Summary
Se presenta un método de creación de una ventana adelgazada cráneo cortical (TSCW) en un modelo de ratón para
Abstract
Tomografía de Coherencia Óptica (OCT) es una técnica de imagen biomédica con alta resolución espacial y temporal. Con su enfoque mínimamente invasivo octubre se ha utilizado ampliamente en oftalmología, dermatología, gastroenterología y 1-3. Usando una ventana adelgazado-skull cortical (TSCW), empleamos dominio espectral OCT (SD-OCT) modalidad como una herramienta para la imagen de la corteza en vivo. Comúnmente, un cráneo abierto-se ha utilizado para neuroimagen, ya que proporciona más versatilidad, sin embargo, un enfoque TSCW es menos invasiva y es un medio eficaz para la formación de imágenes a largo plazo en los estudios de neuropatología. Aquí, se presenta un método de creación de un TSCW en un modelo de ratón para la formación de imágenes in vivo octubre de la corteza cerebral.
Introduction
Desde su introducción en la década de 1990, octubre se ha utilizado ampliamente para formación de imágenes biológicas de la estructura tisular y la función 2. Octubre genera imágenes transversales mediante la medición de retardo del eco de tiempo de 4 luz dispersada por la aplicación de fuente bajo la luz coherencia con un interferómetro de Michelson fibra óptica 2,4. SD-OCT, también conocido como dominio de Fourier OCT (OCT-DF), fue introducido por primera vez en 1995 5, y ofrece una modalidad de imagen superior en comparación con el tradicional dominio de tiempo OCT (OCT-DT). En SD-octubre, el brazo de referencia se mantiene estacionaria que resulta en una velocidad alta y ultra adquisición de imagen de alta resolución 6-9.
Actualmente, los modelos TSCW se han utilizado en gran medida para aplicaciones in vivo de imágenes del cerebro de dos fotones microscopía en lugar de una craneotomía tradicional. Estos TSCW se han utilizado conjuntamente con una placa de cráneo personalizado o un cubreobjetos de vidrio 10-13 para proporcionar adicional imaging estabilidad. En nuestros estudios, hemos observado que los accesorios de este tipo no son necesarios para octubre de imagen cuando se utiliza un TSCW. Por lo tanto, la falta de una placa de cráneo o cubierta de vidrio se desliza permite una gama más amplia de tamaño de imagen de la ventana ya que pueden interferir con el haz óptico y modificar las imágenes octubre
Una preparación adelgazada cráneo ha demostrado ser ventajosa en los estudios de imágenes del cerebro usando microscopía de dos fotones 10-13. En nuestros experimentos, utilizamos un sistema SD-OCT para la imagen de la corteza en vivo a través de un TSCW. Nuestra costumbre SD-OCT configuración de imagen contiene una banda ancha, de baja coherencia fuente de luz que consiste en dos diodos superluminiscente (SLD) con centro en 1295 nm con un ancho de banda de 97 nm que resulta en una resolución axial y lateral de 8 micras y 20 micras, respectivamente 14 . Con nuestro dispositivo de formación de imágenes ópticas, prevemos que las imágenes a través de un TSCW tiene un gran potencial en la identificación y la visualización de las estructuras y funciones en la juntacerebro ptically denso tejido.
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Protocol
1. Preparación quirúrgica
- Ratones hembra CD 1 entre las edades de 6-8 semanas se usaron en nuestros experimentos.
- Se anestesia el ratón con una inyección intraperitoneal de una combinación de ketamina y xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xilazina). Coloque el ratón sobre una almohadilla homeotérmico para garantizar una temperatura corporal óptima a ~ 37 ° C. Supervisar continuamente el nivel de anestesia por probar reflejos animal (por ejemplo, pellizcar pie con fórceps romos) e inyectar más anestesia cuando sea necesario.
- Lubricar ambos ojos con un ungüento de lágrima artificial. Elimine los pelos en el cuero cabelludo con una navaja de afeitar y depilar residual usando 70% almohadillas con alcohol. Aplique una capa delgada de crema de depilación Nair sobre el cuero cabelludo y esperar 2 minutos para que haga efecto. Limpie suavemente el pelo Nair y restantes humedecido con solución salina hisopos de algodón y almohadillas de preparación con alcohol. Scalp ahora debe estar completamente sin pelo.
- Desinfecte cuero cabelludo con un palo betadine hisopo y limpiar con 70% de etanol almohadillas de preparación.
- Envuelva cuidadosamente el animal en paños quirúrgicos para garantizar una temperatura óptima del cuerpo de ~ 37 ° C y montar el animal en un marco estereotáxico para inmovilizar el cráneo. Golpee suavemente el cráneo para asegurar su estabilidad. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1.
2. Diluido-skull Preparación ventana cortical
- Inicie la incisión en el punto de la línea media entre los ojos. Continuar caudalmente hasta el punto de la línea media entre las orejas. Parte de la piel con pinzas.
- Localizar el área a ser diluido con un microscopio de disección y se retire suavemente la fascia usando unas pinzas. Seque el cráneo con hisopos de algodón estériles antes de crear la ventana cortical adelgazada. En nuestros experimentos, hemos creado un 4 × 4 mm adelgazada ventana craneal ~ 1 mm posterior y lateral al bregma.
- Comience el adelgazamiento de la calavera con una fresa redonda de carburo con el tamaño de la broca de 0,75 mm en un taladro quirúrgico utilizando sólo su luz movimiento de barridoy. No aplique presión directa en el cráneo. Deje de perforar cada segundo 20-30 para eliminar el polvo de hueso con solución salina estéril y torundas de algodón y evitar el sobrecalentamiento del cráneo. La solución salina también ayuda a disipar el calor por todo el cráneo.
- Una vez que la capa exterior del hueso compacto se elimina por completo la capa media del hueso esponjoso debe ser visible. Puede haber un poco de sangrado como los vasos sanguíneos son más evidentes en la capa de hueso esponjoso. Cambie a una fresa de piedra verde y continuar perforando con mucho cuidado ya que la capa esponjosa es más delicado. La fresa de piedra verde se retire el material menos hueso al crear uniformidad en toda la ventana craneal. Detener la perforación de vez en cuando para quitar el polvo de hueso y para enfriar el cráneo.
- Finalmente, cuando el cráneo se ha vuelto más transparente y la vasculatura del cerebro es ahora visible, empezar a pulir el cráneo con una fresa de pulido. Esto permitirá una más precisa adelgazamiento mientras alisar el cráneo. Compruebe delgadez de la skull golpeando suavemente sobre ella con fórceps. Deje de pulido cuando el cráneo se vuelve ligeramente flexible.
- La ventana craneal adelgazado ahora debe ser completamente lisa y reflectante y listo para la formación de imágenes (Figura 1). Debido a la naturaleza de los tejidos altamente dispersión del cerebro, el cráneo debe ser diluido a por lo menos 55 micras de profundidad de penetración óptima. Una lista de los materiales utilizados se proporcionan en la Tabla 1.
3. Tomografía de Coherencia Óptica de imagen
- Después de la cirugía se ha completado, compruebe tasa de respiración de los animales y los reflejos para asegurar un nivel adecuado de anestesia y administrar anestesia adicional si es necesario. Eliminar el animal a la estructura estereotáxica, mantener los animales envuelto en paños quirúrgicos, y el transporte de animales a la estación de formación de imágenes.
- Antes de imágenes para verificar si existen signos reflejos y aplicar lágrimas artificiales adicional si es necesario. Montar los animales en el marco estereotáxico para asegurar el cráneo.
- Lugar animal bajoOctubre cámara y la posición de la TSCW bajo el haz óptico (Figura 2). Una vista en sección transversal del cráneo y el cerebro ahora se puede visualizar (Figura 3).
- La adquisición de datos puede comenzar una vez área de interés se encuentra. Para los propósitos de formación de imágenes, se utiliza espejos galvo para conseguir una ventana de imagen con una anchura de 4,0 mm. Una profundidad de imagen de 2 mm se obtuvo con 6 mW de potencia incidente y un punto focal 1 mm por debajo del cráneo adelgazada. Cada área transversal consistió de 2.048 cortes axiales con una velocidad de adquisición de 0,14 seg por imagen.
- Exploraciones volumétricas del cerebro también se puede obtener mediante la recopilación de una serie de 2D imágenes transversales mediante el uso de dos conjuntos de espejos galvo de barrido XY con la primera espejo galvo barrido del haz en la dirección sagital y el segundo espejo de escaneo galvo en el coronal dirección.
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Representative Results
Después de crear una ventana adelgazada sobre la corteza cerebral de la vasculatura ahora debería ser más visualmente prominente (Figura 1) y permitirá una profundidad de imagen más profundo (hasta 1 mm). La corteza derecha se adelgaza a aproximadamente 55 micras, en comparación con un cráneo normal medido a 140 micras (figura 1) y proporciona una mayor claridad óptica. Además adelgazamiento a 10-15 micras es posible 11 no obstante, es necesario que el uso de cubreobjetos de vidrio y placas de cráneo no se implementan en nuestros experimentos (Figura 1 y 2). Este método en particular nos ha permitido identificar las estructuras específicas (corteza cerebral, cuerpo calloso) en nuestros octubre imágenes de cortes transversales (Figura 3). Parasagital imágenes de OCT de un cráneo normal (Figura 3A) frente a un cráneo adelgazado (Figura 3B) se muestran para comparar el resultado de una imagen de OCT con un TSCW éxito. Además, un coronal en sección transversal octubreimagen se obtiene también para facilitar la identificación de las estructuras de la línea media (Figura 3C). La intensidad máxima de la señal de la Figura 3 es 45 dB por encima del ruido de fondo. Una comparación de perfiles de intensidad de un cráneo no diluido y diluido un cráneo revela una intensidad de señal mayor y la profundidad de penetración en un modelo TSCW (Figura 4).
Figura 1. TSCW en un modelo de ratón. A 4 × 4 mm adelgazado ventana cráneo (indicado en la caja cuadrada de puntos) se crea ~ 1 mm posterior y lateral al bregma sobre el hemisferio derecho cerebral utilizando diversas fresas dentales. El derecho de la corteza (diluido a aproximadamente 55 micras) es mucho más transparente que el cráneo no diluido (izquierda corteza, 140 micras) que proporciona una mayor profundidad de penetración de imagen óptica utilizando octubre β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal sutura.
Figura 2. Octubre de formación de imágenes in vivo TSCW. Un modelo de ratón con un adelgazada cráneo se fija en un marco estereotáxico en el objetivo de octubre de imágenes in vivo.
Figura 3. Octubre imágenes de la corteza cerebral in vivo. (A) parasagital imagen de OCT de la corteza en virtud de un cráneo normal. (B) parasagital octubre imagen de la corteza en virtud de un cráneo adelgazada. (C) Coronal octubre imagen de un cráneo adelgazado (izquierda) y un cráneo normal (derecha). Las estructuras del cerebro son más evidentes visualmente bajo un TSCW en comparación con un cráneo normal. Octubre de imágenes se obtuvieron del mismo ratón in vivo con el tamaño de imagen 50.5 mm x 2 mm con una intensidad máxima de señal de 45 dB. β = bregma, CC = cuerpo calloso, SS = sutura sagital, barra de escala = 1 mm.
Figura 4. Comparaciones de intensidad de perfil de preparación cráneo normal y diluido. TSCW permite una mayor intensidad de la señal y la profundidad de penetración. El TSCW logra una profundidad de imagen de aproximadamente 1 mm con suficiente SNR.
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Discussion
Proyección de imagen con OCT y un cráneo adelgazado-es una novela de neuroimagen técnica que sólo se ha investigado recientemente 15, 16. En nuestros experimentos, hemos demostrado la viabilidad de la SD-OCT imágenes a través de un TSCW en un modelo de ratón in vivo. A partir de nuestros resultados, el cráneo se adelgaza a aproximadamente 55 micras y con la profundidad de penetración se obtiene en aproximadamente 1 mm con una resolución de imagen de 8 micras y 20 micras en la dirección axial y lateral, respectivamente. En el perfil de intensidad de la señal, octubre de imágenes a través de un TSCW aumenta la intensidad de la señal y la profundidad de penetración en comparación con un cráneo normal (Figura 4). En comparación, los dos fotones de imágenes con una TSCW en grosor del cráneo de ~ 10-15 micras pueden alcanzar profundidades de formación de imágenes de 150-250 micras debajo de la superficie pial 10, 11, 13 con la resolución axial en 3 ~ 10 micras, mientras que un cráneo adelgazada de ~ 20 m profundidad de imagen puede alcanzar hasta 300-400 micras dentro de la corteza cerebral de 12. Overall, formación de imágenes ópticas con octubre demuestra ser una modalidad de imagen prometedor, lo que permite una TSCW más grueso durante el proceso de adelgazamiento al tiempo que proporciona una penetración más profunda profundidad que la microscopía mutiphoton.
