Summary
Vi præsenterer en fremgangsmåde til at skabe en tyndere-skull cortical vindue (TSCW) i en musemodel for
Abstract
Optisk kohærens tomografi (OCT) er en biomedicinsk billeddannelse teknik med høj rumlig-tidslig opløsning. Med sin minimalt invasiv tilgang oktober har været anvendt i udstrakt grad i oftalmologi, dermatologi, og gastroenterologi 1-3. Ved hjælp af en tyndere-skull kortikal vindue (TSCW) beskæftiger vi spektral-domæne OCT (SD-OLT) modalitet som et redskab til billede cortex in vivo. Almindeligvis har en åben-skull blevet anvendt til neuro-billeddannelse, da det giver større alsidighed dog en TSCW metode er mindre invasiv og et effektivt middel til langsigtet billeddannelse i neuropatologi undersøgelser. Her præsenteres en fremgangsmåde til at skabe en TSCW i en musemodel for in vivo oktober billeddannelse af hjernebarken.
Introduction
Siden introduktionen i begyndelsen af 1990 er, er oktober vid udstrækning blevet anvendt til biologisk billeddannelse af væv struktur og funktion 2. Oktober genererer tværsnitsbilleder ved måling ekkotid forsinkelse af tilbagespredt lys 4 ved at gennemføre lave kohærens lyskilde med en fiberoptisk Michelson interferometer 2,4. SD-OLT, også kendt som Fourier-domæne OCT (FD-OLT), blev først introduceret i 1995 5 og tilbyder en overlegen afbildningsmodalitet sammenlignet med traditionel tid domæne OCT (TD-OLT). I SD-oktober, er referencearmen holdes stationær resulterer i en høj hastighed og ultrahøj opløsning billedoptagelse 6-9.
I øjeblikket har TSCW modeller blevet anvendt i vid udstrækning til in vivo hjernescanning anvendelser af to-foton mikroskopi i stedet for en traditionel kraniotomi. Disse TSCW har været anvendt samtidig med en brugerdefineret dødningehoved plade eller et dækglas 10-13 at tilvejebringe yderligere imaging stabilitet. I vores undersøgelser har vi observeret, at tilbehør såsom disse ikke er nødvendige til OLT billeddannelse når en TSCW anvendes. Derfor er manglen på et kranium plade eller dækglas muliggør et bredere spektrum af billeddannende vinduesstørrelse, da de kan påvirke den optiske stråle og ændre oktober billeder.
En tyndet-skull præparat har vist sig at være fordelagtig ved billeddannelse undersøgelser af hjernen ved hjælp af to-foton mikroskopi 10-13. I vores eksperimenter, benytter vi et SD-OLT-system til at afbilde cortex in vivo gennem en TSCW. Vores brugerdefinerede SD-oktober imaging setup indeholder en bredbåndsforbindelse, lav sammenhæng lyskilde bestående af to superluminescerende dioder (SLD) centreret ved 1295 nm med en båndbredde på 97 nm resulterer i en aksial og lateral opløsning på 8 um og 20 um, henholdsvis 14 . Med vores optisk billeddannelse enhed, forestiller vi, at billeddannelse gennem en TSCW har et stort potentiale i at identificere og visualisere strukturer og funktioner i optically tæt hjernevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kirurgisk forberedelse
- Female CD 1 mus i alderen 6-8 uger blev anvendt i vore forsøg.
- Bedøve mus med en intraperitoneal injektion af en ketamin og xylazin blanding (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xylazin). Anbring musen på en homeothermic pad til at sikre en optimal kropstemperatur ved ~ 37 ° C. Løbende overvåge niveau af anæstesi ved at teste dyrets reflekser (f.eks knibe fod med stumpe pincet) og injicere mere anæstesi når det er nødvendigt.
- Smør begge øjne med en kunstig tåre salve. Fjern hår på hovedbunden ved hjælp af en barbermaskine og fjerne resterende hår ved hjælp af 70% alkohol prep puder. Påfør et tyndt lag af Nair hårfjerning fløde over hovedbunden og vent 2 min for den at træde i kraft. Tør forsigtigt væk Nair og resterende hår ved hjælp af saltvand fugtet vatpinde og alkohol prep puder. Scalp skulle nu være helt hårløs.
- Desinficer hovedbund ved hjælp af en Betadine vatpind og rens med 70% ethanol prep puder.
- Omhyggeligt wrap dyret i operationsdraperinger at sikre optimal kropstemperatur på ~ 37 ° C og montere dyret på en stereotaktisk ramme til immobilisering af kraniet. Let tryk kraniet for at sikre dets stabilitet. En liste over anvendte materialer er angivet i tabel 1..
2. Tyndet-skull Cortical Window Forberedelse
- Start indsnit ved midterlinjen punkt mellem øjnene. Fortsæt kaudalt med midterlinjen punkt mellem ørerne. Del af huden med en pincet.
- Find det område, der skal fortyndes under et dissektionsmikroskop og fjern forsigtigt fascia med en pincet. Tør kraniet med sterile vatpinde, før du opretter den fortyndede kortikal vindue. I vores eksperimenter har vi oprettet en 4 × 4 mm tyndere kraniel vindue ~ 1 mm posterior og lateralt for bregma.
- Begynd udtynding kraniet ved en rund karbidbor med boret størrelse 0,75 mm i en kirurgisk håndboremaskine ved hjælp af lys fejende bevægelse only. Må ikke anvende direkte pres på kraniet. Stop boring hver 20-30 sek for at fjerne knogle støv med sterilt saltvand og vatpinde og for at undgå overophedning af kraniet. Saltvandet vil også hjælpe med at sprede varme i hele kraniet.
- Når det ydre lag af den kompakte knogle fuldstændigt fjernet det midterste svampet knogle lag bør nu kunne ses. Der kan være nogle mindre blødning som blodkar er mere tydelig i den svampede knogle lag. Skift til en grøn sten bur og fortsætte boring ved hjælp af ekstra forsigtighed, da svampet lag er mere sart. Den grønne sten bur vil fjerne mindre knoglemateriale under oprettelse jævnhed hele kraniale vinduet. Stop boring lejlighedsvis for at fjerne knogle støv og for at afkøle kraniet.
- Endelig, når kraniet er blevet mere gennemsigtigt og vaskulaturen på hjernen er nu synlig, begynder polere kraniet ved en polering bur. Dette vil give en mere præcis udtynding mens udglatning ned kraniet. Tjek tynd af skull ved forsigtigt at banke på den med en pincet. Stop polering, når skallen bliver en smule fleksibelt.
- Den fortyndede kraniale vindue bør nu være fuldstændig glat og reflekterende og klar til billeddannelse (fig. 1). På grund af karakteren af stærkt spreder væv i hjernen, er skallen fortyndes til mindst 55 um for optimal dybdepenetration. En liste over anvendte materialer er angivet i tabel 1..
3. Optisk Kohærens Tomografi Imaging
- Efter operationen er færdig, skal du kontrollere dyrets vejrtrækning og reflekser for at sikre korrekt niveau af anæstesi og administrere yderligere anæstesi hvis det er nødvendigt. Tag dyr fra den stereotaktisk ramme, holde dyr indpakket i operationsdraperinger og transport dyr til billeddannelse station.
- Før billeddannelse tjek tegn for reflekser og anvende ekstra kunstig tåre hvis det er nødvendigt. Montere dyr videre til stereotaktisk ramme for at fastgøre skallen.
- Sted dyr underOktober kamera og placere TSCW under den optiske stråle (fig. 2). Et tværsnitsbillede af kraniet og hjernen kan nu visualiseres (figur 3).
- Dataindsamling kan begynde, når interesseområde er beliggende. For billeddannelsesformål bruger vi galvo spejle for at opnå en billeddannende vindue med en bredde på 4,0 mm. En billeddannende dybde på 2 mm blev opnået med 6 mW af indfaldende effekt og et brændpunkt 1 mm under den fortyndede kraniet. Hver tværsnitsareal bestod på 2.048 aksiale scanninger med en erhvervelse på 0,14 sekunder per billede.
- Volumetriske scanninger af hjernen kan også opnås ved at opsamle en serie af 2D tværsnitsbilleder ved anvendelse af to sæt galvo spejle til xy scanning med den første galvo spejl skanne strålen i det sagittale retning og den anden galvo spejl scanning i den koronale retning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter oprettelse af en fortyndet vindue over hjernebarken vaskulaturen bør nu være mere visuelt fremtrædende (fig. 1), og vil give mulighed for en dybere imaging dybde (op til 1 mm). Højre cortex fortyndes til cirka 55 um sammenlignet med en normal kranium målt ved 140 um (figur 1) og giver en større optisk klarhed. Yderligere udtynding til 10-15 um er mulig 11 dog ikke nødvendigt, da brug af dækglas og kranium plader er ikke implementeret i vores eksperimenter (Figur 1 og 2). Denne særlige metode har gjort det muligt at identificere specifikke strukturer (cerebral cortex, corpus callosum) i vore oktober tværsnitsbilleder (figur 3). Parasagittal oktober billeder af en normal skull (figur 3A) versus en fortyndet skull (figur 3B) er vist for at sammenligne resultatet af et OLT billede med en vellykket TSCW. Derudover en koronale snit oktoberbilledet opnås også lette at identificere midterlinjen strukturer (fig. 3C). Den maksimale signalintensitet til figur 3 er 45 dB over den støjbunden. En intensitet profil sammenligning af en ikke-fortyndet kranium og en fortyndet kranium afslører en større signalintensitet og dybdepenetration i en TSCW model (figur 4).
Figur 1. TSCW i en musemodel. Et 4 x 4 mm fortyndet skull vinduet (angivet i den stiplede firkant) dannes ~ 1 mm posterior og lateralt for bregma over den højre hjernehalvdel med forskellige dentale bor. Den højre cortex (fortyndet til cirka 55 um) er betydeligt mere gennemskueligt end de ikke-tyndet kranium (venstre cortex, 140 um) giver større dybde penetration for optisk billeddannelse med OCT. β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal sutur.
Figur 2. Oktober billeddannelse af TSCW in vivo. En mus model med en udtyndede kranium er fastgjort i en stereotaktisk ramme under målet for oktober billeddannelse in vivo.
Figur 3. Oktober billeder af den cerebrale cortex in vivo. (A) parasagittal oktober billede af cortex under en normal kranium. (B) parasagittal oktober billede af cortex under en fortyndet kranium. (C) koronale oktober billede af en fortyndet skull (venstre) og en normal skull (højre). Strukturerne af hjernen er mere visuelt synlige under et TSCW sammenlignet med en normal kranium. Oktober billeder fra blev opnået fra den samme mus in vivo med billeddannelse størrelse 5.0,5 mm x 2 mm med maksimal signal intensitet på 45 dB. β = bregma, CC = corpus callosum, SS = sagittal sutur, skala bar = 1 mm.
Figur 4. Intensitet profil sammenligninger af normal og tyndet kranium prep. TSCW tillader øget signal intensitet og dybde penetration. The TSCW opnår et billeddannende dybde på omkring 1 mm med tilstrækkelig SNR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging med OLT og en udtyndede kranium er en ny neuro-imaging teknik, der først lige er blevet undersøgt 15, 16. I vores eksperimenter viste vi muligheden for SD-oktober billeddannelse gennem en TSCW i en musemodel in vivo. Fra vores resultater, er kraniet fortyndes til cirka 55 um, og indtrængningsdybden opnås ved omtrent 1 mm med billedopløsning på 8 um og 20 um i aksial og lateral retning, hhv. I signalintensitet profil, øger oktober billeddannelse gennem en TSCW signalintensiteten og dybde penetration sammenlignet med en normal skull (fig. 4). Til sammenligning kan to-foton billeddannelse med TSCW på kraniet tykkelse på ~ 10-15 um nå billeddannelse dybder på 150 til 250 um under pial overflade 10, 11, 13 med aksial opløsning på ~ 3 um 10, medens et fortyndet kranium på ~ 20 um imaging dybde kan nå op til 300-400 um i hjernebarken 12. Overall, optisk billeddannelse med OCT viser sig at være en lovende afbildningsmodalitet, tillader en tykkere TSCW under udtynding processen samtidig give dybere dybde penetration end mutiphoton mikroskopi.
Anvendelse af en tyndere-skull er fordelagtig ved optisk afbildning såsom oktober 15, 16 og to-foton mikroskopi 10-13 da det giver ringe eller ingen neuroinflammation sammenlignet med en kraniotomi, hvis fortynding udføres med held 11, 12, 15, 16,. Anvendelse af en kraniotomi til billeddannelse kan resultere i reaktive microglia og opregulering af glialt fibrillært surt protein (GFAP) i reaktive astrocytter efter fornærmelser til hjernen. Men billeddannelse efter vedtagelsen af en udtyndet-skull teknik afslører ikke-aktive microglia og svag GFAP immunfarvning indebærer ikke-reaktive astrocytter 10. Ved passende fortynding af kraniet, specifikke strukturer i den cerebrale cortex, såsom microglia morfologi og kortikal vaskulatur, cet skelnes 11-13. Der er imidlertid ulemper ved anvendelse af en TSCW til optisk afbildning. Hvis kraniet ikke fortyndes til den korrekte tykkelse eller kraniet har ru overflader på grund af ukorrekt udtynding dybdepenetration til afbildning kan være begrænset. En anden ulempe for dårlig imaging dybde kan skyldes sub-dural blødning på grund af vibrationer af boring. Blødning under dura er uundgåelig og kan derfor ikke anvendes til oktober billeddannelse. I tilfælde som disse, bør en ny dyremodel anvendes til forsøget.
Identifikation af visse strukturer i cortex med OCT gennem en TSCW kan være nyttigt i at spore neurodegenerative sygdomme og i at studere ændringer i hjernens funktion. Imaging blodgennemstrømning kan opnås gennem Doppler 17 okt 18 som kvantificere cerebral blodgennemstrømning er altafgørende i overvågningen af de metaboliske krav i hjernen i at studere slagtilfælde, Alzheimers sygdom 18, eller hjernetumorer 17. Axonalog neuronal degeneration er også fremtrædende i okt billeder og kan gavne undersøgelser af forskellige hjernesygdomme. Ved billeddannelse af retinal nerve fiberlag (RNFL), som indeholder gangliecelle axoner, mekanismer neurodegeneration, neuro-beskyttelse og neuro-reparation kan visualiseres ikke blot i optiske forstyrrelser, men også i neurologiske sygdomme såsom Parkinsons 19 og multiple sclerose 20, 21, sidstnævnte som er blevet undersøgt i detaljer ved at måle den gule plet 21 og retinal lagtykkelse gennem oktober segmentering teknikker 20.
Neuro-imaging med OLT ikke kun begrænset til billeddannelse strukturer og funktioner i hjernen. Oktober kan være fordelagtig ved kronisk in vivo-billeddannelse 10, 11 samt i stereotaktiske fremgangsmåder, såsom elektrofysiologiske og mikroinjektion undersøgelser 1, 3, 15-17. I neurokirurgi, kan oktober anvendes som en biopsi eller styrende værktøj 2 ved at tillade kirurgen at sereal-time feedback billeder af specifikke anatomiske funktioner i hjernen 17. Med yderligere udvikling, tror vi vores nuværende kombination af SD-OLT med en TSCW har potentiale til at forbedre en klinikerens evne til diagnose neurologiske underskud, når det anvendes sammen med andre modaliteter, såsom en intrakranielle tryk (ICP) monitor 22, magnetisk resonans ( MRI), eller edb-aksial tomografi (CAT) 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af UC Discovery Proof of Concept tilskud og af NIH (R00 EB007241). Forfatterne vil også gerne takke Jacqueline Hubbard for hendes hjælp i dette eksperiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
- Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
- Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
- Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
- Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G.
- Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
- de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
- de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
- Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
- Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742 (2012).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
- Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
- Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
- Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
- Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
- Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
- Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
- Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
- Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
- Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).
