Cardiac Stress Test durch Dobutamin induziert und Überwacht durch Herzkatheter in Mäuse

Summary

Wir beschreiben das Protokoll eine kardiale Stresstest Dobutamin induziert und überwacht durch Herzkatheter bei normalen Mäusen durchzuführen. Auch zeigen wir ihre Anwendung auf subklinische Herzerkrankungen in fettreichen Diät-induzierten adipösen Mäusen zu entlarven.

Abstract

Dobutamin ist ein β-adrenergen Agonisten mit einem höheren Affinität für den Rezeptor im Herzen (β ₁₎ als für Rezeptoren in den Arterien (β ₂₎ ausgedrückt. Wenn systemisch verabreicht, erhöht es Herzbedarf. So entlarvt Dobutamin anormalen Rhythmus oder ischämische Bereiche potentielles Risiko Herzinfarkt.

Überwachung der Herzfunktion während einer Belastungs-Test kann entweder durch ecocardiography oder Herzkatheter durchgeführt werden. Letzteres ist eine invasive, aber genauer und informative Technik, die der ehemalige.

Cardiac Stress-Test induziert durch Dobutamin und überwacht durch Herzkatheter wie hier beschrieben durchgeführt ermöglicht, in einem einzigen Experiment die Messung der folgenden hämodynamischen Parameter: Herzfrequenz (HR), systolischer Druck, diastolischer Druck, end-diastolische Druck, maximal Überdruck Entwicklung (dP / dtmax) und die maximale negative Presseure Entwicklung (dp / _dt MIN), an der Basislinie und unter Bedingungen steigender Dosen von Dobutamin.

Wie zu erwarten, bei normalen Mäusen beobachteten wir eine Dobutamin dosisabhängigen Anstieg der HR, dP / dt _max und dP / dt _min. Darüber hinaus bei der höchsten getesteten Dosis (12 ng / g / min) der kardiale Dekompensation der fettreichen Diät-induzierten adipösen Mäusen war entlarvt.

Protocol

Protokoll wurde von der Ethikkommission der Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo zugelassen.

I. Vorbereitung Dobutamin Infusion

1. Man löst 10 mg Dobutamin in 20 ml steriles destilliertes Wasser, um eine Stammlösung von 500 ug / ml Dobutamin erhalten. Aliquotieren und bei -20 ° C. Diese Lösung kann für mindestens 3 Monate verwendet werden.
2. Auftauen eines Aliquots Dobutamin Stammlösung bei Raumtemperatur.
3. Verdünnen Dobutamin Stammlösung in steriler 0,9% NaCl, um Dobutamin funktionierende Lösung, die Konzentration wird anhand der Formel: Dobutamin (pg / ml) = Körpergewicht x 0,2.
4. Füllen Sie eine 1 ml Spritze 29Gx1 / 2 "mit Dobutamin funktionierende Lösung.
5. Legen Sie die Nadel der Spritze in einen 20 cm PE-10 Röhre.
6. Passen Sie die Spritze in die Infusionspumpe nach den Anweisungen des Herstellers.
7. Richten Sie die Rampe Infusion in einem Schritt-Für-Schritt-Format mit einer Steigerung von 10 ul / min für jeden Schritt, für 6 Schritten.

II. Vorbereiten Pressure Sensor

1. Um Signaldrift, tauchen Drucksensor in sterilem Wasser bei 37 ° C zu minimieren für mindestens 15 min. Nicht einweichen den Katheter mehr als 0,5 cm tief, um zu verhindern, dass hydrostatische Druck wirkt sich auf die Drucksensor.
2. Elektronisch den Drucksensor kalibrieren, bei 25 und 100 mmHg. Elektrischen Eingang (V) mit Drucksignal (mmHg) umgewandelt.
3. Stellen Sie die Abtastrate von 2 k / s und nutzen Sie den Filter Tiefpass mit einer Grenzfrequenz von 100 Hz. Stellen Sie den Druck auf Null mmHg.
4. Markieren Sie den Katheter 15 mm von der Spitze. Entfernt, um das Herz von der Einleitungsstelle erreicht wurde geschätzt durch Echokardiographie, Erfassen der Anwesenheit des Katheters in den linken Ventrikel.

III. Vorbereiten Maus für Katheterisierung

1. Gewicht C57BL / 6 männlichen Mäusen, 30-32 Wochen alt.
2. Inject intraperitoneal 60 ug / kg Ketamin und 4 ug / kg Xylazin ^1. Hinweis: Andere Anästhetika könnte verwendet werden, zum Beispiel: 350 - 450 ug / kg avertin, 50 ug / kg Pentobarbital oder 1,5 - 2% Isofluran ^2-3.
3. Rasur am Hals mit einem elektrischen Rasierer.
4. Setzen Sie den narkotisierten Maus in Rückenlage auf einer vorgewärmten isothermen Heizplatte. Sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Lochstreifen.
5. Führen Sie einen Zeh Prise vollständige Sedierung bestätigen.
6. Führen Sie eine rektale Sonde, um die Körpertemperatur zu überwachen. Mit vaselinized Sonde wird empfohlen.
7. Wenn Körpertemperatur von 37 unterscheidet ° C ± 0,5 ° C beträgt, wird es über die Heizplatte.
8. Setz Maus nahe der Schnauze Sauerstoffversorgung.
9. Platzieren Sie die Maus Halsbereich unter dem Stereomikroskop.

IV. Data Acquisition

1. In der LabChartPro 7-Software, wählen Sie einen Kanal für Druck Registrierung und einen Kanal für die Herzfrequenz (HR)Anmeldung. Für letztere, wählen Sie die Option "Zyklische Messungen" und Setup-Messung als Rate.
2. Für den Druckkanal den Maßstab: 0 bis 150 mmHg.
3. Für HR-Kanal eingestellt Skalenbereich: 200 bis 600 bpm.
4. Drücken Sie die Starttaste, um die Registrierung zu beginnen.
5. Kommentare einfügen angibt Verfahren durchgeführt werden, zum Beispiel: Anästhesie Verabreichung von Dobutamin Infusion, Dobutamin Konzentration starten, atmende ändert.

V. Herzkatheter ^4,5

1. Durchführen einer kleinen Einschnitt auf der rechten Seite in der Nähe des Kiefers. Mit Schere trennen die Haut-Muskel-Bindegewebe.
2. Führe eine longitudinale Dissektion (1,5 - 2 cm) auf der rechten Seite der Luftröhre. Trennen die Bindegewebe, Fett und Muskeln mit gekrümmten Zange, um die rechte Arteria carotis in der Nähe der Luftröhre freizulegen.
3. Platzieren eines Expanders im Tier rechts um die Halsschlagader freizulegen. PulsierendeDruck durch das Herz erzeugt erleichtert die Identifizierung der Arterie. Die Halsschlagader, die dunkel rot ist, ist auf der rechten Seite.
4. Trennen Sie die Arterie von benachbarten Geweben mit gebogenen Pinzette. Der Vagusnerv, der eine weiße Faden ähnelt, liegt entlang der Arterie.
5. Schneiden Sie ein 20 cm Stück 6/0 Seidenfaden und "double" ist.
6. Führen Sie das "doppelte" Faden unter der Arterie von links nach rechts. Den Faden abschneiden, um getrennte Enden zu erhalten.
7. Pass ein Drittel Gewinde (10 cm) unterhalb der Arterie.
8. Tie einen festen Knoten in dem Faden in der Nähe des Kopfes positioniert ist, und eine lose ein in der mehr distale Gewinde.
9. Tie eine lose Knoten in der Mitte Gewinde, und fixieren das rechte Ende des mittleren Faden nach Heizkissen mit einem Papierband.
10. Halten Halsschlagader durch Fallenlassen feuchter steriler 0,9% NaCl. Trocknen Sie überschüssige Flüssigkeit mit Wattestäbchen.
11. Dehnen Sie den Unterfaden mit einer Gefäßklemme Klemme.
12. Fixieren Sie die Position des hemostat Schere durch pTippen Sie die Haut des Bauches, Stretching den Oberfaden, um den Blutfluss zu verschließen. Überprüfen Sie, ob das Bindegewebe um die Arterie entfernt wurde. Die Arterie sollte voller Blut und beraubt Puls. Verhindern Fäden aus ein Drehmoment Kraft auf die Arterie.
13. Machen Sie einen Querschnitt nick in der Nähe der Unterseite der Arterie mit einem Vannas Mikro-Schere. Blutstropfen wird verschüttet werden.
14. Legen Sie den Katheter in die Halsschlagader. Achten Sie darauf, die gesamte Drucksensor einzuführen. Stellen Sie sicher, dass es keinen Blutverlust.
15. Schieben Sie vorsichtig den mittleren Faden Knoten, um den Katheter in Position zu halten. Nicht zu viel zu komprimieren, ist der Drucksensor sehr instabil.
16. Lassen Sie die hemostat Schere aus dem Tier Bauch.
17. Halten Sie den Katheter mit der Hand und drücken Sie den mittleren Faden, um den Blutverlust zu vermeiden. Hinweis: Arterie sollte voller Blut.
18. Starten Sie die Aufnahme Drucksignalen.
19. Wenn der Katheter im Inneren ist, derarteriellen Druck Signal schwankt von 60 bis 70 auf 100-120 mmHg. Die Form des Drucksignals ist in Abbildung 1.A. Hinweis gezeigt: wenn Sie interessiert sind, zu diesem Zeitpunkt können Sie arteriellen Druck aufnehmen, wenn das Signal für mindestens 5 min stabil. HR-Werte wurden aus der Druckwellenformen Prüfung eines Intervalls von 30 Sekunden des Aufzeichnungssignals erhalten. Es ist möglich, auch eine EKG Verfahren zur direkten Messung von HR, entsprechend den Untersuchungen Ziele.
20. Schieben Sie den Katheter bis zu einer Änderung in der Form des Drucksignals (Abbildung 1.B) zu beobachten. Sobald der Katheter im Inneren des linken Ventrikels, schwankt das Drucksignal von 0 bis 100 bis 120 mmHg. Wenn es schwierig ist, den Katheter gleiten kann, einzuklemmen tierischen Brust mit zwei Fingern.
21. Kontinuierlich zu steuern Atemfrequenz, Körpertemperatur, Anästhesie und Druck Signal. Alle von ihnen sollte stabil bleiben.

VI. Die Infusion von Dobutamin

1. Einführung eines PE-10 Rohr in die Vene. Bestätigen Sie, dass der Blutfluss nicht blockiert rückwärts bewegt den Kolben der Spritze.
2. Dobutamin Infusion beginnt mit 10 ul / min und enden mit 60 ul / min. In jedem Schritt wird die Infusionsrate für 2 min ⁶ gehalten.
3. Nach dem letzten Dobutamin Dosis, einschläfern das Tier mit einer Überdosis der Anästhesie.

VII. Data Analysis

1. Für die Datenanalyse, wählen Sie den Abschnitt der aufgezeichneten Daten, die Sie interessieren. Achten Sie darauf, um ein Zeitintervall überlegen, wo Drucksignal ist stabil.
2. Wählen Sie das Setup-Symbol in der Blood Pressure Modul. Geben Sie die gewählte Art der Drucksignal.
3. Automatisch die LabChartPro 7 Software zeigt Mittelwert, Maximumund Minimalwerte für HR, systolischer Druck (P _max), der diastolische Druck (P _min), enddiastolische Druck (EDP), maximal Überdruck Entwicklung (dP / dtmax) und maximaler Unterdruck Entwicklung (dP / dt _min). Darüber hinaus können auf der Herzparametern Druckspur darstellen.

Representative Results

Der arterielle Druck wird durch Signal systolischen und diastolischen Druck definiert. Wenn der Drucksensor innerhalb des linken Ventrikels ist, dessen Druck (LVP) Wellenform wird durch einen Abfall auf Null des diastolischen Drucks und dem Auftreten des linken Ventrikels vor Vorhofkontraktion Kontraktion (Abbildung 1). An Ausgangszustand hatte Ketamin-Xylazin anästhesiert normalen Mäusen HR von 280 ± 24, P _max von 107 ± 8, P _min von 5 ± 1, EDP nach 14 ± 2, dP / dt _max von 6081 ± 365 und dP / _dt MIN von 5230 ± 526.

