane, afin de maintenir le cathéter en place. Ne pas comprimer trop, le capteur de pression est très fragile.
16. Relâchez les ciseaux hémostatiques de l'abdomen animal.
17. Tenez la sonde à la main et pousser le fil du milieu, afin d'éviter la perte de sang. Remarque: l'artère doit être plein de sang.
18. Début signaux de pression d'enregistrement.
19. Lorsque le cathéter est à l'intérieur, l'signal de pression artérielle varie de 60 à 70 à 100-120 mmHg. La forme du signal de pression est indiquée dans la note figure 1.A: si vous êtes intéressé à, à cet instant, vous pouvez enregistrer la pression artérielle si le signal est stable pendant au moins 5 min. Valeurs de FC ont été obtenus à partir des formes d'onde de pression compte tenu d'un intervalle de 30 secondes de signal d'enregistrement. Il est possible d'utiliser également une méthode ECG pour la mesure directe des ressources humaines, selon les objectifs de l'enquête.
20. Poussez doucement le cathéter en place pour observer un changement dans la forme du signal de pression (figure 1.B). Une fois le cathéter à l'intérieur du ventricule gauche, le signal de pression fluctue de 0 à 100-120 mmHg. S'il est difficile de faire glisser le cathéter, pincer la poitrine des animaux avec deux doigts.
21. Contrôler en permanence le rythme respiratoire, la température corporelle, le niveau de l'anesthésie et le signal de pression. Tous devraient rester stables.

VI. La perfusion de dobutamine

1. Introduire un tube PE-10 dans la veine. Assurez-vous que la circulation sanguine n'est pas bloqué déplaçant vers l'arrière le piston de la seringue.
2. Perfusion de dobutamine commence avec 10 pi / min et terminer par 60 pi / min. A chaque étape, le débit de perfusion est maintenue pendant 2 min ^6.
3. Après la dernière dose de dobutamine, euthanasier l'animal avec une surdose d'anesthésie.

VII. Analyse des données

1. Pour l'analyse de données, choisissez la section des données enregistrées de votre intérêt. Soyez sûr de considérer un intervalle de temps où le signal de pression est stable.
2. Sélectionnez l'icône Setup dans le module la pression artérielle. Indiquer le type sélectionné du signal de pression.
3. Automatiquement les écrans LabChartPro logiciel 7, moyenne, maximumet les valeurs minimales en matière de RH, de la pression systolique (P _max), la pression diastolique (P _min), en fin de diastole (PDE), le développement maximal de pression positive (dP / dt max) et le développement maximal de pression négative (dP / dt _min). En outre, les paramètres cardiaques peuvent être représentées sur le tracé de pression.

Representative Results

Le signal de pression artérielle est définie par la pression systolique et la pression diastolique. Lorsque le capteur de pression est à l'intérieur du ventricule gauche, la pression (LVP) de forme d'onde est caractérisée par une chute à zéro de la pression diastolique et l'apparition de la contraction de l'oreillette gauche, avant la contraction du ventricule (Figure 1). A l'état initial, la kétamine-xylazine anesthésiés souris normales ont HR de 280 ± 24, P _max de 107 ± 8, P _min de 5 ± 1, EDP de 14 ± 2, dP / dt _max de 6081 ± 365 et dP / dt _min de 5230 ± 526.

Comme le montre la figure 2, chez des souris normales LVP et HR augmente progressivement le long perfusion de dobutamine, et normalisé après arrêt de la perfusion. Comme prévu, tous les paramètres hémodynamiques évalué également augmenté dans un dobutamine façon dose-dépendante (Figure 3). Ainsi, chronotrope dobutamine (augmentation des ressources humaines) et positif dans otropic (LVP et dP / dt _max augmentation) des effets sont mis en évidence.

Par rapport à des souris normales, en haute teneur en graisses régime alimentaire induits par les souris obèses, nous avons observé une augmentation plus faible des RH et dP / dt _max lorsque le stress cardiaque est induite, été statistiquement significatif aux plus fortes doses de dobutamine testés (Figure 4). Ces différences n'ont pas été observées dans les conditions de référence (0 ng / g / min).

Figure 1. Artérielle (A) et du ventricule (B) enregistre la pression obtenue après cathétérisation de souris normales. Les paramètres hémodynamiques ont été déterminées à partir des cycles LVP représentatives de temps par rapport aux cardiaques. Les données représentatives de 5 animaux. Cliquez ici pour agrandir la figure .

ent ">
Figure 2. LVP (A) et HR (B) enregistre au cours de la perfusion de dobutamine chez des souris normales. Les données représentatives de 5 animaux.

Figure 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) et dP / dt _min (D) des variations durant la perfusion de dobutamine chez des souris normales. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. n = 5

Figure 4. HR (A) et dP / dt _max (B) des variations durant la perfusion de dobutamine dans des conditions normales et de haute graisse alimentaire induits par les souris obèses. Les données sont exprimées en moyenne ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Test de stress cardiaque induite par la dobutamine et surveillés par cathétérisme cardiaque est laborieuse. Néanmoins, en suivant le protocole décrit ici et avec un peu de temps de formation, il est possible d'évaluer six paramètres hémodynamiques en une seule expérience qui durent environ une heure.

Les étapes critiques du protocole présenté ici sont les canules des vaisseaux sanguins. En ce qui concerne la canulation de l'artère carotide, l'incision effectuée doit être assez profond pour casser les trois couches de tissu de l'artère, et suffisamment grands pour permettre le passage du cathéter. En ce qui concerne la canulation de la veine jugulaire, tandis que le risque de saignement est faible, la possibilité d'occlusion de la veine est élevé. Ainsi, la répétabilité protocole pend largement sur la normalisation de la stratégie de césure utilisé.

Afin de minimiser l'impact de l'effet dépressif de l'anesthésie, de l'hypothermie et de l'hypoxie doivent être évitées et, le cas échéant, correctionted. Rythme respiratoire doit être régulière, car garder la respiration profonde ou irrégulière affecte l'enregistrement LVP.

Doses de dobutamine utilisées doivent être ajustées en fonction de l': i) la voie d'administration (intraveineuse: 0,5 à 40 ng / g / min ^7,8; intrapéritonéale: 1 à 1,5 pg / g / min ^9,10), ii) l'ampleur de certains stimulateurs cardiaques dysfonctionnement et iii) étiologie de l'altération cardiaque.

Et last but not least, trois conseils pratiques: i) chez l'animal avec le tissu adipeux abondant entourant la veine jugulaire, permettre à une petite quantité de sang à sortir, afin de détecter les frontières incision; ii) maintenir la zone de travail mouiller car l' procédure de cathétérisme est plus simple lorsque le cathéter est bien lubrifié, iii) le marquage du cathéter facilite sa visualisation au microscope.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF