Summary
Vi presentiamo un metodo per creare un assottigliata-teschio finestra corticale (TSCW) in un modello di topo per
Abstract
Tomografia a coerenza ottica (OCT) è una tecnica di imaging biomedico ad alta risoluzione spazio-temporale. Con il suo approccio mini-invasivo ottobre è stato ampiamente utilizzato in oftalmologia, dermatologia, gastroenterologia e 1-3. Utilizzando una finestra assottigliata cranio-corticale (TSCW), ci avvaliamo di spectral-domain OCT (SD-OCT) modalità come strumento per l'immagine della corteccia in vivo. Comunemente, un aperto-cranio è stato utilizzato per neuro-imaging in quanto fornisce una maggiore versatilità, tuttavia, un approccio TSCW è meno invasiva ed è un mezzo efficace per l'imaging lungo termine in studi neuropatologia. Qui, presentiamo un metodo per creare un TSCW in un modello di topo per l'imaging in vivo ottobre della corteccia cerebrale.
Introduction
Dalla sua introduzione nei primi anni del 1990, ottobre è stato ampiamente utilizzato per l'imaging biologico della struttura dei tessuti e la funzione 2. Ottobre genera immagini in sezione trasversale misurando il tempo di ritardo dell'eco di 4 luce riflessa mediante l'attuazione di bassa coerenza con sorgente di luce a fibre ottiche 2,4 interferometro di Michelson. SD-OCT, noto anche come dominio di Fourier ottobre (FD-OCT), è stato introdotto nel 1995 5 e offre una modalità di imaging superiore rispetto alla tradizionale dominio del tempo OCT (TD-OCT). In SD-ottobre, il braccio di riferimento viene mantenuto fermo con conseguente alta velocità e ad altissima risoluzione di acquisizione dell'immagine 6-9.
Attualmente, i modelli TSCW sono stati ampiamente utilizzati in applicazioni per brain imaging in vivo di due fotoni microscopia in luogo di una craniotomia tradizionale. Questi TSCW sono stati utilizzati in concomitanza con un piatto cranio personalizzato o un foglio di copertura in vetro 10-13 per fornire ulteriori imaging stabilità. Nei nostri studi, abbiamo osservato che gli accessori come questi non sono necessari per l'imaging ottobre quando un TSCW viene utilizzato. Pertanto, la mancanza di una piastra cranio o vetrini di vetro consente una più ampia gamma di dimensioni di imaging finestra in quanto potrebbero interferire con il fascio ottico e modificare immagini ottobre
A assottigliata-cranio preparazione ha dimostrato di essere vantaggioso in studi di imaging del cervello utilizzando due fotoni microscopia 10-13. Nei nostri esperimenti, ci avvaliamo di un sistema SD-OCT per l'immagine del corteccia in vivo attraverso un TSCW. La nostra misura SD-OCT installazione di imaging contiene una, la banda larga a bassa coerenza sorgente luminosa costituita da due diodi superluminescenti (SLD) centrato a 1295 nm con una larghezza di banda di 97 nm con un conseguente risoluzione assiale e laterale di 8 micron e 20 micron, rispettivamente 14 . Con il nostro dispositivo di imaging ottico, prevediamo che l'imaging attraverso un TSCW ha un grande potenziale per individuare e visualizzare le strutture e le funzioni in otessuti del cervello ptically denso.
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Protocol
1. Preparazione chirurgica
- Femmina CD 1 topi di età compresa tra 6-8 settimane sono state utilizzate nei nostri esperimenti.
- Anestetizzare il mouse con una iniezione intraperitoneale di una combinazione di chetamina e xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xilazina). Posizionare il mouse su un tappetino omeotermi per garantire una temperatura ottimale del corpo a ~ 37 ° C. Monitorare costantemente il livello di anestesia testando riflessi dell'animale (ad esempio, pizzicando piedi con una pinza smussati) e iniettare più l'anestesia in caso di necessità.
- Lubrificare entrambi gli occhi con un unguento lacrima artificiale. Rimuovere i peli sul cuoio capelluto con un rasoio e rimuovere i capelli residui usa il 70% di preparazione tamponi di alcol. Applicare uno strato sottile di crema di rimozione dei capelli Nair sul cuoio capelluto e attendere 2 minuti per esso abbia effetto. Pulire delicatamente via i capelli Nair e rimanente utilizzando tamponi di cotone inumiditi salina e pastiglie di preparazione alcol. Cuoio capelluto dovrebbe ora essere completamente glabro.
- Disinfezione cuoio capelluto con un bastone betadine tampone e pulire con 70% etanolo preparazione pastiglie.
- Avvolgete l'animale in teli chirurgici per garantire una temperatura ottimale del corpo di ~ 37 ° C e montare l'animale su un telaio stereotassico per immobilizzare il cranio. Battere leggermente il cranio per garantirne la stabilità. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1.
2. Diluito-cranio Preparazione finestra corticale
- Avviare l'incisione nel punto mediano tra gli occhi. Continua caudalmente al punto linea mediana tra le orecchie. Parte la pelle con una pinza.
- Individuare l'area deve essere diluito con un microscopio da dissezione e rimuovere delicatamente la fascia con una pinzetta. Asciugare il cranio con tamponi di cotone sterili prima di creare la finestra corticale assottigliata. Nei nostri esperimenti, abbiamo creato un 4 × 4 mm diluito cranica finestra ~ 1 mm posteriormente e lateralmente al bregma.
- Cominci a diventare calvo cranio con un rotondo fresa in carburo di dimensioni punta 0,75 millimetri in un trapano a mano chirurgica utilizzando la luce onl travolgente movimentoy. Non applicare una pressione diretta sul cranio. Interrompere il fresaggio ogni 20-30 secondi per rimuovere la polvere osseo con soluzione salina sterile e tamponi di cotone e per evitare surriscaldamento del cranio. La soluzione salina aiuterà anche a dissipare il calore in tutto il cranio.
- Una volta che lo strato esterno di osso compatto viene completamente rimosso lo strato centrale dell'osso spugnoso dovrebbe essere visibile. Ci può essere qualche leggero sanguinamento da vasi sanguigni sono più evidenti nello strato osso spugnoso. Passare a una fresa pietra verde e continua che si esercita con cautela come strato spugnoso è più delicata. La fresa pietra verde sarà rimuovere il materiale meno osso creando uniformità in tutta la finestra del cranio. Interrompere il fresaggio di tanto in tanto per rimuovere la polvere delle ossa e per raffreddare il cranio.
- Infine, quando il cranio è diventato più trasparente e vascolarizzazione del cervello è ora visibile, iniziare la lucidatura del cranio con una fresa di lucidatura. Ciò consentirà una più precisa assottigliamento mentre lisciandosi il cranio. Controllare magrezza del skull picchiettando delicatamente su di esso con una pinza. Arrestare lucidatura quando il cranio diventa leggermente flessibile.
- La finestra diluito cranica dovrebbe essere completamente liscia e riflettente e pronto per l'imaging (Figura 1). A causa della natura dei tessuti altamente diffondenti del cervello, il cranio deve essere diluito ad almeno 55 micron di profondità di penetrazione ottimale. Un elenco di materiali utilizzati sono fornite nella Tabella 1.
3. Tomografia a coerenza ottica Imaging
- Dopo l'intervento chirurgico è completa, controllare la frequenza respiratoria dell'animale e riflessi di garantire adeguato livello di anestesia e somministrare l'anestesia supplementari, se necessario. Rimuovere animale dal telaio stereotassico, tenere animale avvolto in teli chirurgici, e degli animali il trasporto alla stazione di imaging.
- Prima di controllare i segni di imaging per i riflessi e applicare ulteriori lacrima artificiale se necessario. Animale montare sul telaio stereotassico per fissare il cranio.
- Luogo animale inOttobre fotocamera e la posizione TSCW sotto il fascio ottico (Figura 2). Una vista in sezione trasversale del cranio e cervello può ora essere visualizzati (Figura 3).
- L'acquisizione dei dati può iniziare un tempo area di interesse si trova. Per scopi di imaging, usiamo specchi galvanometrica per ottenere una finestra di imaging con una larghezza di 4,0 mm. Una profondità di 2 mm di imaging è stato ottenuto con 6 mW di potenza incidente e un punto focale 1 mm sotto il cranio assottigliato. Ogni sezione trasversale costituita da 2.048 scansioni assiali con un tasso di acquisizione di 0,14 sec per immagine.
- Scansioni volumetriche del cervello può anche essere ottenuta raccogliendo una serie di 2D immagini trasversali mediante due serie di specchi per Galvo xy scansione con il primo specchio galvo scansione del fascio nella direzione sagittale e il secondo specchio di scansione galvanometrica nel coronale direzione.
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Representative Results
Dopo aver creato una finestra assottigliata sulla corteccia cerebrale vascolarizzazione dovrebbe essere ora evidenziare visivamente (Figura 1) e consentirà una profondità di imaging profondo (fino a 1 mm). La corteccia destra viene diluito a circa 55 micron, rispetto ad un teschio normale misurato a 140 micron (Figura 1) e fornisce maggiore chiarezza ottica. Ulteriori diradamento a 10-15 micron è possibile 11 Non occorre tuttavia che l'uso di vetrini in vetro e piastre cranio non sono implementati nei nostri esperimenti (Figura 1 e 2). Questo particolare metodo ha permesso di identificare le strutture specifiche (corteccia cerebrale, corpo calloso) nei nostri Ottobre immagini in sezione trasversale (Figura 3). Parasagittali Ottobre immagini di un teschio normale (Figura 3A) contro un teschio assottigliata (Figura 3B) sono mostrate per confrontare il risultato di un'immagine ottobre TSCW con successo. Inoltre, una sezione coronale ottobredell'immagine è ottenuta anche per facilitare l'identificazione delle strutture mediane (Figura 3C). L'intensità del segnale massima per la figura 3 è 45 dB sopra il rumore di fondo. Un confronto profilo di intensità di un teschio non diluito e un teschio assottigliato rivela un segnale di maggiore intensità e la profondità di penetrazione in un modello TSCW (Figura 4).
Figura 1. TSCW in un modello murino. A 4 × 4 Finestra cranio millimetro diluito (indicato nel riquadro tratteggiato piazza) è stato creato ~ 1 mm posteriormente e lateralmente al bregma sopra l'emisfero cerebrale destro con varie frese dentali. Il diritto corteccia (diluito a circa 55 micron) è significativamente più trasparente del cranio non diluito (a sinistra corteccia, 140 micron) che fornisce maggiore profondità di penetrazione per l'imaging ottico utilizzando ottobre β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal sutura.
Figura 2. Ottobre imaging di TSCW in vivo. Un modello di topo con un assottigliata-cranio è fissato in un telaio stereotassico all'obiettivo per l'imaging in vivo ottobre.
Figura 3. Immagini ottobre della corteccia cerebrale in vivo. (A) parasagittale immagine ottobre della corteccia sotto un cranio normale. (B) parasagittale ottobre immagine della corteccia sotto un teschio assottigliata. (C) coronale immagine di un teschio ottobre assottigliata (a sinistra) e un teschio normale (a destra). Le strutture del cervello sono visivamente più evidenti sotto un TSCW rispetto ad un teschio normale. Immagini da ottobre sono stati ottenuti dal topo in vivo con la stessa dimensione di imaging 50,5 millimetri × 2 mm con intensità di segnale massima di 45 dB. β = bregma, CC = corpo calloso, SS = sutura sagittale, barra della scala = 1 mm.
Figura 4. Confronti di intensità del profilo di preparazione cranio normale e diluito. TSCW permette intensità di segnale maggiore e penetrazione in profondità. Il TSCW raggiunge una profondità di imaging di circa 1 mm con sufficiente SNR.
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Discussion
Imaging con OCT e assottigliato-teschio è un romanzo neuro-imaging tecnica che è solo stato recentemente studiato 15, 16. Nei nostri esperimenti, abbiamo dimostrato la fattibilità di SD-OCT immagini attraverso un TSCW in un modello di topo in vivo. Dai risultati ottenuti, il cranio è assottigliata a circa 55 micron e la profondità di penetrazione è ottenuta a circa 1 mm con risoluzione di immagine di 8 um e 20 um in direzione assiale e laterale, rispettivamente. Nel profilo di intensità di segnale, Ottobre immagini attraverso un TSCW aumenta l'intensità del segnale e la profondità di penetrazione rispetto ad un teschio normale (Figura 4). In confronto, due fotoni imaging con un TSCW a spessore cranio di ~ 10-15 micron può raggiungere profondità di imaging di 150-250 micron sotto la superficie piale 10, 11, 13 con risoluzione assiale a ~ 3 um 10 mentre un teschio assottigliata di ~ 20 profondità di imaging micron può raggiungere fino a 300-400 micron all'interno della corteccia cerebrale 12. Overall, imaging ottico con OCT rivela un promettente modalità di imaging, permettendo una più spessa TSCW durante il processo di assottigliamento, fornendo una penetrazione più profonda profondità di microscopia mutiphoton.
Utilizzando un assottigliata-cranio è vantaggioso in imaging ottico come 15 ottobre, 16 e due fotoni microscopia 10-13 quanto fornisce poca o nessuna neuroinflammation rispetto ad una craniotomia se diradamento è condotta con successo 11, 12, 15, 16,. Impiegando una craniotomia per l'imaging può provocare microglia reattiva nonché upregulation di proteina acida fibrillare gliale (GFAP) in astrociti reattivi dopo insulti al cervello. Tuttavia, le immagini dopo l'adozione di un assottigliato-teschio tecnica rivela non attivo microglia e immunostaining GFAP debole implica non-reattivi astrociti 10. Attraverso appositi assottigliamento del cranio, strutture specifiche all'interno della corteccia cerebrale, quali la morfologia microglia e vascolarizzazione corticale, cun essere distinto 11-13. Tuttavia, ci sono svantaggi di usare un TSCW per imaging ottico. Se il cranio non è assottigliata allo spessore corretto o il cranio ha superfici ruvide a causa improprio penetrazione in profondità diluizione per imaging può essere limitata. Un altro aspetto negativo per la profondità di imaging poveri possono derivare da sub-durale emorragia a causa di vibrazioni di perforazione. Sanguinamento sotto la dura madre è inevitabile e, pertanto, non può essere utilizzato per l'imaging ottobre. In casi come questi, un nuovo modello animale deve essere usato per l'esperimento.
Identificare alcune strutture nella corteccia usando ottobre attraverso un TSCW può essere utile per il monitoraggio delle malattie neurodegenerative e per studiare i cambiamenti nella funzione del cervello. Imaging flusso sanguigno può essere raggiunto attraverso Doppler 17 ottobre, 18 come quantificare flusso cerebrale è fondamentale nel monitoraggio le richieste metaboliche del cervello nello studio ictus, morbo di Alzheimer 18, 17 o tumori cerebrali. Assonalee la degenerazione neuronale è anche di primo piano nelle immagini ottobre e possono beneficiare studi di vari disturbi del cervello. Con immagini della retina strato delle fibre nervose (RNFL), che contiene gli assoni delle cellule gangliari, i meccanismi di neuro-degenerazione, neuro-protezione, e neuro-riparazione possono essere visualizzati non solo nei disturbi ottici, ma anche in malattie neurologiche come il Parkinson 19 e più sclerosi 20, 21, quest'ultima che è stato esplorato in dettaglio misurando lo spessore macula strato 21 e retinica attraverso tecniche di segmentazione 20 ottobre.
Neuro-imaging con OCT è non solo limitata alle strutture e funzioni di imaging del cervello. Ottobre può essere vantaggioso in cronica imaging in vivo 10, 11, nonché nelle procedure stereotassiche come studi elettrofisiologici e microiniezione 1, 3, 15-17. In neurochirurgia, ottobre può essere usato come strumento di biopsia o guida 2, consentendo di visualizzare chirurghiimmagini in tempo reale di retroazione di specifiche caratteristiche anatomiche del cervello 17. Con ulteriori sviluppi, riteniamo che il nostro attuale combinazione di SD-OCT con un TSCW ha il potenziale di migliorare la capacità di un medico di deficit diagnosi neurologici quando viene applicato con altre modalità, come una pressione intracranica (ICP), monitor 22, la risonanza magnetica ( MRI) o la tomografia assiale computerizzata (CAT) 1.
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Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dalla prova UC Discovery di concessione Concept e dal NIH (R00 EB007241). Gli autori desiderano inoltre ringraziare Jacqueline Hubbard per la sua assistenza in questo esperimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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