Wie in 2 zu sehen, in normalen Mäusen LVP und HR progressiv erhöht entlang Dobutamin Infusion normalisiert und nach Beendigung der Infusion. Wie erwartet, beurteilt alle hämodynamischen Parameter auch in einer Dobutamin dosisabhängige Weise (Abbildung 3) erhöht. So Dobutamin chronotrope (HR Zunahme) und positiv otropic (LVP und dP / dt _max Erhöhung) Effekte nachgewiesen.

Im Vergleich zu normalen Mäusen, bei fettreichen Diät-induzierte fettleibigen Mäusen beobachteten wir einen geringeren Anstieg der Personal-und dP / dt _max, wenn Herzbelastungstests induziert wird, war statistisch signifikant bei den höchsten Dobutamin getesteten Dosen (Abbildung 4). Diese Unterschiede wurden nicht an Baseline-Bedingungen (0 ng / g / min) festgestellt.

Abbildung 1. Arterielle (A) und Ventrikel (B), erhalten nach der Druckanzeiger Katheterisierung von normalen Mäusen. Hämodynamischen Parameter wurden aus repräsentativen LVP-Zeit Herzzyklen bestimmt. Repräsentative Daten von 5 Tieren. Klicken Sie hier für eine größere Abbildung zu sehen .

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Abbildung 2. LVP (A) und HR (B) registriert während Dobutamin Infusion in normalen Mäusen. Repräsentative Daten von 5 Tieren.

Abbildung 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) und dP / _dt MIN (D) ändert sich während Dobutamin Infusion in normalen Mäusen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. n = 5

Abbildung 4. HR (A) und dP / dt _max (B) Veränderungen während Dobutamin Infusion in Normal-und fettreiche Diät-induzierte fettleibigen Mäusen. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt. * = P <0.05, n = 5

Discussion

Cardiac Stresstest Dobutamin induziert und überwacht durch Herzkatheter ist aufwändig. Dennoch, nachdem das Protokoll hier zu beschreiben und mit einer kurzen Zeit der Ausbildung ist es möglich, bis sechs hämodynamischen Parameter in einem einzigen Experiment, dass dauert ca. 1 Stunde zu beurteilen.

Die kritischen Schritte des Protokolls hier präsentiert sind die Kanülierungen der Blutgefäße. Bezüglich der Kanülierung Halsschlagader, sollte der Einschnitt durchgeführt tief genug sein, um die drei Gewebeschichten der Arterie, und groß genug, um den Durchgang des Katheters zu ermöglichen brechen. Bezüglich der Kanülierung der Vena jugularis, während das Risiko für Blutungen niedrig ist, ist die Möglichkeit der Venenverschluss hoch. So, Protokoll Wiederholgenauigkeit reichlich hängt an der Standardisierung der nicking Strategie verwendet.

Zur Minimierung der Auswirkungen der depressive Wirkung der Anästhesie, Hypothermie und Hypoxie verhindert werden soll und, wenn nötig, Korrekturented. Atemrhythmus sollte immer regelmäßig, weil tief oder unregelmäßiger Atmung beeinflusst LVP Aufnahme.

1 bis 1,5 pg / g / min ^9,10), ii) Betrag der kardialen:;: i) Art der Verabreichung (intravenös: intraperitoneal 0,5 bis 40 ng / g / min ^7,8 Dobutamin Dosen verwendet werden, sollten nach dem angepasst werden Dysfunktion und iii) Ätiologie der kardialen Veränderungen.

Und last but not least, drei praktische Ratschläge: i) bei Tieren mit reichlich Fettgewebe um die Halsschlagader, erlauben eine kleine Menge Blut zu kommen, um die Inzision Grenzen zu erkennen; ii) Halten Sie den Arbeitsbereich befeuchten, weil die Kanülierung Verfahren ist einfacher, wenn der Katheter gut geschmiert; iii) Tagging der Katheter erleichtert die Visualisierung unter dem Mikroskop.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF