Summary
Nous présentons une méthode de création d'une fenêtre corticale amincie crâne (TSCW) dans un modèle de souris pour
Abstract
Tomographie par cohérence optique (OCT) est une technique d'imagerie biomédicale de haute résolution spatio-temporelle. Grâce à son approche minimalement invasive OCT a été largement utilisé en ophtalmologie, dermatologie, gastro-entérologie et 1-3. En utilisant une fenêtre corticale amincie crâne (TSCW), nous employons domaine spectral OCT (SD-OCT) modalité comme un outil pour l'image du cortex in vivo. Communément, un crâne ouvert, a été utilisé pour la neuro-imagerie car il offre une plus grande polyvalence, cependant, une approche TSCW est moins invasive et est un moyen efficace pour l'imagerie à long terme dans les études de neuropathologie. Ici, nous présentons une méthode de création d'un TSCW dans un modèle de souris in vivo pour imagerie OCT du cortex cérébral.
Introduction
Depuis son introduction dans le début des années 1990, l'OCT a été largement utilisé pour l'imagerie biologique de la structure des tissus et la fonction 2. Octobre génère des images en coupe en mesurant le temps de retard d'écho de 4 lumière rétrodiffusée par la mise en oeuvre à faible cohérence source de lumière avec un interféromètre de Michelson à fibres optiques 2,4. SD-OCT, également connu sous le nom de domaine de Fourier PTOM (FD-OCT), a été introduit en 1995 5 et offre une modalité d'imagerie de qualité supérieure par rapport aux traditionnels dans le domaine temporel OCT (TD-OCT). Dans l'affaire SD-OCT, le bras de référence est maintenue stationnaire résultant en une vitesse élevée et ultra acquisition d'image à haute résolution 6-9.
À l'heure actuelle, les modèles TSCW ont été largement utilisés pour des applications in vivo d'imagerie cérébrale de microscopie à deux photons au lieu d'une craniotomie traditionnelle. Ces TSCW ont été utilisés simultanément avec une plaque de crâne personnalisée ou une lamelle de verre 10-13 à fournir d'autres imaGing stabilité. Dans nos études, nous avons constaté que des accessoires tels que ceux-ci ne sont pas nécessaires pour imagerie OCT quand un TSCW est utilisé. Par conséquent, l'absence d'une plaque de crâne ou des lamelles de verre permet une plus large gamme de taille de la fenêtre d'imagerie, car ils peuvent interférer avec le faisceau optique et modifier des images octobre
Une préparation amincie crâne s'est avérée avantageuse dans les études d'imagerie du cerveau en utilisant la microscopie à deux photons 10-13. Dans nos expériences, nous utilisons un système SD-OCT à l'image du cortex in vivo par un TSCW. La coutume SD-OCT installation d'imagerie contient une large bande, la source de lumière à faible cohérence constitué par deux diodes superluminescentes (SLD) centrés à 1295 nm avec une largeur de bande de 97 nm résultant en une résolution axiale et latérale de 8 um et 20 um, respectivement 14 . Avec notre appareil d'imagerie optique, nous prévoyons que l'imagerie à travers un TSCW a un grand potentiel dans l'identification et la visualisation des structures et des fonctions dans l'otissu cérébral ptically dense.
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Protocol
1. Préparation chirurgicale
- CD 1 souris femelles âgées de 6-8 semaines ont été utilisés dans nos expériences.
- Anesthésier la souris avec une injection intrapéritonéale d'une combinaison de kétamine et de xylazine (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xylazine). Placez la souris sur un tapis homéothermes afin d'assurer une température corporelle optimale à ~ 37 ° C Surveiller en permanence le niveau de l'anesthésie en testant les réflexes animal (par exemple, pincer pied avec le forceps émoussé) et injecter plus de l'anesthésie si nécessaire.
- Lubrifiez les deux yeux avec une pommade larmes artificielles. Enlever les poils sur le cuir chevelu à l'aide d'un rasoir et enlever les poils résiduel en utilisant 70% de tampons imbibés d'alcool. Appliquer une fine couche de crème Nair épilation sur le cuir chevelu et attendre 2 minutes pour qu'elle prenne effet. Essuyer doucement les cheveux Nair et restant en utilisant une solution saline imbibé des cotons-tiges et tampons de préparation d'alcool. Scalp devrait maintenant être complètement chauve.
- Désinfecter le cuir chevelu à l'aide d'un bâton bétadine tige et nettoyer avec 70% tampons imbibés d'éthanol.
- Soigneusement envelopper l'animal dans les draps chirurgicaux pour assurer la température du corps optimale de ~ 37 ° C et monter l'animal sur un cadre stéréotaxique pour immobiliser le crâne. Appuyez légèrement sur le crâne pour assurer sa stabilité. Une liste des matériaux utilisés est fournie dans le tableau 1.
2. Diluée-crâne Préparation fenêtre corticale
- Démarrez l'incision au point médian entre les deux yeux. Continuer caudalement au point médian entre les oreilles. Partie de la peau avec une pince.
- Localisez la zone à éclaircir sous un microscope à dissection et retirez délicatement la façade à l'aide de pinces. Sécher le crâne avec des cotons-tiges stériles avant de créer la fenêtre amincie corticale. Dans nos expériences, nous avons créé un 4 × 4 mm aminci fenêtre crânienne ~ 1 mm postérieure et latérale au bregma.
- Commencez amincissement du crâne à l'aide d'une fraise en carbure de tour de taille foret de 0,75 mm dans une perceuse à main chirurgicale en utilisant la lumière ONL mouvement de balayagey. Ne pas appliquer une pression directe sur le crâne. Arrêtez le forage toutes les 20-30 secondes pour enlever la poussière d'os en utilisant une solution saline stérile et tampons de coton et d'éviter la surchauffe du crâne. La solution saline peut aussi aider à dissiper la chaleur à travers le crâne.
- Une fois que la couche externe de l'os compact est complètement enlevé la couche d'os spongieux milieu devrait maintenant être visible. Il peut y avoir un léger saignement que les vaisseaux sanguins sont plus apparents dans la couche d'os spongieux. Passez à une fraise pierre verte et continuer le forage en utilisant des précautions supplémentaires que la couche spongieuse est plus délicate. La fraise pierre verte sera enlever de la matière osseuse moindre tout en créant régularité tout au long de la fenêtre crânienne. Arrêtez le forage de temps en temps pour enlever la poussière d'os et de refroidir le crâne.
- Enfin, lorsque le crâne est devenu plus transparent et le système vasculaire dans le cerveau est maintenant visible, commencez à polir le crâne à l'aide d'une fraise de polissage. Cela permettra une évaluation plus précise amincissement tout en lissant le crâne. Vérifiez la minceur de l'skull en tapotant doucement sur elle avec une pince. Arrêtez polissage lorsque le crâne est légèrement flexible.
- La fenêtre amincie crânienne devrait maintenant être parfaitement lisse et réfléchissante et prêt pour l'imagerie (figure 1). En raison de la nature des tissus fortement diffusantes du cerveau, du crâne doit être dilué à au moins 55 um pour la profondeur de pénétration optimale. Une liste des matériaux utilisés est fournie dans le tableau 1.
3. Tomographie par cohérence optique d'imagerie
- Après la chirurgie est terminée, vérifier le taux de respiration des animaux et les réflexes pour assurer un niveau adéquat d'anesthésie et d'administrer une anesthésie supplémentaire si nécessaire. Supprimer animal du cadre stéréotaxique, garder des animaux enveloppé dans les draps chirurgicaux, et le transport des animaux à la station d'imagerie.
- Avant d'imagerie vérifier les signes de réflexes et d'appliquer des larmes artificielles supplémentaires si nécessaire. Monter sur des animaux pour la cadre stéréotaxique pour fixer le crâne.
- Placer sous animauxOctobre caméra et la position de l'TSCW sous le faisceau optique (figure 2). Une vue en coupe transversale du crâne et le cerveau peuvent maintenant être visualisées (figure 3).
- L'acquisition des données peut commencer une fois domaine d'intérêt est située. À des fins d'imagerie, on utilise des miroirs galvanométrique pour réaliser une fenêtre de formation d'image avec une largeur de 4,0 mm. Une profondeur d'imagerie de 2 mm a été obtenue avec 6 mW de puissance incidente et un point focal 1 mm au-dessous du crâne amincie. Chaque surface de section transversale se composait de 2.048 balayages axiaux avec un taux d'acquisition de 0,14 secondes par image.
- Balayages volumétriques du cerveau peut également être obtenue en recueillant une série de 2D des images en coupe à l'aide de deux jeux de miroirs de balayage galvanométrique pour xy par le miroir galvanométrique premier balayage du faisceau dans la direction sagittale et le deuxième miroir de galvanomètre de balayage dans la coronaire direction.
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Representative Results
Après avoir créé une fenêtre amincie sur le cortex cérébral du système vasculaire devrait maintenant être visuellement plus importante (Figure 1) et permettra une profondeur plus grande image (jusqu'à 1 mm). Le cortex droit est amincie à environ 55 um par rapport à un crâne normal mesuré à 140 um (figure 1) et fournit une plus grande clarté optique. Dilution supplémentaire à 10-15 um est possible 11 cependant pas nécessaire que l'utilisation de lamelles de verre et des plaques du crâne ne sont pas mis en œuvre dans nos expériences (figure 1 et 2). Cette méthode particulière a permis d'identifier des structures spécifiques (cortex cérébral, le corps calleux) dans nos octobre images en coupe transversale (figure 3). Parasagittales images OCT d'un crâne normal (figure 3A) par rapport à un crâne amincie (figure 3B) sont indiqués pour comparer les résultats d'une image OCT avec un TSCW succès. En outre, une section coronale octobrel'image est également obtenue pour faciliter l'identification des structures médianes (figure 3C). L'intensité maximale du signal de la figure 3 est de 45 dB au-dessus du bruit de fond. Un comparateur de profil d'intensité d'un crâne non amincie et un crâne amincie révèle un signal de plus grande intensité et la profondeur de pénétration dans un modèle TSCW (figure 4).
Figure 1. TSCW dans un modèle murin. Un 4 × 4 mm crâne fenêtre amincie (désigné dans le cadre en pointillés carré) est créé ~ 1 mm postérieure et latérale au bregma sur l'hémisphère cérébral droit à l'aide de diverses fraises dentaires. Le cortex droit (dilué à environ 55 um) est nettement plus transparent que le crâne non amincie (à gauche du cortex, 140 pm) fournissant une pénétration plus en profondeur pour l'imagerie optique en utilisant octobre β = bregma, λ = lambda, SS = Sagittal suture.
Figure 2. Octobre imagerie in vivo de TSCW. Un modèle de souris avec un crâne amincie est fixé dans un cadre stéréotaxique sous l'objectif d'octobre imagerie in vivo.
Figure 3. Images OCT de l'écorce cérébrale in vivo. (A) parasagittale image OCT du cortex sous un crâne normal. (B) parasagittale image OCT du cortex sous un crâne amincie. (C) Coronal image OCT d'un crâne amincie (à gauche) et un crâne normal (à droite). Les structures du cerveau sont visuellement plus apparente sous une TSCW par rapport à une normale crâne. Images OCT ont été obtenus à partir de la même souris in vivo avec la taille imagerie 50,5 mm x 2 mm avec une intensité maximale du signal de 45 dB. β = bregma, CC = corps calleux, SS = sagittal suture, barre d'échelle = 1 mm.
Figure 4. Comparaisons de profils d'intensité de préparation crâne normal et aminci. TSCW permet intensité du signal accrue et la profondeur de pénétration. La TSCW atteint une profondeur d'imagerie d'environ 1 mm avec suffisamment de SNR.
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Discussion
Imagerie par OCT et amincie crâne est un roman de neuro-imagerie technique qui n'a été que récemment enquêté sur 15, 16. Dans nos expériences, nous avons démontré la faisabilité de SD-OCT par un TSCW dans un modèle de souris in vivo. À partir de ces résultats, le crâne est amincie à environ 55 um et la profondeur de pénétration est obtenue à environ 1 mm avec une résolution d'image de 8 um et 20 um dans la direction axiale et latérale, respectivement. Dans le profil d'intensité de signal, à travers une imagerie OCT TSCW augmente l'intensité du signal et la profondeur de pénétration par rapport à un crâne normal (figure 4). En comparaison, les deux photons d'imagerie avec une épaisseur de TSCW crâne de ~ 10-15 um peut atteindre des profondeurs d'imagerie de 150-250 um dessous de la surface piale 10, 11, 13 à la résolution axiale à 3 ~ 10 um tandis qu'un crâne amincie de ~ une profondeur de 20 um d'imagerie peut atteindre jusqu'à 300-400 um dans le cortex cérébral 12. Overall, l'imagerie optique par OCT s'avère être une modalité d'imagerie prometteuse, permettant à un plus épais TSCW pendant le processus d'amincissement tout en assurant une pénétration plus profonde profondeur que la microscopie mutiphoton.
L'utilisation d'un amincie crâne est avantageuse appréciée en imagerie optique tels que le 15 octobre 16 et microscopie à deux photons 10-13 car il offre peu ou pas de neuroinflammation par rapport à une craniotomie si amincissement est effectué avec succès 11, 12, 15, 16,. Employant une craniotomie pour l'imagerie peut entraîner la microglie réactive ainsi que la régulation positive de la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP) dans les astrocytes réactifs après des insultes au cerveau. Cependant, l'imagerie après l'adoption d'une technique amincie crâne révèle non active la microglie et immunomarquage GFAP faible ce qui implique non réactifs astrocytes 10. Grâce appropriées amincissement du crâne, des structures spécifiques au sein du cortex cérébral, comme la morphologie et de la vascularisation corticale microglie, cun être distingués 11-13. Néanmoins, il ya des inconvénients de l'utilisation d'un TSCW pour l'imagerie optique. Si le crâne n'est pas éclairci à la bonne épaisseur ou le crâne présente des surfaces rugueuses en raison de la profondeur de pénétration inadéquate amincissement pour l'imagerie peut être limitée. Un autre inconvénient de la profondeur d'imagerie pauvre peut résulter d'une hémorragie sous-durale à cause des vibrations de forage. Saignements sous la dure-mère est inévitable et ne peut donc pas être utilisé pour imagerie OCT. Dans de tels cas, un nouveau modèle animal devrait être utilisé pour l'expérience.
Identifier certaines structures au sein du cortex à l'aide d'octave à une TSCW peut être utile dans le suivi des maladies neurodégénératives et dans l'étude des changements dans le fonctionnement du cerveau. Imagerie du flux sanguin peut être réalisé par Doppler 17 octobre 18 que la quantification du débit sanguin cérébral est primordial dans le suivi des besoins métaboliques du cerveau pour étudier accident vasculaire cérébral, la maladie d'Alzheimer 18, ou les tumeurs cérébrales 17. Axonaleet la dégénérescence neuronale est également important dans images OCT et peuvent bénéficier des études de divers troubles cérébraux. Par imagerie de la couche de fibres nerveuses rétiniennes (CFNR), qui contient les axones des cellules ganglionnaires, les mécanismes de neuro-dégénérescence, neuro-protection et neuro-réparation peuvent être visualisés non seulement dans les troubles optiques, mais aussi dans les maladies neurologiques telles que la maladie de Parkinson 19 et multiple la sclérose en plaques 20, 21, ce dernier qui a été étudiée en détail par la mesure de l'épaisseur de la couche macula rétinienne à travers les 21 et 20 octobre techniques de segmentation.
La neuro-imagerie par OCT n'est pas seulement limitée à des structures et des fonctions d'imagerie du cerveau. OCT peut être avantageux dans l'imagerie in vivo chronique 10, 11 ainsi que dans les procédures stéréotaxiques telles que des études électrophysiologiques et la microinjection 1, 3, 15-17. En neurochirurgie, l'OCT peut être utilisé comme une biopsie ou un outil de guidage 2 en permettant aux chirurgiens de visualiserimages de rétroaction en temps réel des caractéristiques anatomiques spécifiques dans le cerveau 17. Avec des développements ultérieurs, nous croyons que notre combinaison actuelle de SD-OCT avec un TSCW a le potentiel d'améliorer la capacité du clinicien à des déficits de diagnostic neurologique lorsqu'elle est appliquée à d'autres modalités telles que la pression intracrânienne (PIC) moniteur 22, l'imagerie par résonance magnétique ( IRM), la tomographie axiale informatisée ou (CAT) 1.
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Disclosures
Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la preuve UC Découverte de la subvention Concept et par le NIH (R00 EB007241). Les auteurs tiennent également à remercier Jacqueline Hubbard pour son aide dans cette expérience.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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