心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視される

Summary

我々はドブタミンにより誘導され、正常マウスにおける心臓カテーテル検査によって監視心臓ストレステストを実行するためのプロトコルを記述します。また、我々は、高脂肪食誘発肥満マウスでは無症候性心疾患のマスクを解除するために、そのアプリケーションを示しています。

Abstract

ドブタミンは、動脈_（β2）で発現する受容体よりも心_（β1）に発現した受容体に対して高い親和性を有するβ-アドレナリン受容体アゴニストである。全身的に投与する場合は、心臓の需要を増加させます。したがって、ドブタミンは、心筋梗塞のリスクが潜在的に異常なリズムや虚血領域のマスクを解除。

心臓ストレステスト中に心機能のモニタリングがecocardiographyまたは心臓カテーテル検査のいずれかによって行うことができます。後者は前者、その侵襲性がより正確かつ有益な手法である。

心拍数（HR）、収縮期血圧、拡張期血圧、拡張終期圧、最大正圧：心臓ストレステストドブタミンによって誘導され、ここで説明したように達成心臓カテーテル検査によって監視は、単一の実験では、以下の血行動態パラメータの測定では、でき開発（DP / dtmax）および最大否定的な報道URE開発（dP / dtの_分 ）、ベースライン条件でとドブタミンの漸増用量の下で。

予想されたように、正常マウスで我々は、HR、dP / dtの_最大値およびdP / dtの_分でドブタミン用量依存性の増加を観察した。また、試験した最高用量（12 ng / gの/ min）で高脂肪食餌誘導性肥満マウスの心臓の代償不全がアンマスクされました。

Protocol

プロトコルはAlemana-ティコ大学Desarrollo FacultadデMedicinaのクリニカの倫理委員会によって承認された。

I.はドブタミン投与の準備

1. 500μg/ mlのドブタミンの原液を得るために、滅菌蒸留水20mlにドブタミン10mgを溶解します。 -20℃でアリコートとストアこのソリューションは、3ヶ月間、少なくとも使用することができます。
2. 室温でドブタミンストック溶液のアリコートを解凍します。
3. ドブタミン（μg/ ​​ml）を=体重X 0.2：計算式を用いて算出される濃度ドブタミン実用的なソリューションを得るためには、滅菌0.9％NaCl中ドブタミン原液を希釈します。
4. ドブタミン作業溶液で1 mlシリンジ29Gx1 / 2 "を記入してください。
5. 20センチメートルPE-10チューブに注射器の針を挿入します。
6. メーカーの指示に従って、輸液ポンプ、シリンジを調整します。
7. ステップでランプ注入を設定6つのステップでは、ステップごとに10μl/分の増加に伴って形式をツーステップ実行します。

Ⅱ。圧力センサの準備

1. 少なくとも15分間37℃で滅菌水における信号ドリフト、水没圧力センサを最小限に抑えます。その静水圧が圧力センサに影響を与えないようにするために、0.5以上cm深いカテーテルを浸してはいけません。
2. 電子的に25〜100 mmHgの時に圧力センサーのキャリブレーションを行います。電気入力（ボルト）が圧力信号（mmHg）のに変換されます。
3. 2 K / sのサンプリング·レートを設定し、100 Hzのカットオフでローパスフィルタを使用しています。ゼロmmHgに圧力信号を設定します。
4. 先端からカテーテル15ミリメートルをマークします。導入ポイントから心臓に到達することは遠い左ventriculeにカテーテルの存在を検出し、心エコー検査により推定した。

Ⅲ。カテーテル検査のためにマウスを準備する

1. 重量のC57BL / 6雄マウス、30から32週齢。
2. 腹腔内に60μg/ kgのケタミンと4μg/ kgのキシラジン^1を注入^します 。注：その他の麻酔薬は、例えば、使用されるかもしれません：350から450μg/ kgのAVERTIN、ペントバルビタールまたは1.5 50μg/ kgの- 2％イソフルレン^2-3。
3. 電気かみそりで首を剃る。
4. 暖められた等温加熱プレート上に仰臥位で麻酔マウスを置きます。紙テープとその手足を固定します。
5. 完全鎮静状態を確認するためにつま先のピンチを実行します。
6. 穏やかに体温を監視するために直腸プローブを挿入します。 vaselinizedプローブを使用することをお勧めします。
7. 体温が37から異なる場合℃±0.5℃、加熱板を介してそれを調整してください。
8. 酸素供給の近くにマウスの鼻を入れてください。
9. 実体顕微鏡下でマウスの頸部領域に配置します。

Ⅳ。データ収集

1. LabChartPro 7ソフトウェアでは、圧力登録および心拍数（HR）の1チャネルごとに1つのチャネルを選択する登録。後者については、オプションの "巡回測定"やレートなどのセットアップの測定を選択します。
2. 0から150 mmHgの圧力：チャネルのスケール範囲を設定します。
3. 200から600 BPM：人事チャンネル、スケール範囲を設定してください。
4. 登録を開始し、スタートキーを押します。
5. 例えば実行手順を示すコメントを挿入：麻酔の投与は、変更を呼吸し、ドブタミン投与、ドブタミン濃度の開始。

^4,5 Vの心臓カテーテル検査

1. 顎付近の右側に小さな切開を行います。ハサミで皮膚、筋肉、結合組織を分離します。
2. 気管の右側にある - 縦郭清（2センチメートル1.5）を実行します。気管の近くに右頸動脈を露出させるために、湾曲したピンセットで結合組織、脂肪と筋肉を分離する。
3. 頸動脈を露出させるために動物右側にパンダを置きます。脈打つ心臓によって発生した圧力は、動脈の同定を容易にする。暗赤色である頸静脈は、右側にあります。
4. 湾曲したピンセットで隣接組織から動脈を分離します。白い糸に似ている迷走神経は、動脈に沿って位置しています
5. 6/0絹糸と、それを "二重"の20cmの部分を切り取ります。
6. 左から右への動脈の下に "二重"のスレッドを渡します。別の端を得るために、スレッドをカット。
7. 動脈下の3番目のスレッド（10センチ）を渡します。
8. 頭の近くに位置してスレッド、より遠位の糸が緩んでいない1でタイトな結び目を作る。
9. 真ん中のスレッドで緩い結び目を作る、紙のテープで加熱パッドの真ん中のスレッドの右端に固定してください。
10. 滅菌0.9％NaClをドロップすることにより、頸動脈の潤いを保つ。綿棒で液体の過剰をふいて乾かす。
11. 止血クランプで下糸を伸ばす。
12. pによって止血はさみの位置を固定する血流を閉塞するために、上糸を伸ばし、腹部の皮膚をインチング。動脈周囲の結合組織が削除されていることを確認します。動脈は血液の完全かつパルスを奪わなければなりません。動脈のトルク力を発生させるからスレッドを防ぐ。
13. Vannasマイクロシザーと動脈の下部付近断面ニックネームを作成します。血滴がこぼれされます。
14. 頸動脈にカテーテルを挿入します。全体の圧力センサーを導入するようにしてください。は血液の損失がないことを確認します。
15. 優しく場所にカテーテルを保持するために、中央の糸の結び目を調整します。あまりにも圧縮されません、圧力センサは、非常に壊れやすいです。
16. 動物の腹部から止血はさみを放します。
17. 血液の損失を避けるために、手でカテーテルを保持し、真ん中のスレッドを押し込みます。注意：動脈が血でいっぱいにする必要があります。
18. 記録圧力信号を開始します。
19. カテーテルが内側にある場合には、動脈圧の信号が60から70 100から120 mmHgに変動します。圧力信号の形状は、 図1.A.ノートで示されています：あなたがオンに興味を持っている場合、信号が少なくとも5分間安定していれば、この時点では、動脈圧を記録することができます。 HRの値は、記録信号の30秒の間隔を考慮した圧力波形から得られた。これは、調査の目標に応じて、人事の直接測定のためにも、心電図の方法を用いることができる。
20. 優しく圧力信号（ 図1.B）の形状の変化を観察するためにカテーテルを押し上げる。カテーテルは左心室の内側になると、圧力信号は0 100から120 mmHgに変動します。それはカテーテルをスライドさせることが困難な場合は、2本の指で動物の胸をつまむ。
21. 継続的に呼吸数、体温、麻酔レベルと圧力信号を制御します。それらのすべてが安定している必要があります。

Ⅵ。ドブタミンの点滴

1. 静脈内に、PE-10チューブをご紹介します。血流が後方シリンジのプランジャーを動かすブロックされていないことを確認します。
2. ドブタミン投与は10μl/分で開始し、60μl/分で仕上げてください。すべての工程において、注入速度は2分⁶のために維持されます。
3. 最後ドブタミンの投与後、麻酔の過剰投与で動物を安楽死させる。

Ⅶ。データ解析

1. データ解析のために、あなたの興味のある記録データのセクションを選択します。圧力信号が安定している場所の時間間隔を考慮してください。
2. 血圧モジュールのセットアップ]アイコンを選択します。圧力信号の選択されたタイプを示しています。
3. 自動的にLabChartPro 7ソフトウェアが表示されたら意味、最大人事、収縮期血圧（P _max）は、拡張期血圧（P _分 ）、拡張末期圧（EDP）、最大正圧開発（DP / dtmax）および最大負圧開発（dP / dtの_min）の値と最小値。また、心臓のパラメータが圧力トレースに描写することができます。

Representative Results

動脈圧信号は収縮期血圧と拡張期血圧で定義されています。圧力センサは、左心室の内側にある場合には、その圧力（LVP）波形は拡張期血圧と心室収縮（ 図1）の前に左心房収縮の出現にゼロに低下することを特徴とする。ベースライン状態、ケタミン-キシラジン麻酔下正常マウスで280のHRを持っていた±24、107のP _最大 ±8、5のP _分 ±1、14のEDP±2、6081のdP / dtの_最大 ±365とのdP / dt _minを ±5230の526。

図2に示すように、通常のマウスでは、LVP、HRは徐々にドブタミン投与に沿って上昇し、注入を停止した後に正常化した。予想されたように、すべての血行動態パラメータもドブタミン用量依存的（ 図3）に増加し評価した。したがって、変時ドブタミン（HR増加）との正 otropic（LVP及びdP / dtの_最大増加）の効果が証明されています。

心臓ストレスが誘導されたときに通常のマウスに比べて、高脂肪食誘発肥満マウスでは、我々は（ 図4）試験した最高用量ドブタミンで統計的に有意で、HRおよびdP / dtの_最大値の低い増加を観察した。これらの違いは、ベースライン条件（0 ng / gの/ min）で観察されなかった。

図1動脈（A）および心室（B）の圧力、正常マウスのカテーテル検査後に得られた登録されます。血行動態パラメータは代表LVP対時間の心周期から決定した。 5匹の動物の代表的なデータは。 拡大図を表示するには、ここをクリックしてください 。

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図2：LVP（A）とHR（B）は、正常マウスにおけるドブタミン投与時に登録されます。 5匹の動物の代表的なデータ。

図3：HR（A）は、LVP（B）のdP / dt _MAX（C）およびdP / dtの_分 （D）は、正常マウスにおけるドブタミン投与中に変化する。データは平均±SEMとして表される。 n = 5の場合

図4：HR（A）と、正常および高脂肪食餌誘導性肥満マウスにおけるドブタミン注入中のdP / dt _MAX（B）に変更されます。データは平均±SEMとして表される。 * = P <0.05、n = 5の場合

Discussion

ドブタミンにより誘導され、心臓カテーテル検査によって監視心臓ストレステストは面倒である。それにもかかわらず、プロトコルに従うと、ここで説明するとトレーニングの短い時間で、それは最後の約1時間、その単一の実験で6血行動態パラメータを評価することが可能です。

ここに提示されたプロトコルの重要なステップは、血管のcannulationsです。頸動脈のカニュレーションに関しては、実行切開、カテーテルの通過を許容するのに十分な大きさの動脈の3組織層を破壊するのに十分な深さで、とする必要があります。出血のリスクが低い間、頚静脈のカニュレーションに関しては、静脈閉塞の可能性が高いです。したがって、プロトコルの再現性が十分に使用さニッキング戦略の標準化にハングアップします。

麻酔の抑うつ効果の影響を最小限に抑えるために、低体温、低酸素症を防止し、必要に応じてcorrecされるべきであるテッド。深いまたは不規則な呼吸は、LVPの記録に影響を与えるため、呼吸のリズムが規則的に保つべきである。

使用ドブタミン用量はに応じて調整する必要があります：i）投与経路（静脈内：0.5から40 ng / gの/分^7,8;腹腔内：1から1.5μg/ gに/分^{9,10）、ii）}の心臓の大きさ心の変化の機能不全およびiii）ethiology。

そして最後にではなく、少なくとも、3実用的なアドバイス：i）が頸静脈を取り巻く豊かな脂肪組織を持つ動物では、切開の境界を検出するために、出てくる少量の血液を許可し、ii）はワーキングエリアが湿らせておくため、カニュレーション·プロシージャは、カテーテルがうまく潤滑されたときに単純です。ⅲ）タギングカテーテルは、顕微鏡下で可視化を容易にします。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF