Prueba de esfuerzo cardíaco inducida por dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco en ratones

Summary

Se describe el protocolo para llevar a cabo una prueba de estrés cardíaco inducido por la dobutamina y monitoreado por cateterismo cardíaco en ratones normales. También se muestra su aplicación a desenmascarar la enfermedad cardíaca subclínica en altos de grasa inducida por dieta ratones obesos.

Abstract

La dobutamina es un agonista β-adrenérgico con una mayor afinidad por el receptor que se expresa en el corazón (β ₁₎ que para los receptores expresados ​​en las arterias (β _2). Cuando la administración sistémica, aumenta la demanda cardiaca. Por lo tanto, la dobutamina desenmascara ritmo anormal o áreas isquémicas potencialmente en riesgo de infarto.

Monitorización de la función cardíaca durante una prueba de esfuerzo cardiaco puede ser realizada por ecocardiografía o cateterismo cardíaco. Esta última es una técnica invasiva pero más preciso e informativo que el primero.

Prueba de estrés cardíaco inducido por la dobutamina y monitoreado por cateterismo cardíaco lograrse como se describe aquí permite, en un solo experimento, la medición de los siguientes parámetros hemodinámicos: frecuencia cardiaca (HR), la presión sistólica, presión diastólica, la presión diastólica final, la presión positiva máxima desarrollo (dP / dtmax) y pulse negativo máximoure desarrollo (dP / dt _min), en condiciones basales y bajo dosis crecientes de dobutamina.

Como era de esperar, en ratones normales se observó una dobutamina aumento dosis-dependiente en HR, dP / dt _max y _min dP / dt. Además, en la dosis más alta probada (12 ng / g / min), la descompensación cardíaca de alto contenido de grasa inducida por dieta ratones obesos fue desenmascarado.

Protocol

Protocolo fue aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina Clínica Alemana-Desarrollo Universidad del.

I. Preparación de la infusión de dobutamina

1. Disolver 10 mg de dobutamina en 20 ml de agua destilada estéril, con el fin de obtener una solución madre de 500 mg / ml dobutamina. Dividir en partes alícuotas y se almacena a -20 ° C. Esta solución se puede utilizar por lo menos durante 3 meses.
2. Descongelar una alícuota de la solución madre de la dobutamina a temperatura ambiente.
3. Diluir solución madre estéril dobutamina en 0,9% de NaCl, con el fin de obtener la solución de trabajo dobutamina, que la concentración se calcula utilizando la fórmula: dobutamina (g / ml) = peso corporal x 0,2.
4. Llene una jeringa de 1 ml 29Gx1 / 2 "con dobutamina solución de trabajo.
5. Insertar la aguja de la jeringa en un 20 cm PE-10 tubo.
6. Ajuste de la jeringa en la bomba de infusión siguiendo instrucciones del fabricante.
7. Configure la infusión rampa en un paso-A-paso formato con un aumento de 10 l / min para cada paso, para 6 pasos.

II. Preparación del sensor de presión

1. Para minimizar la deriva de la señal, sensor de presión sumergir en agua estéril a 37 ° C durante al menos 15 min. No se moje el catéter más de 0,5 cm de profundidad, con el fin de evitar que la presión hidrostática afecta el sensor de presión.
2. Electrónicamente calibrar el sensor de presión a 25 y 100 mmHg. Eléctrica de entrada (V) se convierte en señal de presión (mmHg).
3. Ajuste la tasa de muestreo de 2 K / s y utilizar el filtro de paso bajo con un corte a 100 Hz. Ajuste de señal de presión a cero mmHg.
4. Marcar el catéter 15 mm de la punta. Distante para llegar al corazón desde el punto de introducción se estimó por ecocardiografía, la detección de la presencia del catéter en el ventrículo izquierdo.

III. Preparación del ratón para Cateterización

1. Peso C57BL / 6 ratones machos, 30-32 semanas de edad.
2. Inyectar por vía intraperitoneal 60 mg / kg de ketamina y 4 mg / kg de xilazina ^1. Nota: Los anestésicos Otras podría ser utilizado, por ejemplo: 350 - 450 mg / kg avertina, 50 mg / kg de pentobarbital o 1,5 - 2% de isoflurano ^2-3.
3. Afeitar el cuello con una navaja de afeitar eléctrica.
4. Coloque el ratón anestesiado en posición supina sobre una placa de calentamiento isotérmico calentada. Asegure sus extremidades con cinta de papel.
5. Realice una pizca dedo para confirmar la sedación completa.
6. Suavemente inserte una sonda rectal para controlar la temperatura corporal. Uso de la sonda vaselinized se recomienda.
7. Si la temperatura del cuerpo varía de 37 ° C ± 0,5 ° C, ajústelo a través de la placa de calentamiento.
8. Ponga hocico del ratón cerca del suministro de oxígeno.
9. Coloque la región del cuello ratón bajo el microscopio estereoscópico.

IV. Adquisición de Datos

1. En la LabChartPro 7 software, seleccione un canal para el registro de presión y un canal para la frecuencia cardiaca (HR)registro. En este último caso, seleccione la opción "Mediciones cíclicas" y la medición de configuración como tipo.
2. Para el canal de presión establecer el rango de escala: 0 a 150 mmHg.
3. Para HR canal ajustado rango de la escala: desde 200 hasta 600 bpm.
4. Pulse la tecla de inicio para iniciar el registro.
5. Insertar comentarios que indican los procedimientos realizados, por ejemplo: la administración de la anestesia, el inicio de la infusión de dobutamina, la concentración de la dobutamina, la respiración cambia.

V. Cateterismo Cardíaco ^4,5

1. Realizar una pequeña incisión en el lado derecho cerca de la mandíbula. Con unas tijeras separar el tejido conectivo de la piel muscular.
2. Realizar una disección longitudinal (1,5 - 2 cm) en el lado derecho de la tráquea. Separar el tejido conectivo y grasa, y músculo con pinzas curvas, con el fin de exponer la arteria carótida derecha, cerca de la tráquea.
3. Coloque una ampliación situada en el lado derecho de los animales para exponer la arteria carótida. Pulsátilla presión generada por el corazón, facilita la identificación de la arteria. La vena yugular, que es de color rojo oscuro, está a la derecha.
4. Se separa la arteria de los tejidos adyacentes con pinzas curvas. El nervio vago, que se asemeja a un hilo blanco, se encuentra a lo largo de la arteria.
5. Corte un pedazo de 20 cm de 6/0 hilo de seda y "doble" la misma.
6. Pase el "doble" hilo por debajo de la arteria, de izquierda a derecha. Cortar el hilo, con el fin de obtener extremos separados.
7. Pasar un tercer hilo (10 cm) por debajo de la arteria.
8. Atar un nudo en el hilo colocado cerca de la cabeza, y una suelta en la rosca más distal.
9. Atar un nudo flojo en el hilo medio, y fijar el extremo derecho de la rosca media a la almohadilla de calefacción con una cinta de papel.
10. Mantener la arteria carótida húmedo dejando caer estéril al 0,9% de NaCl. Secar el exceso de líquido con bastoncillos de algodón.
11. Estire el hilo inferior con una pinza hemostática.
12. Fijar la posición de la tijera pinza hemostática por pavanza poco a poco la piel del abdomen, que se extiende el hilo superior, a fin de ocluir el flujo sanguíneo. Verificar que el tejido conectivo alrededor de la arteria se ha eliminado. La arteria debería estar lleno de sangre y privados de pulso. Prevenir hilos de producir una fuerza de torsión sobre la arteria.
13. Hacer una sección transversal nick cerca de la parte inferior de la arteria con un Vannas micro-tijera. Gotas de sangre será derramada.
14. Insertar el catéter en la arteria carótida. Asegúrese de introducir el sensor de presión completo. Verificar que no hay pérdida de sangre.
15. Ajuste suavemente el nudo hilo medio, con el fin de mantener el catéter en su lugar. No comprima demasiado, el sensor de presión es muy frágil.
16. Suelte las tijeras hemostáticas del abdomen animal.
17. Mantener el catéter con la mano y empuje el hilo medio, a fin de evitar la pérdida de sangre. Nota: arteria debería estar lleno de sangre.
18. Iniciar la grabación de señales de presión.
19. Cuando el catéter está en el interior, laseñal de presión arterial fluctúa desde 60 hasta 70 a 100-120 mmHg. La forma de la señal de presión se muestra en la Figura 1.A. Nota: si usted está interesado en, en este punto de tiempo se puede registrar la presión arterial si la señal es estable por lo menos durante 5 min. Valores de la HR se obtuvieron de las formas de onda de presión considerando un intervalo de 30 segundos de señal de registro. Es posible utilizar también un método de ECG para la medición directa de HR, de acuerdo con los objetivos de investigación.
20. Empuje suavemente el catéter hasta observar un cambio en la forma de la señal de presión (Figura 1.B). Una vez que el catéter está en el interior del ventrículo izquierdo, la señal de presión fluctúa de 0 a 100-120 mmHg. Si es difícil deslizar el catéter, pellizcar pecho animal con dos dedos.
21. Controlar de forma continua la velocidad de respiración, la temperatura corporal, el nivel de anestesia y la señal de presión. Todos ellos deben permanecer estables.

VI. La infusión de dobutamina

1. Introducir un tubo de PE-10 en la vena. Confirmar que el flujo sanguíneo no se bloquea moviendo hacia atrás el émbolo de la jeringa.
2. Infusión de dobutamina se inicia con 10 l / min y terminar con 60 l / min. En cada paso, la velocidad de perfusión se mantiene durante 2 min ^6.
3. Después de la última dosis de dobutamina, la eutanasia a los animales con una sobredosis de anestesia.

VII. Análisis de Datos

1. Para el análisis de datos, seleccione la sección de los datos registrados de su interés. Asegúrese de considerar un intervalo de tiempo en que la señal de presión es estable.
2. Seleccione el icono de configuración en el módulo de la tensión arterial. Indicar el tipo seleccionado de la señal de presión.
3. Automáticamente los LabChartPro 7 pantallas de software media, máximoy los valores mínimos de HR, presión sistólica (P _max), la presión diastólica (P _min), la presión diastólica final (EDP), desarrollo máximo de presión positiva (dP / dtmax) y el desarrollo máximo de presión negativa (dP / dt _min). Además, los parámetros cardíacos se pueden representar en el trazado de la presión.

Representative Results

La señal de presión arterial se define por la presión sistólica y diastólica. Cuando el sensor de presión está dentro del ventrículo izquierdo, su presión (LVP) de forma de onda se caracteriza por una caída a cero de la presión diastólica y la aparición de la contracción de la aurícula izquierda antes de la contracción del ventrículo (Figura 1). En su estado básico, ketamina-xilazina ratones normales anestesiados tenía HR de 280 ± 24, P _max de 107 ± 8, P _min de 5 ± 1, EDP de 14 ± 2, dP / dt _max de 6081 ± 365 _min y dP / dt de 5230 ± 526.

Como se ve en la Figura 2, en ratones normales LVP y HR aumenta progresivamente a lo largo de la infusión de dobutamina, y se normalizaron después de parar la infusión. Como era de esperar, todos los parámetros hemodinámicos evaluó también aumentó en un dobutamina manera dependiente de la dosis (Figura 3). Por lo tanto, cronotrópico dobutamina (aumento HR) y positiva en otropic (LVP y dP / dt _max aumento) los efectos son evidentes.

En comparación con los ratones normales, de alto contenido de grasa inducida por dieta ratones obesos se observó un menor aumento de los recursos humanos y dP / dt _máximo esfuerzo cardíaco cuando se induce sido estadísticamente significativa en las dosis más altas de dobutamina a prueba (Figura 4). Estas diferencias no se observaron en las condiciones de referencia (0 ng / g / min).

Figura 1. Arterial (A) y ventricular (B) de presión registra obtenido después de la cateterización de ratones normales. Los parámetros hemodinámicos fueron determinados a partir representativas ciclos de tiempo LVP vs cardíacas. Los datos representativos de 5 animales. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

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Figura 2. LVP (A) y HR (B) registra durante la infusión de dobutamina en ratones normales. Los datos representativos de 5 animales.

Figura 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) y dP / dt _min (D) cambia durante la infusión de dobutamina en ratones normales. Los datos se expresan como media ± SEM. n = 5

Figura 4. HR (A) y dP / dt _max (B) cambia durante la infusión de dobutamina en condiciones normales y de alta grasa inducida por dieta ratones obesos. Los datos se expresan como media ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Prueba de esfuerzo cardíaco inducido por la dobutamina y supervisado por cateterismo cardíaco es laborioso. Sin embargo, siguiendo el protocolo aquí describir y con un corto tiempo de formación, es posible evaluar seis parámetros hemodinámicos en un solo experimento que dura aproximadamente una hora.

Los pasos críticos del protocolo presentado aquí son los canulaciones de los vasos sanguíneos. En cuanto a la canulación de la arteria carótida, la incisión realizada debe ser lo suficientemente profunda para romper las tres capas de tejido de la arteria, y lo suficientemente grande para permitir el paso del catéter. En cuanto a la canulación de la vena yugular, mientras que el riesgo de hemorragia es baja, la posibilidad de oclusión de la vena es alta. Por lo tanto, la repetibilidad protocolo ampliamente cuelga en la estandarización de la estrategia nicking utilizado.

Para minimizar el impacto del efecto depresivo de la anestesia, la hipotermia y la hipoxia debe evitarse y, si es necesario, correcciónted. Ritmo respiratorio debe ser regular, ya mantener la respiración profunda o irregular afecta grabación LVP.

Dosis de dobutamina utilizados deben ajustarse de acuerdo a la: i) la vía de administración (por vía intravenosa: 0,5 a 40 ng / g / min ^7,8; intraperitonealmente: 1 a 1,5 mg / g / min ^9,10), ii) la magnitud del cardíaco disfunción y iii) etiología de la alteración cardíaca.

Y por último pero no menos importante, tres consejos prácticos: i) en los animales con abundante tejido adiposo que rodea la vena yugular, permitir una pequeña cantidad de sangre a salir, con el fin de detectar los bordes de incisión; ii) mantener la zona de trabajo debido a que el humedecer procedimiento de canulación es más sencillo cuando el catéter está bien lubricado; iii) el etiquetado del catéter facilita su visualización en el microscopio.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF