Сердечная стресс-тест индуцированный Dobutamine и контролируется катетеризации сердца у мышей

Summary

Мы описываем протокол для выполнения теста сердечной стресс, вызванный добутамином и контролируется катетеризации сердца у нормальных мышей. Также мы показываем его применения, чтобы разоблачить субклинических сердечных заболеваний в высоким содержанием жиров вызванных ожирением мышами.

Abstract

Dobutamine является β-адренергических агонистов с аффинностью выше рецептора выражается в сердце (β _1), чем к рецепторам выражено в артериях (β _2). При системном введении, он увеличивает сердечный спроса. Таким образом, добутамин разоблачает ненормальный ритм или ишемический областей потенциального риска инфаркта.

Мониторинг функции сердца во время сердечного стресс-теста может быть выполнена либо ecocardiography или катетеризации сердца. Последний является инвазивной, но более точный и информативный метод, который первым.

Сердечная тест стресс, вызванный добутамином и контролируется катетеризации сердца осуществляется, как описано здесь позволяет, в одном эксперименте, измерения следующих параметров гемодинамики: частота сердечных сокращений (ЧСС), систолическое давление, диастолическое давление, конечного диастолического давления, максимальное положительное давление развития (дР / dtmax) и максимальной отрицательной прессыЮр развития (др / дТ _мин), на базовых условиях и при увеличении дозы добутамина.

Как и ожидалось, у нормальных мышей наблюдалось добутамин дозозависимое увеличение HR, др / дТ _Макс и др / дТ _мин. Кроме того, на самом высоком дозе (12 нг / г / мин), сердечная декомпенсация высоким содержанием жиров вызванных ожирением мышей был разоблачен.

Protocol

Протокол был одобрен Комитетом этики Facultad-де-Медицина Клиника Alemana-Университет-дель-Desarrollo.

I. Подготовка Dobutamine Инфузионные

1. Растворите 10 мг добутамина в 20 мл стерильной дистиллированной водой, для того, чтобы получить исходный раствор 500 мкг / мл добутамина. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C. Это решение может быть использовано по крайней мере, в течение 3 месяцев.
2. Оттепель аликвоты добутамин раствора при комнатной температуре.
3. Развести добутамин раствора в стерильный 0,9% NaCl, чтобы получить добутамин рабочий раствор, концентрация которого рассчитывается по формуле: добутамина (мкг / мл) = масса тела х 0,2.
4. Заполнить 1 мл шприц 29Gx1 / 2 "с добутамином рабочего раствора.
5. Введите иглу шприца в 20 см PE-10 трубы.
6. Отрегулируйте шприц в инфузионный насос следующие инструкции производителя.
7. Установка рампы вливания в шагеК шагу формате с увеличением на 10 мкл / мин на каждый шаг, за 6 шагов.

II. Подготовка датчика давления

1. Чтобы свести к минимуму дрейф сигнала, датчик давления погружаются в стерильной воде при 37 ° С в течение 15 мин. Не замачивать катетера более чем на 0,5 см в глубину, в целях предупреждения, что гидростатическое давление влияет на датчик давления.
2. Электронно калибровки датчика давления при 25 и 100 мм рт. Электрическая мощность (Вольт) преобразуется в сигнал давления (мм рт.ст.).
3. Установите частоту дискретизации 2 к / с и использовать фильтр низких частот с отрезанными на частоте 100 Гц. Установить сигнал давления к нулю мм рт.
4. Отметить катетер 15 мм от кончика. Дистанционное дойти до сердца от внедрения точка была оценена с помощью эхокардиографии, обнаружения присутствия катетер в левом ventricule.

III. Подготовка мышь для катетеризации

1. Вес C57BL / 6 мышей-самцов, 30-32 недельных.
2. Inject внутрибрюшинно 60 мкг / кг кетамина и 4 мкг / кг ксилазина ^1. Примечание: другие анестетики могут быть использованы, например: 350 - 450 мкг / кг Avertin, 50 мкг / кг фенобарбитала или 1,5 - 2% изофлурана ^2-3.
3. Бритье шеи с электрической бритвой.
4. Положите под наркозом мыши в положении лежа на нагретых изотермической пластины отопления. Закрепите свои конечности с бумажной ленте.
5. Выполните ноги щепотку, чтобы подтвердить полное успокоение.
6. Аккуратно вставьте ректального датчика для контроля температуры тела. Использование vaselinized зонд рекомендуется.
7. Если температура тела отличается от 37 ° C ± 0,5 ° C, отрегулируйте его с помощью нагревательного элемента.
8. Положите мышь морда у кислорода.
9. Поместите мышь области шеи под стереомикроскопа.

IV. Сбор данных

1. В LabChartPro 7 программного обеспечения, выберите один канал для давления регистрацию и один канал для сердечных сокращений (ЧСС)регистрации. Для последних, выберите опцию "Циклические измерения" и настройка измерений, как скорость.
2. Для давление в канале установить масштаб диапазон: от 0 до 150 мм рт.
3. Для HR канала установлен диапазон измерения: от 200 до 600 ударов в минуту.
4. Нажмите кнопку Пуск, чтобы начать регистрацию.
5. Вставьте комментарии с указанием процедур, выполняемых, например: анестезия администрации, начала инфузии добутамина, добутамин концентрации, дыхательные изменения.

В. катетеризации сердца ^4,5

1. Выполните небольшой разрез на правой стороне рядом с челюстью. С ножницами отделить кожу-мышечной соединительной ткани.
2. Выполнение продольного рассечения (1,5 - 2 см) на правой стороне трахеи. Отделить соединительной ткани, жира и мышц с изогнутым пинцетом, чтобы разоблачить правой сонной артерии вблизи трахеи.
3. Поместите расширителя в животном правой стороны, чтобы разоблачить сонной артерии. ПульсирующийДавление, создаваемое сердцем облегчает идентификацию артерии. Яремную вену, которая является темно-красный, находится на правом.
4. Отделить артерии от прилегающих тканей с изогнутым пинцетом. Блуждающий нерв, который напоминает белую нить, лежит вдоль артерии.
5. Отрежьте 20 см кусок 6/0 шелковые нити и "двойные" его.
6. Пропустите "двойной" нить под артерии слева направо. Обрежьте нить, с целью получения отдельного концами.
7. Передайте третий поток (10 см) ниже артерии.
8. Завяжите тугой узел в цепочке расположены близко к голове, и свободно один в более дистальных поток.
9. Привяжите свободный узел в середине потока, и исправить правый конец середине потока грелку с бумажной лентой.
10. Держите сонной артерии влажные путем отказа от стерильного 0,9% NaCl. Вытрите избыток жидкости с ватными палочками.
11. Растяните нижнюю нить с кровоостанавливающего зажима.
12. Исправить положение кровоостанавливающего ножницами через ртолчковой кожу живота, растяжение верхней нити для того, чтобы закрывать кровотока. Убедитесь, что соединительная ткань вокруг артерии была удалена. Артерия должна быть полна крови и лишили импульса. Предотвращение темы от производства крутящего момента силы на артерии.
13. Сделать сечение ник в нижней части артерии с Vannas микро-ножниц. Капли крови будет пролито.
14. Вставьте катетера в сонную артерию. Будьте уверены, чтобы ввести весь датчик давления. Убедитесь, что нет никакой потери крови.
15. Аккуратно настроить середине узла нити, с тем чтобы провести катетер на месте. Не сжимать слишком много, датчик давления очень хрупкая.
16. Отпустите кровоостанавливающего ножницами от животного живота.
17. Держите катетер с руки и нажмите на среднюю нить, чтобы избежать потери крови. Примечание: артерии должны быть полны крови.
18. Начало записи сигналов давления.
19. Когда катетер находится внутри,артериальное давление сигнала колеблется от 60-70 до 100-120 мм рт. Форма сигнала давления показана на рис 1.A. Примечание: если вы заинтересованы в, в этот момент времени вы можете записать артериального давления, если сигнал является стабильным в течение по крайней мере 5 мин. HR значения были получены от давления сигналов учетом интервалом 30 секунд записи сигнала. Можно также использовать метод ЭКГ для прямого измерения HR, в соответствии с исследованием целей.
20. Аккуратно надавите на катетер до наблюдать изменение формы сигнала давления (рис. 1.В). Как только катетер находится внутри левого желудочка, сигнал давления колеблется от 0 до 100-120 мм рт. Если это трудно сдвинуть катетер, щепотка животного грудь двумя пальцами.
21. Постоянный контроль частоты дыхания, температуры тела, анестезия уровня и давления. Все они должны оставаться стабильными.

VI. Настой Dobutamine

1. Представьте PE-10 трубка в вену. Убедитесь, что поток крови не заблокирован движется в обратном поршень шприца.
2. Dobutamine вливания начинается с 10 мкл / мин и закончить с 60 мкл / мин. В каждом шагу, скорость инфузии сохраняется в течение 2 мин ^6.
3. После введения последней дозы добутамина, усыпить животное с передозировкой наркоза.

VII. Анализ данных

1. Для анализа данных, выбрать раздел записанные данные вашего интереса. Будьте уверены, чтобы рассмотреть временной интервал, когда сигнал давления стабильное.
2. Выберите Установка в модуль артериального давления. Укажите выбранный тип сигнала давления.
3. Автоматически LabChartPro 7 дисплеев программного обеспечения означает, максимальнаяи минимальные значения для HR, систолическое давление (P _макс), диастолическое давление (P _мин), конечного диастолического давления (EDP), максимальное положительное развитие давления (дР / dtmax) и максимальное отрицательное давление развития (др / дТ _мин). Кроме того, сердечные параметры могут быть изображены на давление следа.

Representative Results

Артериальное давление сигнала определяется систолическое и диастолическое давление. Когда датчик давления в левом желудочке, давление (LVP) сигнал характеризуется падением к нулю диастолического давления и появлению левого предсердия до желудочков сокращение сокращение (рис. 1). В исходном состоянии, кетамин-ксилазина наркозом нормальных мышей были HR в 280 ± 24, P _{максимальная} 107 ± 8, P _мин 5 ± 1, EDP от 14 ± 2, др / дТ _{максимальная} 6081 ± 365 и др / дТ _мин от 5230 ± 526.

Как видно на рисунке 2, у нормальных мышей LVP и HR постепенно увеличивается по добутамин вливания, и нормированный после прекращения инфузии. Как и ожидалось, все гемодинамики оценивали также увеличились в добутамин зависимым от дозы образом (рис. 3). Таким образом, добутамин хронотропный (HR увеличение) и положительное в otropic (LVP и др / дТ _{максимальный} прирост) свидетельствуют эффекты.

По сравнению с нормальными мышами, в высоким содержанием жиров вызванных ожирением мышей наблюдались более низкое увеличение HR и др / дТ _макс при сердечной стресс вызывается, были статистически значимы на высоком добутамин дозировках (рис. 4). Эти различия не наблюдались в исходных условиях (0 нг / г / мин).

Рисунок 1. Артериальная (A) и желудочковая (B) давления регистрирует полученное после катетеризации нормальных мышей. Гемодинамические параметры определялись представитель LVP от времени сердечного цикла. Представитель данными из 5 животных. Нажмите, чтобы увеличить показатель .

ных ">
Рисунок 2. LVP (А) и HR (B) регистрируется во время инфузии добутамина у нормальных мышей. Представитель данными из 5 животных.

Рисунок 3. HR (A), LVP (B), DP / DT _Макс (C) и др / дТ _мин (D) изменения во время инфузии добутамина у нормальных мышей. Данные выражены как среднее ± SEM. п = 5

Рисунок 4. HR (A) и др / дТ _Макс (B) изменения во время инфузии добутамина в нормальных и высоким содержанием жиров вызванных ожирением мышами. Данные выражены как среднее ± SEM. * = Р <0,05, п = 5

Discussion

Сердечная тест стресс, вызванный добутамином и контролируется катетеризации сердца является трудоемким. Тем не менее, в соответствии с протоколом здесь описывать и с коротким временем обучения, то можно оценить шесть гемодинамики в одном эксперименте, который длится около одного часа.

Важных шагов протокола Здесь представлены являются cannulations кровеносных сосудов. Что касается катетеризации сонной артерии, разрез выполняется должно быть достаточно глубоким, чтобы сломать трех слоев ткани артерии, и достаточно большой, чтобы разрешить прохождение катетера. Что касается катетеризации яремной вены, в то время как риск кровотечений низкий, возможность окклюзии вен является высокой. Таким образом, протокол повторяемость вполне висит на стандартизацию засечки используемой стратегии.

Чтобы свести к минимуму влияние депрессивного влияния наркоза, гипотермии и гипоксии должны быть предотвращены, и, при необходимости, коррекцияТед. Ритм дыхания следует держать регулярные потому что в глубине или нерегулярное дыхание влияет LVP записи.

Dobutamine дозах должны быть скорректированы в соответствии с: а) путем введения (внутривенно: от 0,5 до 40 нг / г / мин ^7,8; внутрибрюшинно: от 1 до 1,5 мкг / г / мин ^9,10), б) величины сердечного дисфункции и III) этиологии сердечной изменения.

И последнее, но не менее трех практических советов: а) у животных с обильной жировой ткани окружающие яремной вены, позволяющие небольшое количество крови, чтобы выйти, в целях выявления разреза границы; II) сохранить рабочую зону увлажнения, потому что катетеризация процедура проще, когда катетер хорошо смазаны, III) пометки катетера облегчает его визуализации под микроскопом.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF