Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Tynnet-skull Cortical Window Teknikk for Published: November 19, 2012 doi: 10.3791/50053
Automatic Translation
1, 2, 2, 1, 2, 2, 2, 2, 1
1Division of Biomedical Sciences, University of California, Riverside, 2Department of Bioengineering, University of California, Riverside

Summary

Vi presenterer en metode for å skape en tynnet-skull kortikal vindu (TSCW) i en mus modell for

Abstract

Optisk koherens tomografi (OCT) er en biomedisinsk bildebehandling teknikk med høy romlig-temporal oppløsning. Med sin minimalt invasiv tilnærming oktober har blitt brukt mye i oftalmologi, dermatologi, og gastroenterologi 1-3. Ved hjelp av en tynnet-skull kortikal vindu (TSCW), ansetter vi spektral-domene OCT (SD-OCT) modalitet som et verktøy for å avbilde cortex in vivo. Vanligvis har et åpnet-skull blitt brukt for nevro-avbildning som det gir mer allsidighet, er imidlertid en TSCW tilnærming mindre invasiv og er en effektiv gjennomsnittlig for langsiktig avbildning i neuropathology studier. Her presenterer vi en metode for å skape en TSCW i en mus modell for in vivo oktober avbildning av hjernebarken.

Introduction

Siden introduksjonen i begynnelsen av 1990-tallet har oktober vært mye brukt for biologisk avbildning av vev struktur og funksjon 2. Oktober genererer tverrsnitt bilder ved å måle ekko tidsforsinkelse av tilbakespredt lys 4 ved å implementere lav koherens lyskilde med en fiberoptisk Michelson interferometer 2,4. SD-OCT, også kjent som Fourier domene OCT (FD-OCT), ble først introdusert i 1995 5 og gir en overlegen imaging modalitet sammenliknet med tradisjonell tid domene OCT (TD-OCT). I SD-oktober er referansen armen holdes stasjonært resulterer i en høy hastighet og ultrahøy oppløsning bildeopptak 6-9.

For tiden har TSCW modeller stor grad blitt brukt for in vivo avbildning av hjernen anvendelser av to-foton mikroskopi i stedet for et tradisjonelt kraniotomi. Disse TSCW har blitt brukt samtidig med en tilpasset hodeskalle plate eller et glass dekkglass 10-13 for å gi ekstra imaging stabilitet. I våre studier har vi sett at tilbehør som disse er ikke nødvendig for oktober bildebehandling når en TSCW brukes. Derfor tillater mangelen på en hodeskalle plate eller glass dekkglass for et bredere spekter av bildebehandling vinduet størrelse som de kan forstyrre den optiske strålen og endre oktober bilder.

En tynnet-skull preparatet har vist seg å være fordelaktig i imaging studier av hjernen ved hjelp av to-foton mikroskopi 10-13. I våre eksperimenter, benytter vi et SD-OCT-systemet til bilde cortex in vivo gjennom en TSCW. Våre tilpassede SD-oktober bildebehandling oppsettet inneholder en bredbånd, lav koherens lyskilde bestående av to superluminescent dioder (SLD) sentrert ved 1295 nm med en båndbredde på 97 nm resulterte i en aksial og lateral oppløsning av 8 um og 20 um, henholdsvis 14 . Med vår optiske imaging-enhet, ser vi at avbildning gjennom en TSCW har et stort potensial i å identifisere og visualisere strukturer og funksjoner i optically tett hjernevev.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Kirurgisk Forberedelse

  1. Kvinne CD 1 mus i alderen 6-8 uker ble brukt i våre eksperimenter.
  2. Anesthetize musen med en intraperitoneal injeksjon av en ketamin og xylazin kombinasjon (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xylazin). Plasser musen på en homeothermic pad for å sikre optimal kroppstemperatur på ~ 37 ° C. Kontinuerlig overvåker nivået av anestesi ved å teste dyr reflekser (f.eks, klemming fot med sløve tang) og injisere mer bedøvelse når det er nødvendig.
  3. Smør begge øyne med en kunstig tåre salve. Fjern hår på hodebunnen ved hjelp av en barberhøvel og fjerne rester hår med 70% alkohol prep pads. Påfør et tynt lag med Nair hårfjerning krem ​​over hodebunnen og vente 2 min for at den skal tre i kraft. Tørk forsiktig bort Nair og gjenværende hår ved hjelp av saltvann fuktede vattpinner og alkohol prep pads. Hodebunnen skal nå være helt naken.
  4. Desinfisere hodebunnen ved hjelp av en Betadine swab pinne og rengjøre med 70% etanol prep pads.
  5. Nøye vikle dyret operasjonsduker å sikre optimal kroppstemperatur på ~ 37 ° C og monter dyret på en stereotaksisk ramme å immobilisere skallen. Lett trykk skallen for å sikre stabilitet. En liste over materialer som brukes er gitt i tabell 1.