Utilizando un adelgazada cráneo es ventajoso en imágenes ópticas como OCT 15, 16 y de dos fotones microscopía 10-13, ya que proporciona poco o ningún neuroinflamación en comparación con una craneotomía si se lleva a cabo con éxito adelgazamiento 11, 12, 15, 16,. El empleo de una craneotomía para formación de imágenes puede resultar en microglia reactiva, así como la regulación positiva de la proteína glial fibrilar ácida (GFAP) en astrocitos reactivos después de agresiones al cerebro. Sin embargo, las imágenes después de la adopción de una técnica adelgazado-cráneo revela no activa la microglia y la inmunotinción GFAP débil implica no reactivos astrocitos 10. A través de apropiados adelgazamiento del cráneo, las estructuras específicas dentro de la corteza cerebral, como la morfología microglia y la vasculatura cortical, cuna distinguirse 11-13. Sin embargo, hay inconvenientes de la utilización de un TSCW para formación de imágenes ópticas. Si el cráneo no está adelgazada al espesor correcto o el cráneo tiene superficies rugosas debido a la inadecuada profundidad de penetración adelgazamiento para formación de imágenes puede ser limitada. Otro aspecto negativo para la profundidad de imagen deficiente puede resultar de hemorragia subdural debido a las vibraciones de la perforación. Sangrado debajo de la duramadre es inevitable, y por lo tanto no se puede utilizar para imágenes de OCT. En casos como estos, un nuevo modelo animal debe ser utilizado para el experimento.
La identificación de ciertas estructuras dentro de la corteza utilizando octubre a través de un TSCW puede ser útil en el seguimiento de enfermedades neurodegenerativas y en el estudio de los cambios en la función cerebral. Imágenes de flujo de sangre se puede lograr a través de Doppler 17 de octubre 18 como para la cuantificación del flujo sanguíneo cerebral es de suma importancia en el seguimiento de las demandas metabólicas del cerebro en el estudio de accidente cerebrovascular, enfermedad de Alzheimer 18, 17 o los tumores cerebrales. Axonaly la degeneración neuronal es también prominente en imágenes de OCT y puede beneficiar a los estudios de los trastornos cerebrales diferentes. Mediante formación de imágenes de la capa de fibras nerviosas de la retina (CFNR), que contiene los axones de células ganglionares, mecanismos de, neuro-degeneración neuro-protección, y neuro reparación-puede ser visualizado no sólo en los trastornos ópticos sino también en enfermedades neurológicas como el Parkinson 19 y múltiples esclerosis 20, 21, el último que se ha explorado en detalle mediante la medición del espesor de la capa 21 mácula y la retina a través de técnicas de segmentación 20 de octubre.
Neuro-formación de imágenes con OCT no se restringe solamente a las estructuras de formación de imágenes y funciones del cerebro. Octubre puede ser ventajoso en crónica en vivo de imágenes 10, 11, así como en procedimientos estereotácticos tales como los estudios electrofisiológicos y microinyección 1, 3, 15-17. En neurocirugía, octubre puede ser utilizado como una biopsia o una herramienta de guía 2, al permitir a los cirujanos verimágenes en tiempo real de retroalimentación de los rasgos anatómicos específicos en el cerebro 17. Con los nuevos acontecimientos, creemos que nuestra combinación actual de SD-OCT con un TSCW tiene el potencial de mejorar la capacidad de un clínico a los déficits diagnóstico neurológico cuando se aplica con otras modalidades como la presión intracraneal (PIC) monitor 22, la resonancia magnética ( RM) o tomografía axial computarizada (TAC) 1.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la prueba de UC Discovery subvención Concepto y por el NIH (R00 EB007241). Los autores también desean agradecer a Jacqueline Hubbard por su ayuda en este experimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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