Summary
Vi beskriver en enkelt-celle high-throughput assay til måling af cytotoksicitet af T-celler, når inkuberet med tumormålceller. Denne fremgangsmåde anvender en tæt, elastomere matrix af sub-nanoliter brønde (~ 100.000 brønde / række) til rumligt begrænse de T-celler og målceller ved definerede forhold og er koblet til fluorescensmikroskopi for at overvåge effektor-mål-konjugation og efterfølgende apoptose.
Abstract
Kræft immunterapi kan udnytte specificiteten af immunrespons til at målrette og fjerne tumorer. Adoptiv celleterapi (ACT) baseret på den adoptive overførsel af T-celler genmodificerede til at udtrykke et kimært antigen receptor (CAR) har vist betydelig lovende i kliniske forsøg 1-4. Der er flere fordele ved at bruge CAR + T-celler til behandling af cancere, herunder evnen til at målrette ikke-MHC-begrænsede antigener og at funktionalisere T-cellerne for optimal overlevelse, homing og vedholdenhed i værten, og endelig at inducere apoptose af CAR + T-celler i tilfælde af værtsorganismens toksicitet 5.
Afgrænse de optimale funktioner CAR + T-celler, der er forbundet med klinisk fordel er afgørende for tilrettelæggelsen af den næste generation af kliniske forsøg. Nylige fremskridt inden for levende dyr billedbehandling som multiphoton mikroskopi har revolutioneret studiet af immun celle funktion in vivo 6,7. Mens disse studier har fremmet vores forståelse af T-cellefunktioner in vivo, T-celle-baserede ACT i kliniske forsøg kræver, at det er nødvendigt at forbinde molekylære og funktionelle egenskaber af T-cellepræparater præ-infusion med klinisk effektivitet efter infusion, ved anvendelse i vitro assays overvågning T-cellefunktioner lignende, cytotoksicitet og cytokinsekretion. Standard flow-cytometri assays er blevet udviklet, at bestemme den overordnede funktion af populationer af T-celler på enkeltcelle-niveau, men disse er ikke egnet til overvågning af konjugatdannelse og levetid eller mulighed for den samme celle at dræbe flere mål 8.
Microfabricated arrays designet i biokompatible polymerer, såsom polydimethylsiloxan (PDMS) er en særdeles attraktiv metode til rumligt begrænse effektorer og mål i små volumener 9. I kombination med automatiseret time-lapse fluorescensmikroskopi, thousands af effektor-mål-interaktioner kan overvåges samtidigt af billeddannende individuelle brønde i en nanowell array. Vi præsenterer her en high-throughput metode til overvågning af T-cellemedieret cytotoksicitet på enkeltcelle-niveau, der stort set anvendes til at studere den cytolytiske funktion af T-celler.
Protocol
1. Reagenser Forberedelse
- Forbered RPMI-PLGH ved at blande 500 ml RPMI-1640 og 5 ml hver af penicillin-streptomycin, L-glutamin og HEPES opløsning.
- Forbered R10 opløsning ved at blande RPMI-PLGH med 10% føtalt bovint serum (FBS). The FBS er varmeinaktiveret ved 56 ° C i 30 min før tilsætning.
- Pre-varme ved 37 ° C 50 ml RPMI-PLGH, 15 ml PBS, og 15 ml R10 i sterile koniske rør.
- Fremstilling af arrays af nanowells i PDMS: The silicium master er fremstillet ved hjælp af fotolitografi væsentlige som beskrevet tidligere 10. Bland grundigt Sylgard 184 elastomer kit base og hærder ved 10:01 vægtforhold i en engangs kop med en plastik kniv. Afgasses blandingen i et vakuumkammer i 1 time. Hæld blandingen på nanowell array, forsegles med en glasplade og lad det sidde i 30 minutter. Overfør konstruktionen ind i en ovn indstillet til 80 ° C i 2 timer og lad afkøle ved stuetemperatur i 1 time. Elastomeren vil cure i denne periode og bindes til objektglasset. Objektglasset indeholdende PDMS nanowell arrayet er omhyggeligt løftes af silicium master, dækket med Scotch tape og opbevares indtil senere brug.
2. Målcelle (T) Mærkning
- Tæller 5000000 målceller fra cellekultur ved anvendelse af et hæmocytometer og pelletere cellerne i et sterilt 15 ml konisk rør ved centrifugering ved 340 x g i 5 min. Cellekulturen deles den foregående dag i 5 ml totalvolumen (densitet = 1 millioner / ml) og dyrket i T-25 kolbe (VWR). Protokoller for celletælling ved hjælp af hæmocytometer er blevet beskrevet i detaljer tidligere 11
- Aspirér overskydende medier efterlader ca 50 pi medier.
- Der fremstilles en arbejdsopløsning af Cell Tracker Red (CTR) ved blanding af 0,5 pi CTR stock (1 mM) til 150 pi RPMI-PLGH (slutkoncentration 2,5 uM). Tilsæt 150 pi af arbejdsopløsningen til målcellerne og blandes grundigt ved anvendelse af en P200 pipette.Alternativt kan PKH 26 (slutkoncentration på 2 uM) anvendes etiket målceller i henhold til fabrikantens instruktioner.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i 20 minutter.
3. Effektor (E) cellemærkning
- Tæller 5000000 effektorceller fra cellekultur under anvendelse af et hæmacytometer og pelletere cellerne i et sterilt 15 ml konisk rør ved centrifugering ved 340 x g i 5 min.
- Aspirér overskydende medier
- Der fremstilles en arbejdsopløsning af Vybrant DyeCycleViolet farveopløsning ved tilsætning af 1 ml af 5 mM Vybrant Violet lager til 1 ml R10 medier (slutkoncentration på 5 uM). Tilføj arbejdsopløsningen til cellerne og resuspendere med P200 pipette. Alternativt kan PKH 67 (slutkoncentration på 2 uM) anvendes etiket målceller i henhold til fabrikantens instruktioner. Hvis PKH 67 anvendes, er SYTOX Green bør ikke anvendes, da de er i samme fluorescenskanal. Opregningen af apoptotiske mål sker udelukkende ved hjælp af AnnexinV farvning i dette tilfælde.
Bemærk: Hvis du udfører time-lapse og ikke endpoint målinger, bør UV farvestoffer som Vybrant Violet undgås. - Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i 20 minutter.
4. Adskillelse af levende og døde celler anvendelse af en densitetsgradient
- Tilsættes 6,8 ml og 6,0 ml RPMI-PLGH til mål-og effektorceller, henholdsvis og blandes ved pipettering op og ned forsigtigt.
- Lag 3,5 ml Ficoll-Paque Plus til bunden af hver konisk rør indeholdende mål-og effektorceller. Lag af FICOLL langsomt at sikre en god dannelse af lag mellem FICOLL og medier.
- Centrifugér begge rør ved 340 x g i 30 min. uden bremse og acceleration.
- Under centrifugering, overførsel 7 ml forvarmet PBS til en 4-brønds plade. Forbered nanowell array (fremstillet i PDMS): clean bund objektglas med ethanol og oxidere PDMS ved høj RF-indstillingen ved hjælp af plasma oxidationsmiddel i 1 min. Dette skridt vil Sterilize den nanowell arrayet samtidig gøre PDMS hydrofile. Umiddelbart flytte nanowell array i pladen, der indeholder PBS.
- Overføre pladen til en biosikkerhed kabinet og aspireres overskydende PBS. Make 10 ml 1% noble agar ved tilsætning af 100 mg agarpulver til 10 ml DI-vand og derefter mikrobølgeovn det i 30-45 sek. Anvende varme 1% noble agar ovenpå og nederste kant af objektglas, som indeholder nanowell matrix til immobilisering af arrayet og vent 10 minutter på agar til størkning. Tilsæt 3 ml PBS og aspireringsstilling overskydende agar.
- Tilsæt 3 ml R10 på toppen af nanowell array og lad det ækvilibrere i ~ 10 min.
- Efter Ficoll centrifugering aspireres 5 ml medie fra det øverste lag af hvert rør. Vær omhyggelig med ikke at aspirere laget, der indeholder cellerne.
- Cellerne høstes (hvidt lag) ved udvinding af 1-2 ml fra lag mellem FICOLL og medier med P1, 000 pipette og flytte til nye sterile koniske rør. Gentag dette for begge sæt celler samtidig sikre, at du maksimeize de inddrivelsesprocedurer celler.
- Tilsæt 3 ml forvarmet RPMI-PLGH til hvert rør, blandes ved pipettering og pellet ved centrifugering ved 340 xg i 5 minutter på fuld acceleration og bremse.
- Aspirér overskydende medier, tilsættes 5 ml forvarmet RPMI-PLGH til hvert rør og gentag centrifugering ved 340 xg i 5 min.
- Aspirere overskuddet og resuspender cellepelleten i 500 pi af R10.
- Tælle levende celler under anvendelse af Trypan-blå eksklusion metode på et hæmacytometer.
5. Cell indladning Nanowell Array
- Aspirér overskydende medie fra nanowell array og der tilsættes 2 ml frisk R10 tværs af array. Aspirér igen samtidig sørge toppen af nanowell array er ikke alt for våd / tør, da det vil påvirke fordelingen af celler.
- Deposit 1 x 10 5 effektorceller i 200 ul af R10 over på nanowell array-overflade (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
- Lad celler nøjes med 5 min og anvendelse af en standard vævskultur mikroskop check til ensikres, at fordelingen af celler er ønskeligt. Tilføj flere celler hvis det er nødvendigt.
- Deposit 1 x 10 5 målceller i 200 pi R10 på nanowell array-overflade (densitet = 5 x 10 5 celler / ml).
- Lad celler nøjes med 5 min og anvendelse af en standard vævskultur mikroskop kontrol for at sikre, at fordelingen af celler er ønskeligt. Tilføj flere celler hvis det er nødvendigt.
- Skyl nanowell opstilling forsigtigt med 2 ml R10 og aspirere overskydende medier.
- Fremstilling af 3 ml forvarmet R10 i et 15 ml sterilt konisk rør. Tilsæt 3 ul 0,5 mM SYTOX Green nucleinsyrefarve (slutkoncentration 0,5 uM) og 60 pi af Annexin V-Alexa Fluor 647 til fremstilling af arbejdsopløsning. Tilføj arbejdsopløsningen på 4-brøndsplade omhyggeligt samtidig sikre, at cellerne ikke forskydes fra brøndene.
- Inkuber ved 37 ° C / 5% CO2 i 15 minutter.
6. Imaging 1
- Erhverve billeder af nanowell arrayet under anvendelse af en fluorescens MICRoscope: I dette eksempel anvender vi et ZEISS Observer Z-1 mikroskop udstyret med et motoriseret trin og Lambda-DG4.
- Initialiser software og mikroskop og kontroller signal intensitet på det lys og de andre fluorescerende kanaler. Samlet set vil der være fem kanaler, der svarer til: transmitteret lys, Annexin V-647 (Cy5 filter), CTR (DsRed filter), SYTOX Green (FITC-filter), og Vybrant Violet (DAPI-filter). Sørg for, at mikroskopet det setup at sikre maksimal signal til støj og samtidig undgå mætning.
- Sæt X og Y position for nanowell array. Begynder processen ved at nulstillingen og initialisering fokus på midten af 7 x 7 nanowell array-blok på øverste venstre hjørne af nanowell arrayet stempel. Indstil x, y-positioner til at falde sammen med centrum af hver blok og z-værdien for nøjagtigt at afspejle fokus på hver blok.