2. Tynnet-skull Cortical Window Forberedelse

  1. Start snitt på midtlinjen punktet mellom øynene. Fortsett caudally til midtlinjen punkt mellom ørene. Del i huden med pinsett.
  2. Lokalisere området som skal tynnes under et disseksjonsmikroskop og fjern forsiktig fascia med pinsett. Tørk skallen med sterile bomullspinner før du oppretter tynnet kortikale vinduet. I våre eksperimenter, har vi opprettet en 4 × 4 mm tynnet cranial vindu ~ 1 mm posteriort og lateral til bregma.
  3. Begynn tynning skallen med en runde karbid bur med bitstørrelsen 0,75 mm i en kirurgisk hånd drill ved hjelp av lys feiende bevegelse only. Gjelder ikke direkte press på skallen. Stans boringen hver 20-30 sek for å fjerne bein støv med sterilt saltvann og bomullspinner og for å unngå overoppheting av skallen. Saltvann vil også hjelpe dissipating varmen gjennom skallen.
  4. Når det ytre lag av den kompakte benet er helt fjernet midt svampaktig bein lag bør nå være synlig. Det kan være noen liten blødning som blodkar er mer tydelig i svampaktig bein laget. Bytt til en grønn stein bur og fortsette boring med ekstra forsiktighet som spongy laget er mer delikat. Den grønne stein bur vil fjerne mindre beinmateriale samtidig skape jevnhet gjennom skallen vinduet. Stans boringen av og til for å fjerne bein støv og for å avkjøle skallen.
  5. Til slutt, når skallen er blitt mer gjennomsiktig og blodkar i hjernen er nå synlig, begynner polering skallen med en polering bur. Dette vil gi en mer presis tynning samtidig som den jevner ned skallen. Sjekk thinness av skull ved å banke på det med tang. Stopp polering når skallen blir litt fleksibel.
  6. Tynnet cranial vinduet skal nå være helt glatt og reflekterende og klar for avbildning (figur 1). På grunn av beskaffenheten av høyt spredning vev i hjernen, bør skallen tynnes til minst 55 um for optimal dybdepenetrering. En liste over materialer som brukes er gitt i tabell 1.

3. Optisk koherens tomografi Imaging

  1. Etter operasjonen er fullført, sjekk dyrets pustehastighet og reflekser å sikre riktig nivå av anestesi og administrere ytterligere anestesi om nødvendig. Fjern dyret fra stereotaksiske ramme, holde dyr innpakket i operasjonsduker, og transport dyret til bildebehandling stasjon.
  2. Før bildebehandling sjekk skiltene til reflekser og bruk ekstra kunstig tåre hvis nødvendig. Montere dyret på den stereotaksiske rammen for å sikre skallen.
  3. Sted dyret underOktober kamera og plasser TSCW under den optiske strålen (figur 2). En tverrsnittsriss av skallen og hjernen kan nå bli visualisert (figur 3).
  4. Datainnsamling kan begynne straks område av interesse ligger. For bildedannende formål, bruker vi galvo speil å oppnå en avbildning vindu med en bredde på 4,0 mm. En avbildning dybde på 2 mm ble oppnådd med 6 mW av hendelsen makt og et samlingspunkt 1 mm under tynnet skallen. Hver tverrsnitt besto av 2048 aksiale skanninger med et oppkjøp hastighet på 0,14 sekunder per bilde.
  5. Volumetriske skanninger av hjernen kan også oppnås ved å samle en rekke 2D tverrsnitt bilder ved å bruke to sett med galvo speil for xy skanning med første galvo speilet skanning bjelken i sagittal retning og andre galvo speilet skanning i den koronale retning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etter oppretting av en tynnet vindu over hjernebarken blodkar skal nå være mer visuelt fremtredende (figur 1), og vil tillate en dypere avbildning dybde (opp til 1 mm). Høyre cortex er tynnet til ca 55 um i forhold til en normal hodeskalle målt ved 140 um (figur 1) og gir større optisk klarhet. Ytterligere tynning til 10-15 um er mulig 11 imidlertid ikke nødvendig da bruk av glass dekkglass og skallen plater ikke gjennomføres i våre eksperimenter (figur 1 og 2). Denne spesielle metoden har tillatt oss å identifisere spesifikke strukturer (cerebral cortex, corpus callosum) i våre oktober cross-sectional bilder (figur 3). Parasagittal oktober bilder av en normal skull (Figur 3A) versus en tynnet skull (Figur 3B) er vist å sammenligne utfallet av en OCT bilde med en vellykket TSCW. I tillegg kan en koronale snitt oktoberBildet er også oppnådd å rette identifisere midtlinjen strukturer (figur 3C). Maksimum signal intensitet for figur 3 er 45 dB over støynivå. En intensitet profil sammenligning av en ikke-tynnet hodeskallen og en tynnet hodeskalle avslører en større signalintensitet og dybdepenetrering i TSCW modell (Figur 4).

Figur 1
Figur 1. TSCW i en mus modell. En 4 × 4 mm tynnet skull vindu (angitt i prikkete firkantet boks) er opprettet ~ 1 mm posteriort og lateral til bregma over høyre cerebral halvkule ved hjelp av ulike tannhelsepersonell burs. Høyre cortex (tynnet til ca 55 mikrometer) er betydelig mer gjennomsiktig enn de ikke-tynnet skull (venstre cortex, 140 mikrometer) som gir større dybde penetrasjon for optisk avbildning ved hjelp oktober β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal sutur.

Figur 2
Figur 2. Oktober avbildning av TSCW in vivo. En mus modell med en tynnet-skull er løst i en stereotactic ramme under målet for oktober bildebehandling in vivo.

Figur 3
Figur 3. Oktober bilder av hjernebarken in vivo. (A) Parasagittal oktober bilde av hjernebarken under en normal skallen. (B) Parasagittal oktober bilde av cortex under en tynnet skallen. (C) Koronal oktober bilde av en tynnet hodeskalle (venstre) og en normal skull (til høyre). Strukturene av hjernen er mer visuelt tydelig under en TSCW sammenlignet til en vanlig hodeskalle. Oktober bilder fra ble hentet fra den samme musen in vivo med bildebehandling størrelse 50.5 mm × 2 mm med maksimal signal intensitet på 45 dB. β = bregma, CC = corpus callosum, SS = sagittal sutur, skala bar = 1 mm.

Figur 4
Figur 4. Belastningsprofiler sammenligninger av normal og tynnet skallen prep. TSCW tillater økt signal intensitet og dybde penetrasjon. Den TSCW oppnår en avbildning dybde på omtrent 1 mm med tilstrekkelig SNR.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bildebehandling med oktober og en tynnet-skull er en roman nevro-imaging teknikken som bare har nylig blitt undersøkt 15, 16. I våre eksperimenter, viste vi muligheten for SD-OCT avbildning gjennom en TSCW i en mus modell in vivo. Fra våre resultater, er skallen tynnet til ca 55 um og inntrengningsdybde oppnås ved ca 1 mm med bildeoppløsning av 8 um og 20 mikrometer i den aksiale og laterale retning, henholdsvis. I signalintensiteten profilen, øker oktober avbildning gjennom en TSCW signalintensitet og dybdepenetrering sammenlignet med en normal skull (figur 4). Til sammenligning kan to-foton avbildning med en TSCW ved hodeskalle tykkelse ~ 10-15 um nå tenkelig dyp 150-250 mikrometer under pial overflaten 10, 11, 13 med aksial oppløsning på ~ 3 um 10 mens en tynnet skallen ~ 20 mikrometer bildebehandling dybde kan nå opp til 300-400 mikrometer i hjernebarken 12. Overall, optisk bildebehandling med oktober viser seg å være en lovende imaging modalitet, som tillater en tykkere TSCW under tynning prosessen samtidig som det gir dypere dybdepenetrering enn mutiphoton mikroskopi.

Benytte en tynnet-skallen er fordelaktig i optisk imaging eksempel 15.10.16 og to-foton mikroskopi 10-13 som det gir liten eller ingen neuroinflammation sammenlignet med en kraniotomi hvis tynning gjennomføres vellykket 11, 12, 15, 16,. Ansette en kraniotomi for imaging kan resultere i reaktiv microglia samt oppregulering av glial fibrillary sure protein (GFAP) i reaktive astrocytes etter fornærmelser til hjernen. Imidlertid viser bildebehandling etter vedta en tynnet-skull teknikk ikke-aktiv microglia og svak GFAP farging antyde ikke-reaktive astrocytes 10. Gjennom riktig tynning av skallen, bestemte strukturer i hjernebarken, som microglia morfologi og kortikale blodkar, cen skilles 11-13. Likevel finnes det ulemper ved å bruke et TSCW for optisk avbildning. Hvis skallen ikke er tynnet til riktig tykkelse eller skallen har ru overflater på grunn av feilaktig tynning dybdepenetrering for imaging kan begrenses. En annen ulemper for dårlig bildebehandling dybde kan skyldes sub-dural blødning skyldes vibrasjoner av boring. Blødning under dura er uunngåelig og kan derfor ikke brukes til oktober bildebehandling. I tilfeller som disse, bør et nytt dyr modellen brukes for eksperimentet.

Identifisere visse strukturer innenfor hjernebarken ved hjelp oktober gjennom en TSCW kan være nyttig i å spore nevrodegenerative sykdommer og til å studere endringer i hjernens funksjon. Imaging blodstrøm kan oppnås gjennom Doppler 17 oktober 18 som kvantifisering cerebral blodstrøm er viktig i overvåkingen metabolske kravene i hjernen i å studere slag, Alzheimers sykdom 18, eller hjernesvulster 17. Aksonalog neuronal degenerasjon er også fremtredende i oktober bilder og kan dra nytte studier av ulike hjernen lidelser. Av tenkelig retinal nerve fiberlag (RNFL), som inneholder ganglion celle axoner, mekanismer for nevro-degenerasjon, nevro-beskyttelse, og nevro-reparasjon kan visualiseres ikke bare i optiske lidelser, men også i nevrologiske sykdommer som Parkinsons 19 og multippel 20 sklerose, 21, sistnevnte som har blitt undersøkt i detalj ved å måle 21 og makula retinal lagtykkelse gjennom oktober segmentering teknikker 20.

Nevro-imaging med oktober er ikke bare begrenset til bildebehandling strukturer og funksjoner i hjernen. Oktober kan være fordelaktig i kronisk in vivo 10 avbildning, 11 så vel som i stereotactic prosedyrer som elektrofysiologiske og mikroinjeksjon studier 1, 3, 15-17. I nevrokirurgi kan oktober brukes som en biopsi eller føre verktøyet 2 ved at kirurger å visesanntid bilder av spesifikke anatomiske trekk i hjernen 17. Med videre utvikling, mener vi vår nåværende kombinasjon av SD-OCT med en TSCW har potensial til å forbedre en behandlerens evne til å diagnose nevrologiske underskudd når den brukes med andre modaliteter som et intrakranialt trykk (ICP) skjerm 22, magnetisk resonans imaging ( MRI), eller datastyrt aksial tomografi (CAT) 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av UC Discovery Proof of Concept stipend og ved NIH (R00 EB007241). Forfatterne vil også gjerne takke Jacqueline Hubbard for hennes assistanse i dette eksperimentet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ketamine Phoenix Pharmaceuticals 57319-542-02
Xylazine Akorn, Inc. 139-236
Artificial Tears Ointment Rugby 0536-6550-91
Nair Church Dwight Co., Inc. 4010130
Sterile Alcohol Prep Pad Kendall Healthcare 6818
Cotton Tipped Applicators Fisherbrand 23-400-115
Betadine Solution Swabstick Purdue Products 67618-153-01
Saline Solution, .9% Phoenix Pharmaceuticals 57319-555-08
Stereotactic Frame Stoelting
High Speed Surgical Hand Drill Foredom 38,000 rpm
Carbide Round Bur Stoelting 0.75 mm
Dura-Green Stones Shofu Shank: HP
Shape: BA1
CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher Shofu Shape: Mini-Pt.
SpaceDrapes Braintree Scientific, Inc.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
  2. Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
  3. Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
  4. Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography. Science. 254, 1178-1181 (1991).
  5. Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
  6. de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
  7. de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
  8. Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
  9. Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
  10. Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
  11. Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742 (2012).
  12. Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
  13. Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
  14. Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
  15. Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
  16. Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
  17. Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
  18. Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
  19. Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
  20. Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
  21. Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
  22. Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).

Tags

Nevrovitenskap bioteknologi medisin Biomedical Engineering anatomi fysiologi tynnet-skull kortikal vindu (TSCW) Optisk koherens tomografi (OCT) Spectral-domene OCT (SD-OCT) cerebral cortex hjerne bildebehandling mus modell
Tynnet-skull Cortical Window Teknikk for<em&gt; In Vivo</em&gt; Optisk koherens tomografi Imaging
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Szu, J. I., Eberle, M. M., Reynolds, … More

Szu, J. I., Eberle, M. M., Reynolds, C. L., Hsu, M. S., Wang, Y., Oh, C. M., Islam, M. S., Park, B. H., Binder, D. K. Thinned-skull Cortical Window Technique for In Vivo Optical Coherence Tomography Imaging. J. Vis. Exp. (69), e50053, doi:10.3791/50053 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter