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Bioengineering

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.

Abstract

Los hidrogeles son polímeros reticulados hidrófilos que proporcionan un microentorno tridimensional con tejido-como elasticidad y alta permeabilidad para el cultivo de células o tejidos terapéuticamente relevantes. Los hidrogeles preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) derivados se utilizan cada vez más para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, en parte debido a sus propiedades sintonizables y citocompatible. En este protocolo, se utilizó tiol-eno de crecimiento paso a photopolymerizations para fabricar PEG-péptido hidrogeles para encapsular pancreático MIN6 células b. Los geles fueron formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGYC). La naturaleza hidrófila y no la formación de incrustaciones de PEG ofrece un microambiente citocompatible para la supervivencia y la proliferación celular en 3D, mientras que el uso de la secuencia del péptido con quimotripsina sensible (C GGY ↓ C, flecha indica el sitio de escisión de enzima, mientras que el quiste terminalesresiduos eine se añadieron para tiol-eno reticulación) permite una rápida recuperación de los constructos de células que forman dentro del hidrogel. El siguiente protocolo elabora técnicas para: (1) La encapsulación de MIN6 β-células en tiol-eno hidrogeles, (2) ensayos de células cualitativos y cuantitativos de viabilidad para determinar la supervivencia y la proliferación celular; (3) Recuperación de esferoides de células usando quimotripsina mediada gel erosión, y (4) Análisis estructural y funcional de los esferoides recuperados.

Introduction

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Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados con un potencial excepcional como los materiales del armazón para tejidos reparación y regeneración. 1-3 El alto contenido de agua de los hidrogeles permite la fácil difusión de oxígeno y el intercambio de nutrientes y productos metabólicos celulares, todas las cuales son cruciales para mantener la viabilidad celular. Además, los hidrogeles son excelentes portadores para la liberación controlada y suministro de células debido a su alta capacidad de ajuste. 2 hidrogeles sintéticos tales como los preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) se utiliza cada vez más en aplicaciones de ingeniería de tejidos, en gran parte debido a su cytocompatibility, tejido- como elasticidad, y capacidad de sintonización de alta en el material de propiedades físicas y mecánicas. 4-6

Aunque una plataforma de hidrogel de uso común, los estudios han demostrado que el PEG diacrilato (PEGDA) hidrogeles formados por photopolymerizations crecimiento de cadena tienen una tendencia a dañar las células encapsuladas during reticulación de la red y en la encapsulación de células in situ. 7 El daño celular se atribuyó en gran medida a las especies de radicales generados por las moléculas de fotoiniciador, que se propagan a través de los grupos vinilo sobre PEGDA para reticular las cadenas de polímero en hidrogeles. Desafortunadamente, estas especies de radicales también causar tensiones y daño celular durante la encapsulación de células, especialmente para las células sensibles a radicales tales como el de páncreas β-células. 8-10 Con el fin de obtener un tamaño de malla más alta para una mejor difusión y la supervivencia celular, pesos moleculares más altos PEGDA se utilizan a menudo para la encapsulación de células. Esto, sin embargo, compromete la cinética de polimerización y causa sub-óptimas propiedades de gel biofísicos. 7,11,12 Además de las desventajas anteriormente mencionadas, es muy difícil de recuperar las estructuras celulares a partir de hidrogeles PEGDA debido a la naturaleza heterogeneidad y no degradable de las redes reticuladas. Mientras sensibles a la proteasa péptidos pueden ser incorporadosen esqueleto de PEG macrómero para hacer que los hidrogeles PEGDA otra parte inertes sensibles a la escisión enzimática, la conjugación a menudo usa reactivos caros y las redes resultantes contienen todavía alto grado de heterogeneidad debido a la naturaleza de la polimerización de crecimiento de cadena. 13-15

Recientemente, PEG-péptido hidrogeles formados a través de tiol-eno por crecimiento en etapas de fotopolimerización se ha demostrado que exhiben propiedades preferentes para la encapsulación de células a través de los hidrogeles formados por fotopolimerización crecimiento de cadena. 7 La cinética de gelificación superiores de tiol-eno hidrogeles se atribuye al clic " "la naturaleza de la reacción entre tiol y funcionalidades ENE. En comparación con la polimerización de crecimiento de cadena PEGDA, tiol-eno de reacción es menor de oxígeno inhibe la que los resultados de la tasa de gelificación más rápido. 16,17 tiol-eno hidrogeles también tienen una mayor eficiencia de polimerización y mejores propiedades biofísicas de gel en comparación con PEGDA crecimiento de cadena hidrogeles, 7 , 18 </ Sup>, que se traduce en un daño limitado celular causada por especies de radicales durante la fotopolimerización.

Anteriormente, tiol-eno hidrogeles formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y bis-cisteína que contienen reticulantes de péptidos, tales como péptidos sensibles a proteasa se ​​han utilizado para encapsulación de células. 7,18 tunability alta de las redes de hidrogel de PEG ofrece una microambiente 3D flexible y controlable para investigar la supervivencia celular y la actividad, mientras que el uso de proteasa sensible a la secuencia del péptido proporciona una manera suave para la recuperación de las construcciones de células formadas naturalmente dentro de los hidrogeles. En este protocolo, se utilizan por crecimiento en etapas fotopolimerizado tiol-eno hidrogeles fabricados usando 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGY ↓ C) para la encapsulación de las células MIN6 β. Este protocolo sistemáticamente elabora técnicas para el estudio de la formación de la supervivencia, proliferación y esferoide de MIN6β-células en tiol-eno hidrogeles. Además proveímos método para la recuperación de las células β esferoide y caracterización biológica de los esferoides recuperados.

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Protocol

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A. Síntesis de péptidos y Macrómero

  1. Sintetizar 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y arylphosphanate fotoiniciador de litio (LAP) utilizando protocolos establecidos. 18,19
  2. Sintetizar bis-cisteína que contiene quimotripsina sensible al péptido CGGY ↓ C (la flecha indica el sitio de escisión quimotripsina) utilizando estándar de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS).
    1. Calcular la cantidad de resina (Rink-amida resina MBHA) necesario en base a la relación de sustitución de la resina y la escala de síntesis. Hinchar la resina en dimetilformamida (DMF) en un recipiente de reacción (RV) durante 15 min.
    2. Eliminar el grupo protector Fmoc de la resina usando una solución de desprotección que contiene 20% de piperidina y 0,1 M de HOBt en DMF. Utilizar los parámetros enumerados en la tabla siguiente para asistida por microondas Fmoc-desprotección (para todos los ácidos Fmoc-aminoácidos):
      Síntesis escala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Poder 20 W 50 W
      Temperatura 75 ° C 75 ° C
      Tiempo 3 min 3 min
    3. Después de la desprotección, enjuague de la resina con DMF y realizar la prueba de ninhidrina para confirmar la eliminación de Fmoc (exposición de amina N-terminal). Resina debe ponerse azul después de 2 min a 95 ° C.
    4. Después de la desprotección con éxito par, la primera Fmoc-aminoácido en el extremo C-terminal (síntesis va de C a N-terminal) en una solución de base activador (0,28 M diisopropiletilamina (DIEA) en DMF) con los parámetros enumerados en la tabla siguiente .
      Síntesis escala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Poder 20 W 50 W
      * Temperatura 75 ° C 75 ° C
      Tiempo * 5 min 5 min

      * Para quiste y Su, use 50 ° C y 10 minutos para reducir la racemización.
    5. Enjuagar la resina y realizar una prueba de ninhidrina para confirmar cualitativamente la finalización de acoplamiento (desaparición de amina N-terminal). Resina debe ser clara después de 5 min a 95 ° C. Repita el paso de acoplamiento (A.2.d) si la prueba de ninhidrina devuelve un resultado positivo (color azul).
    6. Desprotección repetición (paso A.2.b) y el acoplamiento (A.2.d paso) para aminoácidos adicionales en la secuencia termina con una etapa de desprotección final.
    7. Escurrir la RV, enjuague resina con 25 ml de diclorometano (DCM). Este paso es para enjuagar DMF, que es una base y obstaculizará escisión del péptido.
    8. Preparar un cocktail de escisión mediante la mezcla de 250 mfenol en 4,75 ml de ácido trifluoroacético (TFA), 0,125 ml de triisopropilsilano (TIS) y 0,125 ml ddH 2 O. g
    9. Añadir solución de escisión en el RV y escindir durante 30 minutos en el sintetizador de péptidos de microondas (potencia = 20 W; Temperatura = 38 ° C).
    10. Recoger la solución de péptido en un tubo de centrífuga de 50 ml utilizando colector de vacío.
    11. Péptido escindido precipitado en 40 ml de éter, el tubo vortex y se centrifuga a 3.000 rpm durante 5 min para recoger el péptido.
    12. Vaciar el sobrenadante y repetir A.2.k paso dos veces.
    13. Recoger y secar péptido en el vacío.
    14. Se purifica el péptido mediante HPLC y caracterizar con espectrometría de masas.