- Når position og fokus er alle indstillet, skal du sørge for at indstille billedet erhvervelse i linear mode og hente billeder.
7. Post-imaging
Overfør 4-brønds plade indeholdende nanowell array i en inkubator (37 ° C / 5% CO2) i 6 timer.
8. Imaging 2
Erhverve billederne på den anden tid-punkt som beskrevet i trin 6.
9. Billedanalyse
- The belægning af celler i nanowells bestemmes ved anvendelse af passende Billedsegmentering programmer (f.eks ImageJ, http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) i det væsentlige som beskrevet tidligere 9,12.
- Analyse af det første sæt mikroskopbilleder (t = 0 h, t 0) anvendes til at generere en database af de enkelte nanowells indeholder nøjagtigt et levende målcelle (identificeretved CellTracker Rød, rød) og ingen døde celler (identificeret ved Annexin V-farvning, grøn) [T1t 0 nanowells].
- Analyse af det andet sæt af mikroskopbilleder (t = 6 timer, t 6) anvendes til uafhængigt fastsætte en anden database af nanowells indeholdende 1 målcelle (rød) [T1t 6 nanowells]. En integritet check (databaseforespørgsel) er gennemført for at sikre, at alle levende mål på t 0 er matchet til mål på t 6 for at producere et endeligt sæt matchede mål (implementeret som nanowells der har T1t 0 = T1t 6, der er udpeget som T1match)
- Antallet af effektorceller i nanowells bestemmes under anvendelse Vybrant Violet farvning ved t 0 [E1 nanowells]
- En database forespørgsel er implementeret for at identificere nanowells indeholdende enkelte effektorer co-inkuberes med enkelt mål (defineret som nanowells der har E1 og T1 match, der er udpeget som E1T1)
- Effector induceret apoptose er scoret af i dentifying mål, der er Annexin V negativ ved t 0 og Annexin V positiv ved t 4 (E1T1 med Annexin V target farvning ved t 6).
10. Valgfri Time-lapse Imaging af Killing Brug Nikons BioStation IM
- Tag en petriskål med dækglas bund og skære et lille stykke af den nanowell array-chip (fremstillet ved trin 5), der vil netop passe på dækglasset. Sørg for, at chippen bliver våd, mens der skæres.
- Bland 1 x 10 6 mål og 1 x 10 6-T-celler i 100 pi medie, og pipetten det på dækglasset.
- Tillad ca 15-30 min for at lade cellerne bosætte sig.
- Hurtigt vende lille nanowell array-chip og placere den på dækglasset.
- For at sikre, at chippen ikke kan bevæge sig under billeddannelse, sted en eller to 20mm x 20mm dækglas på toppen af chippen. Påføre tryk blidt at presse chip til bunden af skålen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Et eksempel på anvendelsen af high-throughput cytolytisk assay er vist i figur 2. Kort fortalt mærket CD19-specifik CAR + T-celler blev co-inkuberet med mærkede muse-EL4-målceller i de enkelte brønde i en nanowell matrix (afsnit 1-5). Et første billede blev optaget på den automatiserede fluorescerende mikroskop for at identificere belægning (effektorer og / eller mål) af hver enkelt nanowell på array (afsnit 6). Billedbehandling blev anvendt til at identificere alle nanowells indeholder præcis et enkelt mål og en enkelt effektor og udelukke nanowells indeholder døde mål (afsnit 9). Chippen blev overført til en inkubator i 6 timer og derefter et andet billede af chippen blev registreret (afsnit 7-8). Evnen af effektor at inducere apoptose i målceller blev målt ved farvning med Annexin V, i nanowells indeholder netop et effektor og et mål. To parallelle eksperimenter blev udført med de samme effektorer og to sæt of målceller (EL4-CD19 + og EL4-CD19-(negativ kontrol)) til bestemmelse af frekvensen af antigen-specifik lyse (fig. 2). Det er ønskeligt at opnå lave frekvenser af ikke-specifik lysis (~ 2-4%). Den metode er afhængig af tilgængeligheden af egnede målceller og parallelle forsøg køres for at bestemme apoptose i mål uafhængige af effektorer. Høje frekvenser på target apoptose i fravær af effektorer over 6h periode (> 8%) angiver et behov for at optimere dyrkning og assaybetingelser. Den nanowell array kan tilpasses til time-lapse imaging når kontinuerlig overvågning er nødvendig (Movie 1), og dette giver mulighed for observation af effektor-target konjugering og efterfølgende celledød.
Figur 1. A. Skematisk af nanowell matrix baseret cytolytisk assay. Labelled CAR +T-celler (blå) og målceller (rød) inkuberes i et array af nanowells. Mikroskopi anvendes til at overvåge effektor medieret mål-cytolyse. B. Repræsentative sammensatte mikrografier af CD19-specifikke CAR + T-celler, der inducerer apoptose i EL4-CD19 + målceller og dem der ikke gør.
Figur 2. Antigen-specifik cytolytisk aktivitet af CD19-specifikt CAR + T-celler. Målcelle histogram plots af brønde indeholdende en enkelt effektor og et enkelt mål efter 6 timer af co-inkubering. Matchede histogrammer af målceller uden effektorer er vist at rapportere hyppigheden af baggrunden celledød.
Movie 1. Time-lapse microscopy af CAR + T-cellemedieret cytolyse. Car + T-celler (umærket) blev co-inkuberet med NALM-6-GFP +-målceller (grøn) i en naNowell og billeder blev taget hver 2 minutter i i alt 12 timer for at muliggøre dynamisk overvågning. Annexin V blev tilsat til dyrkningsmediet og apoptotiske celler bliver mærket rødt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi har skitseret protokollen for en high-throughput encellede cytolytisk assay aktiveret via co-inkubation af effektorer og mål i arrays af nanowells (figur 1). Ud over gennemløb en væsentlig fordel ved teknikken er evnen til at overvåge effektor-medieret cytotoksicitet mod ønskede målceller uden behov for målcellen teknik som igen tillader anvendelse af autologe eller matched / primære tumorceller som målceller. Den rumlige indeslutning tillader hentning og efterfølgende kloning af funktionelle T-celler ved afslutningen af assayet 9. En begrænsning af analysen er behovet for specialiserede mikroskoper med automatiserede faser og hurtigt skifte optik. Dette er imidlertid ikke en alvorlig begrænsning, da disse maskiner er nu bredt tilgængelig som en del af forsknings-core-faciliteter.
Der er en række af flow-cytometri assays, der giver højere gennemløb mens preserving encellede opløsning. Disse omfatter assays der plet for den surrogatmarkør for degranulering (CD107a) eller perforin indhold i effektorer og caspase / granzymes aktivitet i mål 13,14. Disse assays imidlertid ikke rigtig overvåger effektor-mål-konjugering eller evnen af effektoren til at engagere og dræbe flere mål. Sammenlignet med den gyldne standard assay, såsom en 4 timer 51Cr-release assay, kørt ved E: T-forhold på 1:1, typisk vores metode rapporterer den samme samlede antal cytolytiske effektorer, mens det stadig giver encellede opløsning. Selv protokollen beskrevet her kun oplysninger om cytotoksicitet, som beskrevet tidligere dette assay kan let kombineres med microengraving assay til bestemmelse af cytokiner, der udskilles af enkelte effektorceller upon target ligering 9. Det er således muligt at generere sammensatte funktionelle profiler af CAR + T-celler, der kombinerer cytotoksicitet og cytokinsekretion på enkelt-celle niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Forskningen rapporteret i denne publikation blev støttet af National Cancer Institute of National Institutes of Health under Award Number R01CA174385. Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter National Institutes of Health.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 w/o L-glutamine | Cellgro | 15-040-CV | |
| Penicillin-streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | 10,000 I.U. Penicillin 10,000 μg/ml Streptomycin |
| L-glutamine | Cellgro | 25-005-CI | 200 mM solution |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3537 | 1M |
| Fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | Lot tested |
| Cell Tracker Red Stain | Invitrogen | C34552 | 50 μg |
| Vybrant DyeCycle Violet Stain | Invitrogen | V35003 | 5 mM |
| SYTOX green Nucleic Acid Stain | Invitrogen | S7020 | 5 mM |
| Annexin V-Alexa Fluor 647 | Invitrogen | A23204 | 500 μl |
| Dulbecco's PBS | Cellgro | 21-031-CV | 500 ml |
| Noble agar | DIFCO | 2M220 | 100 g |
| Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154 | 0.4% liquid, sterile filtered |
| Hemocytometer | Hausser Scientifics | 1492 | Bright line |
| 4-well plate | Thermo Fisher | 167603 | |
| Harrick Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-32G | Basic plasma cleaner |
| Observer.Z1 | ZEISS | Fluorescent microscope (works with the three parts below) | |
| Lambda 10-3 | Sutter Instrument | Filter controller | |
| Lambda DG-4 | Sutter Instrument | Ultra-High-Speed Wavelength switcher | |
| Hamamatsu EM-CCD Camera | Hamamatsu | C9100-13 | CCD-Microscope camera |
| 15 ml conical tube | BD Falcon | 352097 | |
| 50 ml conical tube | VWR | 3282-345-300 | |
| Nikon Biostation | Nikon Instruments Inc. | Biostation IM | |
| Glass bottom culture dish | MatTek Corporation | P35G-0 | 35 mm petri dish, 10 mm microwell |
References
- Louis, C. U., et al. Antitumor activity and long-term fate of chimeric antigen receptor-positive T cells in patients with neuroblastoma. Blood. 118, 6050-6056 (2011).
- Savoldo, B., et al. CD28 costimulation improves expansion and persistence of chimeric antigen receptor-modified T cells in lymphoma patients. J. Clin. Invest. 121, 1822-1826 (2011).
- Kalos, M., et al. T cells with chimeric antigen receptors have potent antitumor effects and can establish memory in patients with advanced leukemia. Sci. Transl. Med. 3, 95ra73 (2011).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric Antigen Receptor-Modified T Cells in Chronic Lymphoid Leukemia. N. Engl. J. Med. , (2011).
- Restifo, N. P., Dudley, M. E., Rosenberg, S. A. Adoptive immunotherapy for cancer: harnessing the T cell response. Nat. Rev. Immunol. 12, 269-281 (2012).
- Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
- Sumen, C., Mempel, T. R., Mazo, I. B., von Andrian, U. H. Intravital microscopy: visualizing immunity in context. Immunity. 21, 315-329 (2004).
- Lamoreaux, L., Roederer, M., Koup, R. Intracellular cytokine optimization and standard operating procedure. Nat. Protoc. 1, 1507-1516 (2006).
- Varadarajan, N., et al. A high-throughput single-cell analysis of human CD8+ T cell functions reveals discordance for cytokine secretion and cytolysis. J. Clin. Invest. 121, 4322-4331 (2011).
- Ogunniyi, A. O., Story, C. M., Papa, E., Guillen, E., Love, J. C. Screening individual hybridomas by microengraving to discover monoclonal antibodies. Nat. Protoc. 4, 767-782 (2009).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat. Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Varadarajan, N., et al. Rapid, efficient functional characterization and recovery of HIV-specific human CD8+ T cells using microengraving. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 3885-3890 (2012).
- Makedonas, G., Betts, M. R. Living in a house of cards: re-evaluating CD8+ T-cell immune correlates against HIV. Immunol. Rev. 239, 109-124 (2011).
- Telford, W. G., Komoriya, A., Packard, B. Z. Multiparametric analysis of apoptosis by flow and image cytometry. Methods Mol. Biol. 263, 141-160 (2004).
