Hjärt stresstest inducerad av dobutamin och övervakas av hjärtkateterisering i möss

Summary

Vi beskriver protokollet att utföra en hjärt stresstest inducerad av dobutamin och övervakas av hjärtkateterisering i normala möss. Också vi visa dess tillämpning att avslöja subklinisk hjärtsjukdom i fettrik kost-inducerad överviktiga möss.

Abstract

Dobutamin är en β-adrenerg agonist med en affinitet högre för receptor uttryckt i hjärtat (β ₁₎ än för receptorer uttryckta i artärerna (β _2). När administreras systemiskt, ökar hjärt efterfrågan. Således avslöjar dobutamin onormal rytm eller ischemiska områden som kan utsättas för risken för infarkt.

Övervakning av hjärtats funktion under en hjärt stresstest kan utföras antingen genom ecocardiography eller hjärtkateterisering. Det senare är en invasiv men mer exakt och informativ teknik som den förra.

Hjärt stresstest inducerad av dobutamin och övervakas av hjärtkateterisering utförs som beskrivs här tillåter i ett enda experiment, mätning av följande hemodynamiska parametrar: hjärtfrekvens (HR), systoliskt tryck, diastoliskt tryck, slutet diastoliska trycket, maximalt övertryck utveckling (dP / dtmax) och maximal negativ pressure utveckling (dP / dt _min) vid baslinjen förhållanden och under ökande doser av dobutamin.

Som väntat i normala möss vi observerade en dobutamin dosrelaterad ökning inom HR, dP / dt _max och dP / dt _min. Vid den högsta testade dosen (12 ng / g / min) hjärtdekompensation av fettrik kost-inducerad överviktiga möss avslöjade.

Protocol

Protokoll godkändes av etik kommitté Facultad de Medicina Clinica Alemana-Universidad del Desarrollo.

I. Förbereda dobutamininfusion

1. Lös 10 mg dobutamin i 20 ml sterilt vatten destilleras, för att erhålla en stamlösning av 500 pg / ml dobutamin. Alikvot och lagra vid -20 ° C. Denna lösning kan användas i minst 3 månader.
2. Tina en alikvot av dobutamin stamlösning vid rumstemperatur.
3. Späd dobutamin förrådslösning i steril 0,9% NaCl, för att erhålla dobutamin arbetslösning, vilken koncentrationen beräknas med användning av formeln: dobutamin (ig / ml) = kroppsvikt x 0,2.
4. Fyll en 1 ml spruta 29Gx1 / 2 "med dobutamin arbetslösning.
5. Stick in nålen i sprutan i en 20 cm PE-10 rör.
6. Justera sprutan i infusionspumpen enligt tillverkarens instruktioner.
7. Ställ in rampen infusion i ett steg-Till-steg-format med en ökning på 10 ul / min för varje steg, för 6 steg.

II. Förbereda Trycksensor

1. För att minimera signaldrift, doppa trycksensor i sterilt vatten vid 37 ° C under minst 15 minuter. Blötlägg inte katetern mer än 0,5 cm djup, för att förhindra att hydrostatiskt tryck påverkar tryckgivaren.
2. Elektroniskt kalibrera tryckgivaren vid 25 och 100 mm Hg. Elektrisk insignal (Volt) omvandlas till trycksignal (mmHg).
3. Ange samplingshastigheten 2 k / s och använda filtret lågpass med avskuren vid 100 Hz. Ställ trycksignal till noll mmHg.
4. Markera katetern 15 mm från spetsen. Vidsträckt att nå hjärtat från införandet punkten uppskattades genom ekokardiografi, detektera närvaron av katetern i det vänstra ventricule.

III. Förbereda musen för Kateterisering

1. Vikt C57BL / 6 hanmöss, 30-32 veckor gamla.
2. Injicera intraperitonealt 60 pg / kg ketamin och 4 ng / kg xylazin ^1. Obs: Andra anestetika kan användas, till exempel: 350 - 450 pg / kg Avertin, 50 pg / kg pentobarbital eller 1,5 - 2% isofluran ^2-3.
3. Raka halsen med en elektrisk rakapparat.
4. Placera sövda musen i ryggläge på en uppvärmd isotermisk värmeplatta. Säkra sina lemmar med papper tejp.
5. Gör en tå nypa för att bekräfta fullständig sedering.
6. Försiktigt in en rektal sond för att övervaka kroppstemperaturen. Använda vaselinized sond rekommenderas.
7. Om kroppstemperatur avviker från 37 ° C ± 0,5 ° C, justera den via värmeplattan.
8. Placera musen nos nära syretillförseln.
9. Placera regionen musen halsen i stereomikroskop.

IV. Data Acquisition

1. I LabChartPro 7 programmet väljer en kanal för tryck registrering och en kanal för hjärtfrekvens (HR)registrering. För det senare, väljer du alternativet "Cykliska Mått" och setup mätning som ränta.
2. För tryckkanalen in skalan: 0 till 150 mmHg.
3. För HR-kanal som skalområde: 200 till 600 slag per minut.
4. Tryck på startknappen för att starta registreringen.
5. Infoga kommentarer som indikerar procedurer utförs, till exempel: anestesi administration start av dobutamininfusion, dobutamin koncentration, andning förändringar.

V. hjärtkateterisering ^4,5

1. Utför ett litet snitt på den högra sidan nära käken. Med sax separera huden-muskulära bindväv.
2. Utför en längsgående dissektion (1,5 - 2 cm) på höger sida av luftstrupen. Separera bindväv, fett och muskler med krökta tång, för att exponera den högra halspulsådern nära luftstrupen.
3. Placera en expander i djuret höger sida för att exponera halspulsådern. PULSERANDEtryck som genereras av hjärtat underlättar identifieringen av artären. Den halsvenen, vilket är mörkröd, är till höger.
4. Separera artären från intilliggande vävnader med böjda pincett. Vagusnerven, som liknar en vit tråd, ligger längs artären.
5. Skär en 20 cm bit 6/0 silkestråd och "dubbel" det.
6. Passera "dubbla" tråden under artären från vänster till höger. Klipp av tråden, för att få separata ändar.
7. Passera tredjedel gänga (10 cm) under artären.
8. Knyt en stram knut i tråden placerad nära huvudet, och en lös en i den mer distala tråden.
9. Knyt en lös knut i mitten tråd, och fixa den högra änden av den mellersta tråden till värmedynan med papperstejp.
10. Håll halspulsådern fuktig genom att droppa steril 0,9% NaCl. Torka bort överflödig vätska med bomullspinnar.
11. Sträck undertråden med en hemostat klämma.
12. Fixera position hemostat sax av pjoggning huden på buken, sträcker övertråden, i syfte att täppa blodflödet. Kontrollera att bindväv runt artären har avlägsnats. Artären bör vara full av blod och berövade puls. Förhindra trådar från att producera ett vridmoment kraft på artären.
13. Gör ett tvärsnitt nick nära botten i artären med en Vännäs mikro-sax. Blod droppar kommer att spillas.
14. Föra in katetern i halsartären. Var noga med att introducera hela tryckgivaren. Kontrollera att det inte finns någon blodförlust.
15. Justera försiktigt i mitten tråd knut, för att hålla katetern på plats. Inte komprimera alltför mycket, är trycksensorn mycket bräcklig.
16. Släpp hemostat saxen från djuret buken.
17. Håll katetern med handen och tryck i mitten tråden, för att undvika blodförlust. Obs: artär bör vara full av blod.
18. Start signaler inspelning tryck.
19. När katetern är inuti denarteriella trycksignalen varierar från 60 till 70 till 100-120 mm Hg. Formen på trycksignalen visas i figur 1.A. Obs: om du är intresserad av, vid denna tidpunkt kan du spela artärtryck om signalen är stabil i minst 5 minuter. HR-värdena erhölls från tryckvågformer överväger ett intervall av 30 sekunder av inspelningssignalen. Det är möjligt att även använda en EKG metod för direkt mätning av HR, enligt de undersökningar mål.
20. Tryck försiktigt katetern upp för att observera en förändring i form av trycksignalen (Figur 1 B). När katetern är inuti den vänstra ventrikeln fluktuerar trycksignalen från 0 till 100-120 mm Hg. Om det är svårt att skjuta katetern nypa djur bröstet med två fingrar.
21. Kontinuerligt styra andningsfrekvens, kroppstemperatur, anestesi-nivå och trycksignal. Alla av dem bör förbli oförändrade.

VI. Infusion av Dobutamin

1. Införa en PE-10 rör i venen. Kontrollera att blodflödet inte är blockerad rör bakåt sprutkolven.
2. Dobutamininfusion börjar med 10 pl / min och avsluta med 60 ul / min. I varje steg, är infusionshastigheten upprätthölls under 2 minuter ^6.
3. Efter sista dobutamin dosen avliva djuret med en överdos av anestesi.

VII. Dataanalys

1. För dataanalys väljer den del av de registrerade uppgifterna i ditt intresse. Var noga med att överväga ett tidsintervall där trycksignal är stabil.
2. Välj Inställningar-ikonen i blodtryck modulen. Ange den valda typen av trycksignal.
3. Automatiskt LabChartPro 7 visas programmet innebär, maxoch minimivärden för HR, systoliskt tryck (p _max), diastoliskt tryck (P _min), slutdiastoliska tryck (EDP), maximalt övertryck utveckling (dP / dtmax) och maximal undertryck utveckling (dP / dt _min). Dessutom, kan hjärtparametrar kan avbildas på trycket kurvan.

Representative Results

Den arteriella trycksignalen definieras av systoliskt och diastoliskt tryck. När trycksensorn är inuti den vänstra ventrikeln, vågform dess tryck (LVP) kännetecknas av en droppe till noll av det diastoliska trycket och utseendet hos vänstra förmakets sammandragning före ventrikeln kontraktion (figur 1). Vid ursprungliga tillståndet hade ketamin-xylazin sövda normala möss HR på 280 ± 24, P _max 107 ± 8, P _min för 5 ± 1, EDP av 14 ± 2, dP / dt _max 6081 ± 365 och dP / dt _min av 5230 ± 526.

Såsom framgår av fig. 2, i normala möss LVP och HR ökade progressivt längs dobutamininfusion, och normaliserades efter avslutad infusion. Som förväntat utvärderat alla hemodynamiska parametrar också ökat i en dobutamin dosberoende sätt (Figur 3). Således, dobutamin kronotrop (HR ökning) och positivt otropic (LVP och dP / dt _max ökning) effekter påvisas.

Jämfört med normala möss, i fettrik kost-inducerad överviktiga möss vi observerade en lägre ökning av HR och dP / dt _max när hjärt stress framkallas, varit statistiskt signifikant vid de högsta dobutamin doserna testade (Figur 4). Dessa skillnader observerades inte vid baslinjen förhållanden (0 ng / g / min).

Figur 1. Arteriell (A) och ventrikulär (B) tryck register erhålls efter kateterisering av normala möss. Hemodynamiska parametrar bestämdes från representativa LVP vs tid hjärtcykler. Representativa data för 5 djur. Klicka här för att se större bild .

ENT ">
Figur 2. LVP (A) och HR (B) registrerar under dobutamininfusion i normala möss. Representativa data för 5 djur.

Figur 3. HR (A), LVP (B), dP / dt _max (C) och dP / _dt MIN (D) förändras under dobutamininfusion i normala möss. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. n = 5

Figur 4. HR (A) och dP / dt _max (B) förändringar under dobutamininfusion i normala och fettrik kost-inducerad överviktiga möss. Data uttrycks som medelvärde ± SEM. * = P <0,05, n = 5

Discussion

Hjärt stresstest inducerad av dobutamin och övervakas av hjärtkateterisering är mödosam. Ändå, efter protokollet här beskriva och med en kort tid av utbildning, är det möjligt att bedöma sex hemodynamiska parametrar i ett enda experiment som varar cirka en timme.

De kritiska stegen i protokollet som presenteras här är cannulations av blodkärl. Beträffande kanylering av halspulsådern, bör snittet utförs vara så djup att bryta de tre vävnadsskikten i artären, och stora nog för att tillåta passage av katetern. Beträffande kanylering av halsvenen, medan risken för blödning är låg, är risken för venocklusion hög. Således hänger protokoll repeterbarhet tydligt om standardisering av den använda nicking strategi.

För att minimera effekterna av depressiva effekten av anestesi, hypotermi och hypoxi bör förhindras och, om nödvändigt, korrigeringarTed. Andning rytm bör hålla regelbunden eftersom djup eller oregelbunden andning påverkar LVP inspelning.

Dobutamin använda doser bör justeras i enlighet med i) administreringsväg (intravenös: 0,5 till 40 ng / g / min ^7,8, intraperitonealt: 1 till 1,5 g / g / min ^9,10), ii) omfattningen av hjärt dysfunktion och iii) etiologi av hjärt förändring.

Och sist men inte minst, tre praktiska råd: I) i djur med riklig fettvävnad som omger halsvenen, tillåta en liten mängd blod att komma ut, för att upptäcka snittet gränser, ii) hålla arbetsområdet Fukta eftersom kanylering förfarandet är enklare när katetern väl smord, iii) märkning katetern underlättar visualisering under mikroskop.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
PE-50/10	Warner Instruments	64-0752
Silk thread 6/0 HR17	Tagum	SN0713K
Xylacin 20 mg/ml	Laboratorio Centrovet
Ketamine 100 mg/ml	Drag Pharma
Sodium chloride 0.9%	Lab Sanderson S.A.
Dobutamine hydrochloride	Sigma-Aldrich	D0676
Syringe U-100 Insulin 29G x ½"	Terumo Medical Co.
Forceps Dissecting Micro 11.5 cm Style 7	Lawton Medizintechnik	09-0959
Graefe Forceps Cvd 0.7mm 7cm	Lawton Medizintechnik	62-0263
Clamps Dieffenbach bulldog Cl Str 38 mm	Lawton Medizintechnik	60-010
Vannas Scissors 8 cm Str Fh	Lawton Medizintechnik	63-1400
Equipment
SPR-671 MiKro-Tip Pressure catheter	Millar instruments	840-6719
PCU-2000 Pressure Control Unit	Millar instruments	880-0129
PowerLab 4/30	ADinstruments Pty Ltd.	ML866
LabChartPro 7	ADinstruments Pty Ltd.	MLU260/7
Legato200 Infusion Pump	KdScientific	KD-KDS210P
TCAT-2LV Temperature controller and isothermal heating plate	PhysiTemp instruments Inc.
Medical Oxygen supply	Indura
Rectal probe	ADinstruments Pty Ltd.	MLT1404
Trinocular microscope, axial illumination	LW Scientific	Z2B-TRI-ETNE, ILP-1502-LTS1, ILP-1502-DGGF