B. Preparación de Material y Esterilización

  1. Preparar solución en peso PEG4NB 20% en PBS, vórtice la mezcla hasta que se disuelve completamente el macrómero, y esterilizar la solución de macrómero utilizando un filtro de jeringa. Guarde la solución se esterilizó a -20 ° C (preparar alícuotaspara almacenamiento a largo plazo).
  2. Preparar y esterilizar fotoiniciador 2% en peso (LAP) en solución de PBS. Almacenar la solución esterilizada a temperatura ambiente protegido de la luz.
  3. Disolver el péptido (CGGYC) en PBS, la mezcla de vórtice y filtro de jeringa de la solución para la esterilización. Alícuota de la solución de péptido y se almacena a -20 ° C hasta su uso (evitar ciclos de congelación-descongelación).
  4. Determinar tiol (-SH) concentración en la solución de péptido preparado usando el reactivo de Ellman (seguir el protocolo del fabricante). Este paso dará la concentración de péptido exacta (es decir, [SH] / 2) que se requiere para el cálculo de la cantidad de péptidos a usar en tiol-eno de fotos clic reacciones.
  5. Preparar los moldes de gelificación por el corte de la porción superior fuera de jeringas de 1 ml estériles desechables usando una hoja de afeitar (punta abierta para la eliminación de gel). Esterilizar los moldes de jeringa por autoclave.
  6. Basado en la formulación de gel deseada (relación de tiol a eno = 1) y las concentraciones de compañero de stockriales, calcular el volumen requerido de polímero, agente reticulante péptido, fotoiniciador, y soluciones de tampón requerido.

C. Preparación de la célula

  1. Equilibrar medio de cultivo celular (alta glucosa DMEM que contenía 10% de suero fetal bovino; antibiótico-antimicótico con 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 250 ng / ml de Fungizone, y 50 mM β mercaptoetanol-), Hank de solución salina equilibrada ( HBSS, Ca 2 +, Mg 2 + libre) y tripsina-EDTA a 37 º C.
  2. Retirar frascos que contienen MIN6 β-células de CO 2 incubadora y colocar los frascos en la campana de flujo laminar.
  3. Aspirar los medios de cultivo de células de los matraces y lavar la cubeta con HBSS.
  4. Tripsinizar las células utilizando 3 ml de 2X (0,1%) Tripsina-EDTA y se incuban los matraces durante 4 min a 37 ° C y 5% CO 2.
    • Nota: Utilice 2X solución de tripsina permite la disociación completa de MIN6 β-células en suspensión de células individuales.
    </ Li>
  5. Después de la incubación, los matraces toque en la superficie de la campana suavemente para desprender completamente las células. Confirmar el desprendimiento y la disociación de las células utilizando un microscopio.
  6. Añadir un volumen igual de medio de cultivo celular para neutralizar la tripsina. Mezclar bien la solución mediante pipeteo suave, a continuación, transferir la mezcla a un tubo de centrífuga y canónica durante 5 min a 1.000 rpm.
  7. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender suavemente las células en 4 - 5 ml de medios de cultivo.
  8. Determinar la densidad celular usando Trypan 50% tampón azul en un hemocitómetro.

D. Fabricación de hidrogel y encapsulación de células

  1. Una vez que las células están listas, mezcla (basado en una relación de 1:1 a tiol eno) los volúmenes requeridos de PEG4NB, CGGYC, LAP, solución de células, y HBSS en un tubo de microcentrífuga.
  2. Mezclar la solución suavemente con una pipeta para obtener una mezcla homogénea y añadir 25 ml de la solución resultante a un molde de jeringa. Exponer la jeringa a la luz UV (365nm, 5 mW / cm 2) durante 2 min.
  3. Después de fotopolimerización, geles de inmersión en una solución estéril de 24 pocillos placa que contiene medio de cultivo celular y se incuban los hidrogeles en 37 º C y 5% de CO 2.
  4. Lavar los hidrogeles de células cargadas en medio de cultivo celular durante 30 minutos para enjuagar las células poco adheridas y macrómeros no reticulado. Transferir los geles en medio fresco.
  5. Actualizar medios de cultivo celular cada 2 a 3 días.

E. Ensayo de Viabilidad Celular

Morfología celular encapsulado se puede observar al microscopio de luz (ya que los hidrogeles sintetizados son transparentes). La viabilidad celular se puede visualizar y medir cualitativamente usando Live / Dead manchas y cuantitativamente utilizando el reactivo AlamarBlue.

E.1. Live / Dead tinción

  1. Descongelar Live / Dead reactivos de tinción a temperatura ambiente.
  2. En un tubo canónica añadir PBS de acuerdo con el número de muestras (n) a ser teñido:
    volumen total de PBS = n × 500 l
  3. Pipetear 0,25 l de calceína AM y 2 l de EthD-1 por 1 ml de PBS al tubo canónica que contiene PBS. Vortex la solución para mezclar los componentes.
  4. Incubar células cargadas de hidrogeles en solución de tinción LIVE / DEAD (0,5 ml / muestra) durante 1 hora a temperatura ambiente en un agitador orbital.
  5. Utilizando una pipeta Pasteur, se retira la solución colorante y enjuagar la muestra dos veces con PBS.
  6. Colocar la muestra en un cubreobjetos o portaobjetos de vidrio. Observar y celdas de imagen con un microscopio confocal.

E.2. AlamarBlue Ensayo

  1. Preparar 10 v / v% AlamarBlue solución en medio de cultivo celular.
  2. Eliminar los hidrogeles de la incubadora y aspirar los medios de comunicación de cada pocillo sin hacer contacto con el hidrogel.
  3. Incubar células cargadas de hidrogeles y un (control negativo) se vacía bien en 500 l de 10% de solución de AlamarBlue durante 16 horas.
  4. Después de la incubación, pipeta 200 lde la solución de AlamarBlue en una placa de 96 pocillos y la fluorescencia medida usando un lector de microplacas (excitación: 560 nm, emisión: 590 nm).
    • Actividad metabólica celular Superior reduce el tinte para dar mayor lectura de fluorescencia.
    • Asegúrese de incluir por lo menos dos pozos de solución al 10% alamarBlue como espacios en blanco. Al analizar los datos, se resta el valor de fluorescencia promedio en blanco de la lectura de la fluorescencia de las muestras.

F. La quimotripsina mediada Gel Erosión y recuperación Esferoide

  1. Preparar 1 mg / ml de tripsina libre de α-quimotripsina solución en HBBS y solución estéril de filtro.
  2. Incubar hidrogeles en solución quimotripsina (500 l para cada gel) a temperatura ambiente con agitación suave hasta que la erosión del gel completo se logra.
    • Para un gel de 25 l, el tiempo para la erosión total es de aproximadamente 5 min.
  3. Colocar la placa en hielo durante unos minutos para reducir la actividad de losquimotripsina.
  4. Transferir la solución de células en un tubo de 1 ml y se centrifuga a 300 rpm, 4 º C durante 2 min.
  5. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de pastos y resuspender suavemente los esferoides en HBSS.
  6. Transferir la solución recuperada esferoide a una placa de 24 pocillos y coloque la placa en hielo para permitir que los esferoides para establecerse.
  7. Para el análisis de tamaño, adquirir imágenes de contraste de fase de los esferoides se establecieron utilizando un microscopio óptico. Medida recuperado diámetro esferoidal utilizando un programa como elemento de Nikon o software ImageJ.

G. Ensayo Funcional de esferoides recuperados

G.1. Glucosa estimulada por insulina, la secreción de los esferoides de células recuperadas

  1. En una placa de 24 pocillos, se incuban los geles en 500 l de 2 mM de glucosa bajo Kerbs-Ringer (KRB) durante 1 hora.
  2. Erode el gel y recuperar esferoides celulares usando pasos F.1 a F.6.
  3. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente sin hacer ningúncontacto con los esferoides de células y resuspender los esferoides en 500 l de 2 KRB mM glucosa baja.
  4. Transferir 100 l de solución de células esferoides a un tubo de 0,6 ml y colocarlo en hielo durante intracelular cuantificación ATP.
  5. Dividir la solución de células restante esferoide en un medio (en dos tubos de microcentrífuga) y centrifugar durante 2 minutos a 300 rpm y 4 ° C.
  6. Aspirar el sobrenadante (casi hasta el fondo) y resuspender el medio primero de esferoides de células en 1 ml de 25 mM glucosa KRB alto y medio segundo en 1 ml de 2 mM KRB bajo en glucosa.
  7. Suavemente la pipeta y transferir la solución que contiene recuperados esferoides de células a una placa de 24 pocillos. Incubar la placa durante 1 hora a 37 ° C y 5% CO 2.
  8. Después de la incubación, transferir la solución a un tubo de microcentrífuga y se centrifuga durante 2 min a 1.000 rpm y 4 ° C.
  9. Transferir 500 l del sobrenadante del tubo se centrifugó a otro tubo de microcentrífuga y se almacena a 4 ° C durante la insulinaELISA.
  10. Realizar protocolo de insulina fabricante ELISA siguiente.

G.2. CellTiter Glo Ensayo

  1. Normas ATP: Preparar una solución de 10 mM ATP y realizar diluciones en serie para obtener una serie de soluciones estándar 8.
  2. Para un color blanco placa de 96 pocillos, se añaden 50 l de solución de células esferoide (del paso G.1.6) y las normas.
  3. A cada pocillo que contiene muestras y estándares, se añaden 50 l de reactivo CellTiter Glo e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Después de la incubación, el recuento de medida de la luminiscencia de las muestras y estándares utilizando un lector de microplacas y calibrar muestra las concentraciones de ATP utilizando una curva de regresión lineal generado por los estándares de ATP.
  5. Determine el total de la concentración de ATP en la muestra y se multiplica por el factor de dilución de la muestra para obtener la concentración intracelular de ATP en una célula cargada de hidrogel.

G.3. Determinar la secreción de insulina

  1. Calcular la amount de insulina secretada a partir de los esferoides recuperados tomando la relación de la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa mayor a la cantidad de insulina secretada en el medio de glucosa baja.
  2. Normalizar el contenido de insulina cuantificada de esferoides de células con cantidad respectiva de ATP intracelular de los esferoides de células recuperadas.

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Representative Results

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Las figuras 1-4 muestran los resultados representativos para la encapsulación, la supervivencia, la proliferación, la formación de esferoides, y la recuperación esferoide en tiol-eno hidrogeles. Figura 1 muestra el esquema de reacción de (1) por crecimiento en etapas tiol-eno fotopolimerización usando PEG4NB y CGGYC, y ( 2) quimotripsina erosión gel mediada que sigue un mecanismo de erosión de la superficie. Figuras 2 y 3 los resultados de viabilidad presentes obtenidos mediante la tinción LIVE / DEAD y ensayo AlamarBlue. Observamos que las células proliferaron en PEG4NB-CGGYC hidrogeles incluso a baja densidad de empaquetamiento de células, lo que indica el sistema de hidrogel cytocompatibilty de tiol-eno. Figura 4 muestra imágenes de contraste de fase de los encapsulados y se recuperó β-esferoides de células, así como la distribución del tamaño de la recuperó β-células esferoides.

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Figura 1. Esquema de crecimiento en etapas tiol-eno foto-clic reacción usando PEG4NB y CGGYC para formar PEG-péptido conjugado. Los hidrogeles pueden ser erosionado rápidamente por tratamiento quimotripsina.

Figura 2
Figura 2. Viabilidad inicial y esferoide de células formada en hidrogeles PEG4NB/CGGYC. (A) Live / Dead tinción se realizó inmediatamente después de la foto-encapsulación. (B) Live / Dead tinción realiza después de 10 días de cultivo in vitro. Representativos confocal z-pila de imágenes MIN6 β-células encapsuladas en 4% en peso hidrogeles PEG4NB/CGGYC (2 × 10 6 células / ml, escala = 100 m). La viabilidad celular se define como el porcentaje de vivos (verde) células sobre el total de células (verde + rojo) Número. (2 × 10 6 células / ml, n = 4, media ± DE).

Figura 3
Figura 3. La actividad metabólica de las células MIN6 β mide como una función del tiempo mediante reactivo AlamarBlue (N = 3, media ± SD). MIN6 β-células encapsuladas en 3% en peso, 4% en peso y 5WT hidrogeles PEG4NB/CGGYC% a 2 × 10 6 células / ml.

Figura 4
Figura 4. Caracterización de células recuperadas MIN6 β-esferoides. Esferoides de células se recuperaron de PEG4NB/CGGYC utilizando 40 quimotripsina mu M después de 10 días de cultivo in vitro. (A) fase Representante contraste de la imagen de encapsulados de células β-esferoides. (B) fase Representante contraste de la imagen de β-recuperados de células esferoides. (C) La distribución of diámetros esferoide (densidad celular = 1 × 10 7 células / ml).

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Discussion

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El protocolo descrito presenta detalles sobre la encapsulación fácil de células en tiol-eno hidrogeles formados por fotopolimerización por crecimiento en etapas. Mientras que una relación estequiométrica de 1:1 de norborneno de grupos funcionales tiol se utilizó en este protocolo, la relación puede ser ajustada dependiendo de los experimentos. Además de una formulación correcta, es importante para mantener la homogeneidad en la solución de pre-polímero. En particular, el uso pipeteo suave para asegurar que las células están bien distribuidos en la solución de pre-polímero con el fin de evitar la aglutinación de células y la variación en las propiedades del gel. Aunque un tiempo de polimerización de 2 min se utilizó para la reticulación de gel, el punto de gel de tiol-eno hidrogeles es menos de 10 segundos en la mayoría de células relevantes encapsulación-formulaciones (por ejemplo, punto de gel de hidrogel 4% en peso PEG4NB/CGGYC es 7 ± 2 seg y 5% en peso es 6 ± 1 seg). La gelificación rápida de este sistema de hidrogel rápidamente bloquea las células en su lugar, resultando en una mejor celdistribución l en 3D en comparación con otros sistemas de fotopolimerización que tengan minutos o incluso horas para llegar al punto de gel. 7,20

Además, β-esferoides de células formadas de forma natural en tiol-eno hidrogeles fueron recuperados por la erosión del gel quimotripsina mediada. Quimotripsina, sin embargo, es una enzima en la familia de la tripsina y la concentración o el tiempo de incubación largo de esta enzima puede afectar negativamente interacciones célula-célula o incluso interrumpir la arquitectura esferoide durante la recuperación. A fin de evitar esta limitación potencial, los hidrogeles pueden ser reticulados por otros sustratos tiolados y erosión gel todavía se puede lograr por enzimas adecuadas que no causan adverso interacción célula-célula.

En general, tiol-eno hidrogeles proporcionar un entorno citocompatible para promover la proliferación de las células β en 3D. Este sistema puede ser usado para cultivar y estudiar el comportamiento fisiológico de diversos tipos de células en 3D. Además,este sistema permite la recuperación fácil de los constructos de células formadas dentro de la matriz de hidrogel para las caracterizaciones más funcionales y biológicas. Este sistema de hidrogel diverso y ofrece citocompatible plataforma gel de ingeniería complejos tejidos 3D para aplicación medicina regenerativa.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este proyecto fue financiado por el NIH (R21EB013717) y IUPUI OVCR (RSFG). El autor agradece a la Sra. Han Tzu por su asistencia técnica.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles
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Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

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