Summary
निम्न प्रोटोकॉल कदम विकास खूंटी पेप्टाइड thiol ene फोटो क्लिक प्रतिक्रियाओं द्वारा गठित hydrogels में अग्नाशय β-कोशिकाओं encapsulating के लिए तकनीक प्रदान करता है. इस सामग्री को मंच न केवल सेल encapsulation के लिए एक cytocompatible microenvironment प्रदान करता है, लेकिन यह भी उपयोगकर्ता नियंत्रित सेल संरचनाओं के तेजी से वसूली hydrogels भीतर गठित परमिट.
Abstract
Hydrogels हाइड्रोफिलिक Crosslinked पॉलिमर कि लोच और संवर्धन therapeutically प्रासंगिक कोशिकाओं या ऊतकों के लिए उच्च पारगम्यता ऊतक की तरह साथ एक microenvironment तीन आयामी प्रदान कर रहे हैं. पाली (ethylene glycol) (खूंटी) डेरिवेटिव से तैयार Hydrogels तेजी से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए उपयोग किया जाता है, उनके tunable और cytocompatible गुणों की वजह से भाग में. इस प्रोटोकॉल में, हम thiol - ene कदम विकास photopolymerizations का उपयोग अग्नाशय MIN6 ख कोशिकाओं encapsulating के लिए खूंटी पेप्टाइड hydrogels बनाना. जैल 4 हाथ खूंटी norbornene (PEG4NB) macromer और एक पेप्टाइड काइमोट्रिप्सिन संवेदनशील crosslinker (CGGYC) द्वारा गठित किया गया. खूंटी की हाइड्रोफिलिक और गैर - दूषण प्रकृति सेल अस्तित्व और 3 डी में प्रसार के लिए एक cytocompatible microenvironment प्रदान करता है, जबकि काइमोट्रिप्सिन के प्रति संवेदनशील पेप्टाइड (अनुक्रम का उपयोग सी GGY ↓ सी, तीर एंजाइम दरार साइट को इंगित करता है, जबकि टर्मिनल पुटीEine अवशेषों thiol ene crosslinking के लिए जोड़ा गया था) सेल hydrogel भीतर बनाने constructs की तेजी से वसूली की अनुमति देता है. निम्नलिखित प्रोटोकॉल के लिए तकनीक बताते हैं: (1) thiol ene hydrogels में MIN6 β कोशिकाओं के इनकैप्सुलेशन, (2) गुणात्मक और मात्रात्मक सेल व्यवहार्यता assays सेल अस्तित्व और प्रसार का निर्धारण करने के लिए, (3) सेल spheroids की वसूली काइमोट्रिप्सिन की मध्यस्थता जेल का प्रयोग कटाव, और (4) बरामद spheroids की संरचनात्मक और कार्यात्मक विश्लेषण.
Introduction
Hydrogels मरम्मत और regenerating ऊतकों के लिए मचान सामग्री के रूप में असाधारण क्षमता के साथ हाइड्रोफिलिक Crosslinked पॉलिमर hydrogels के 1-3 उच्च पानी सामग्री ऑक्सीजन और पोषक तत्वों और सेलुलर चयापचय उत्पादों, जो सभी के सेल व्यवहार्यता को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण हैं के आदान - प्रदान के लिए आसान प्रसार परमिट. इसके अलावा, hydrogels नियंत्रित रिहाई और उनके उच्च tunability कारण सेल डिलीवरी के लिए उत्कृष्ट वाहक हैं पाली (ethylene glycol) (खूंटी) से तैयार उन लोगों के रूप में 2 सिंथेटिक hydrogels तेजी से ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में प्रयोग किया जाता है, बड़े पैमाने पर की वजह से उनके cytocompatibility, ऊतक तरह लोच, और शारीरिक और यांत्रिक गुणों की सामग्री में उच्च tunability 4-6.
आमतौर पर इस्तेमाल किया hydrogel मंच हालांकि, अध्ययन से पता चला है कि खूंटी (PEGDA) diacrylate hydrogels चेन विकास photopolymerizations द्वारा का गठन एक प्रवृत्ति को समझाया कोशिकाओं duri नुकसान पहुंचा हैएनजी नेटवर्क और स्वस्थानी सेल encapsulation में crosslinking 7 सेलुलर क्षति बड़े पैमाने जो PEGDA पर vinyl समूहों के माध्यम से crosslink hydrogels में बहुलक श्रृंखला के लिए प्रचार photoinitiator अणु, कट्टरपंथी उत्पन्न प्रजातियों के लिए जिम्मेदार ठहराया गया था. दुर्भाग्य से, इन कट्टरपंथी प्रजातियों को भी सेल encapsulation के दौरान तनाव और सेलुलर क्षति के कारण, 8-10 β कोशिकाओं अग्नाशय के रूप में कट्टरपंथी के प्रति संवेदनशील कोशिकाओं के लिए विशेष रूप से आदेश में बेहतर प्रसार और सेल अस्तित्व, उच्च आणविक भार PEGDA के लिए एक उच्च जाल आकार प्राप्त अक्सर सेल encapsulation के लिए इस्तेमाल किया जाता है. यह, हालांकि, polymerization कैनेटीक्स समझौता है और उप इष्टतम जेल biophysical गुण का कारण बनता है 7,11,12 ऊपर उल्लेख किया है नुकसान के अलावा, यह बहुत मुश्किल है PEGDA hydrogels से सेल संरचनाओं विविधता और गैर degradable की प्रकृति की वजह से ठीक करने के लिए. Crosslinked नेटवर्क. जबकि protease-संवेदनशील पेप्टाइड्स शामिल किया जा सकता हैखूंटी macromer अन्यथा निष्क्रिय PEGDA enzymatic दरार के प्रति संवेदनशील hydrogels रेंडर रीढ़ की हड्डी में विकार अक्सर महंगी अभिकर्मकों का उपयोग करता है और परिणामस्वरूप नेटवर्क अभी भी चेन विकास polymerization की प्रकृति के कारण विविधता के उच्च स्तर होते हैं 13-15.
हाल ही में, खूंटी पेप्टाइड कदम विकास photopolymerization thiol ene के माध्यम से गठित hydrogels hydrogels चेन विकास photopolymerization द्वारा का गठन से अधिक सेल encapsulation के लिए तरजीही गुण एक्ज़िबिट दिखाया गया है 7 thiol - ene hydrogels के बेहतर जमाना कैनेटीक्स 'पर क्लिक करने के लिए जिम्मेदार ठहराया है. 'thiol और ene functionalities के बीच प्रतिक्रिया की प्रकृति. चेन PEGDA polymerization के विकास की तुलना में, thiol ene प्रतिक्रिया कम ऑक्सीजन तेज जमाना दर में जो परिणाम है. हिचकते 16,17 thiol ene hydrogels भी उच्च polymerization दक्षता और बेहतर जेल श्रृंखला विकास PEGDA hydrogels, 7 की तुलना biophysical गुण है 18, </> समर्थन सीमित सेलुलर photopolymerization दौरान कट्टरपंथी प्रजातियों की वजह से नुकसान में जो परिणाम है.
इससे पहले, 4 हाथ खूंटी norbornene (PEG4NB के) macromer और बीआईएस सिस्टीन युक्त इस तरह के रूप में पेप्टाइड crosslinkers, thiol ene hydrogels द्वारा गठित protease-संवेदनशील पेप्टाइड्स सेल encapsulation के लिए उपयोग किया गया है. 7,18 खूंटी hydrogel नेटवर्क के उच्च tunability एक प्रदान करता है सेल अस्तित्व और गतिविधि की जांच करने के लिए लचीला और नियंत्रणीय 3D microenvironment, जबकि protease-संवेदनशील पेप्टाइड अनुक्रम का उपयोग सेल hydrogels के भीतर स्वाभाविक रूप से गठित constructs की वसूली के लिए एक हल्के तरीका प्रदान करता है. इस प्रोटोकॉल में हम कदम विकास photopolymerized hydrogels thiol ene 4 हाथ (PEG4NB) खूंटी norbornene और काइमोट्रिप्सिन β MIN6 - कोशिकाओं के encapsulation के लिए संवेदनशील पेप्टाइड crosslinker (CGGY ↓ सी) गढ़े का उपयोग का उपयोग. इस प्रोटोकॉल व्यवस्थित MIN6 के अस्तित्व के प्रसार, और उपगोल गठन का अध्ययन करने के लिए तकनीक बतातेthiol - ene hydrogels में β कोशिकाओं. हम आगे β सेल उपगोल वसूली और बरामद spheroids के जैविक लक्षण वर्णन के लिए विधि प्रदान करते हैं.
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Protocol
ए Macromer और पेप्टाइड संश्लेषण
- चार हाथ (PEG4NB) खूंटी norbornene और photoinitiator लिथियम arylphosphanate (एलएपी) स्थापित प्रोटोकॉल का उपयोग 18,19. Synthesize
- युक्त काइमोट्रिप्सिन के प्रति संवेदनशील पेप्टाइड बीआईएस सिस्टीन CGGY ↓ C (तीर काइमोट्रिप्सिन दरार साइट इंगित करता है) एक माइक्रोवेव पेप्टाइड सिंथेसाइज़र (CEM डिस्कवर एसपीएस) में मानक ठोस चरण पेप्टाइड संश्लेषण का उपयोग कर. Synthesize
- राल और संश्लेषण पैमाने के प्रतिस्थापन अनुपात की जरूरत पर आधारित राल (रिंक एमाइड MBHA राल) की राशि की गणना. (DMF) dimethylformamide में राल एक प्रतिक्रिया पोत (आर वी) में 15 मिनट के लिए अच्छी बात है.
- निकालें Fmoc राल से एक deprotection 20% piperidine और DMF में 0.1 एम HOBt युक्त समाधान का उपयोग समूह की रक्षा. माइक्रोवेव की सहायता Fmoc deprotection (सभी Fmoc-अमीनो एसिड के लिए) के लिए तालिका में नीचे सूचीबद्ध पैरामीटर का उपयोग करें:
संश्लेषण पैमाने 0.1 mmole 0.2 mmole बिजली 20 डब्ल्यू 50 डब्ल्यू तापमान 75 डिग्री सेल्सियस 75 डिग्री सेल्सियस समय 3 मिनट 3 मिनट - Deprotection बाद, DMF साथ राल कुल्ला और Ninhydrin परीक्षण प्रदर्शन Fmoc (एन टर्मिनल amine प्रदर्शन) के निकालने की पुष्टि की. राल नीले 2 मिनट के बाद 95 डिग्री सेल्सियस पर बारी चाहिए
- सफल deprotection, कुछ नीचे तालिका में सूचीबद्ध पैरामीटर के साथ एक उत्प्रेरक आधार समाधान में सी टर्मिनस (संश्लेषण से N-टर्मिनस सी चलता है) (DMF में 0.28 एम Diisopropylethylamine (DIEA)) में 1 Fmoc एमिनो एसिड के बाद .
संश्लेषण पैमाने 0.1 mmole 0.2 mmole बिजली 20 डब्ल्यू 50 डब्ल्यू तापमान * 75 डिग्री सेल्सियस 75 डिग्री सेल्सियस समय * 5 मिनट 5 मिनट
* पुटी और उनकी, 50 डिग्री सेल्सियस और 10 मिनट के लिए racemization कम उपयोग करें. - राल कुल्ला और Ninhydrin परीक्षण प्रदर्शन गुणात्मक युग्मन के पूरा (एन टर्मिनल amine लापता) की पुष्टि. राल 5 मिनट के बाद 95 में स्पष्ट होना चाहिए डिग्री सेल्सियस युग्मन कदम (A.2.d) दोहराएँ अगर Ninhydrin परीक्षण सकारात्मक परिणाम (नीले रंग) देता है.
- दोहराएँ (कदम A.2.b) deprotection और युग्मन अनुक्रम एक अंतिम deprotection कदम के साथ समाप्त में अतिरिक्त अमीनो एसिड के लिए (कदम A.2.d).
- आर.वी. नाली, 25 मिलीलीटर (डीसीएम) dichloromethane के साथ राल कुल्ला. इस कदम के लिए रवाना DMF, जो एक आधार है और पेप्टाइड दरार बाधा होगी कुल्ला है.
- 250 मीटर के मिश्रण से दरार कॉकटेल तैयार4.75 मिलीलीटर Trifluoroacetic एसिड (TFA), 0.125 मिलीग्राम (TIS) Triisopropylsilane और 0.125 मिलीग्राम DDH 2 ओ में phenol छ
- (पावर = 20 डब्ल्यू, = तापमान 38 डिग्री सेल्सियस) आर.वी. और फोड़ना में माइक्रोवेव पेप्टाइड सिंथेसाइज़र में 30 मिनट के लिए दरार समाधान जोड़ें.
- एक 50 मिलीलीटर अपकेंद्रित्र निर्वात कई गुना का उपयोग ट्यूब में पेप्टाइड समाधान ले लीजिए.
- पेंदी में बैठ जाना ईथर के 40 मिलीलीटर में cleaved पेप्टाइड, भंवर ट्यूब और 5 मिनट के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र पेप्टाइड इकट्ठा करने के लिए.
- तैरनेवाला नाली और कदम A.2.k दो बार दोहराना.
- लीजिए और निर्वात में पेप्टाइड सूखी.
- पेप्टाइड शुद्ध HPLC का उपयोग कर और यह मास स्पेक्ट्रोमेट्री के साथ चिह्नित.
बी सामग्री तैयार करना और बंध्याकरण
- पीबीएस, भंवर मिश्रण में 20% wt PEG4NB समाधान तैयार तक macromer पूरी तरह घुल, और macromer एक सिरिंज फिल्टर का उपयोग कर समाधान बाँझ बनाना. -20 डिग्री सेल्सियस (aliquots तैयार निष्फल समाधान स्टोरलंबी अवधि के भंडारण के लिए).
- तैयार है और 2% wt (एलएपी) पीबीएस में photoinitiator समाधान बाँझ. कमरे के तापमान पर प्रकाश से संरक्षित निष्फल समाधान स्टोर.
- पीबीएस में पेप्टाइड (CGGYC), भंवर मिश्रण और सिरिंज बंध्याकरण के लिए समाधान फ़िल्टर भंग. अशेष भाजक पेप्टाइड और -20 डिग्री सेल्सियस पर समाधान की दुकान तक (फ्रीज पिघलना चक्र को रोकने के लिए) का उपयोग करें.
- (एसएच) तैयार पेप्टाइड Ellman अभिकर्मक का उपयोग कर समाधान में एकाग्रता thiol (निर्माता की प्रोटोकॉल का पालन) का निर्धारण करते हैं. इस कदम को सही पेप्टाइड एकाग्रता दे (यानी, [एसएच] 2 /) कि पेप्टाइड thiol ene फोटो क्लिक प्रतिक्रियाओं में इस्तेमाल की जाने वाली राशि की गणना के लिए आवश्यक है.
- बाँझ 1 मिलीलीटर डिस्पोजेबल सीरिंज का उपयोग कर एक रेजर ब्लेड (जेल हटाने के लिए खुला सिरे) के शीर्ष भाग काट जमाना molds तैयार. आटोक्लेव द्वारा सिरिंज molds जीवाणुरहित.
- वांछित जेल (ene = 1 अनुपात thiol) तैयार करने और शेयर दोस्त की सांद्रता के आधार परrials, बहुलक, पेप्टाइड crosslinker, photoinitiator, और बफर आवश्यकता समाधान के लिए आवश्यक मात्रा की गणना.
सी. सेल तैयारी
- सेल संस्कृति मध्यम (100 यू / मिलीलीटर पेनिसिलिन, 100 स्ट्रेप्टोमाइसिन / ग्राम मिलीलीटर, 250 एनजी / एमएल Fungizone के साथ एंटीबायोटिक - कवकनाशी, उच्च ग्लूकोज DMEM 10% भ्रूण गोजातीय सीरम युक्त और 50 सुक्ष्ममापी β-mercaptoethanol) संतुलन में लाना, हांक संतुलित नमक समाधान ( HbSS, 2 Ca +, मिलीग्राम 2) मुक्त, और 37 के लिए ट्रिप्सिन-EDTA डिग्री सेल्सियस
- सीओ 2 इनक्यूबेटर से MIN6 β कोशिकाओं से युक्त बोतल निकालें और लामिना का प्रवाह हुड में बोतल जगह.
- बोतल से सेल संस्कृति मीडिया Aspirate और HbSS साथ सेल कुल्ला.
- 2X के 3 मिलीग्राम (0.1%) ट्रिप्सिन-EDTA का उपयोग कोशिकाओं Trypsinize और 37 में 4 मिनट के लिए बोतल सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- नोट: 2X trypsin समाधान एकल कक्ष निलंबन में MIN6 β कोशिकाओं का पूरा पृथक्करण की अनुमति देता है.
- ऊष्मायन के बाद, डाकू की सतह पर बोतल धीरे कोशिकाओं का दोहन करने के लिए पूरी तरह से अलग है. टुकड़ी और एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं की हदबंदी की पुष्टि.
- सेल संस्कृति के माध्यम के बराबर मात्रा जोड़ें के लिए trypsin बेअसर. समाधान कोमल pipetting द्वारा अच्छी तरह मिक्स, तो 1,000 rpm पर 5 मिनट के लिए एक विहित ट्यूब और अपकेंद्रित्र मिश्रण हस्तांतरण.
- तैरनेवाला Aspirate और धीरे 4 में कोशिकाओं को फिर से SUSPEND - संस्कृति मीडिया के 5 मिलीलीटर.
- सेल एक hemocytometer में 50% Trypan नीले बफर का उपयोग घनत्व का निर्धारण करते हैं.
डी. Hydrogel निर्माण और सेल इनकैप्सुलेशन
- एक बार कोशिकाओं को तैयार कर रहे हैं, मिश्रण (ene अनुपात एक 1:1 thiol पर आधारित) की आवश्यकता PEG4NB, CGGYC, गोद, सेल, समाधान और एक microcentrifuge ट्यूब में HbSS संस्करणों.
- मिक्स समाधान धीरे एक विंदुक का उपयोग करने के लिए एक सजातीय मिश्रण प्राप्त और जिसके परिणामस्वरूप एक सिरिंज मोल्ड करने के लिए समाधान के 25 μl जोड़ें. यूवी प्रकाश (365 करने के लिए सिरिंज का पर्दाफाशएनएम, 5 मेगावाट / 2 मिनट के लिए 2 सेमी).
- निम्न photopolymerization, एक बाँझ 24 अच्छी तरह से थाली वाले कक्ष संस्कृति के माध्यम में डुबकी जैल और 37 में hydrogels सेते हैं डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- 30 बंद शिथिल संलग्न कोशिकाओं कुल्ला मिनट और संयुक्त राष्ट्र Crosslinked macromers के लिए सेल सेल संस्कृति के माध्यम से लदी hydrogels धो लें. ताजा माध्यम में जैल स्थानांतरण.
- ताज़ा सेल संस्कृति मीडिया हर 2 से 3 दिनों के लिए.
ई. सेल व्यवहार्यता परख
एनकेप्सुलेटेड सेल आकारिकी प्रकाश माइक्रोस्कोप (बाद से संश्लेषित hydrogels पारदर्शी हैं) का उपयोग करते हुए देखा जा सकता है. सेल व्यवहार्यता और कल्पना की जा सकती गुणात्मक लाइव / मृत धुंधला हो जाना और मात्रात्मक AlamarBlue अभिकर्मक का उपयोग का उपयोग कर मापा.
E.1. लाइव / मृत धुंधला हो जाना
- कमरे के तापमान पर पिघलना के लाइव / मृत धुंधला हो अभिकर्मकों.
- एक विहित ट्यूब में नमूनों की संख्या (एन) के अनुसार पीबीएस जोड़ने के लिए दाग हो:
- पिपेट Calcein AM और पीबीएस के 1 मिलीग्राम प्रति विहित पीबीएस युक्त ट्यूब 2 EthD-1 के μl 0.25 μl. भंवर समाधान करने के लिए घटक मिश्रण.
- सेल से लदी hydrogels (0.5 मिलीग्राम / नमूना) लाइव / मृत धुंधला हो समाधान में एक कक्षीय हिलनेवाला पर कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए सेते हैं.
- एक पाश्चर विंदुक का प्रयोग, डाई समाधान निकालने और नमूना पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला.
- एक कवर पर्ची या कांच की स्लाइड पर नमूना रखें. निरीक्षण और छवि एक confocal खुर्दबीन का उपयोग कोशिकाओं.
E.2. AlamarBlue परख
- 10 वी / सेल संस्कृति माध्यम में ध्% AlamarBlue समाधान तैयार.
- इनक्यूबेटर से hydrogels निकालें और मीडिया aspirate hydrogel साथ किसी भी संपर्क बनाने के बिना एक अच्छी तरह से.
- 10% 16 घंटा के लिए AlamarBlue समाधान के 500 μl में सेल से लदी hydrogels और एक खाली अच्छी तरह से (नकारात्मक नियंत्रण) सेते हैं.
- ऊष्मायन के बाद, पिपेट 200 μlएक 96 अच्छी तरह से थाली और उपाय प्रतिदीप्ति एक microplate रीडर (: 560 एनएम, उत्सर्जन: 590 एनएम उत्तेजना) का उपयोग करने में AlamarBlue समाधान की.
- हायर सेलुलर चयापचय गतिविधि डाई उच्च प्रतिदीप्ति पढ़ने देना कम कर देता है.
- 10% के रूप में रिक्त स्थान Alamarblue समाधान के कम से कम दो कुओं को शामिल करने के लिए सुनिश्चित. जब डेटा का विश्लेषण, नमूने प्रतिदीप्ति पढ़ने से औसत रिक्त प्रतिदीप्ति मूल्य घटाना.
एफ काइमोट्रिप्सिन जेल कटाव और उपगोल रिकवरी मध्यस्थता
- 1 / ट्रिप्सिन मुक्त HBBS और बाँझ फिल्टर समाधान में समाधान α काइमोट्रिप्सिन मिलीग्राम मिलीग्राम तैयार.
- कोमल झटकों के साथ कमरे के तापमान के में काइमोट्रिप्सिन समाधान में hydrogels (प्रत्येक जेल के लिए 500 μl) सेते तक पूरा जेल कटाव हासिल की है.
- एक 25 μl जेल के लिए, पूरी कटाव के लिए समय लगभग 5 मिनट है.
- की गतिविधि को कम करने के लिए कुछ मिनट के लिए बर्फ पर प्लेट रखेंकाइमोट्रिप्सिन.
- 2 मिनट के लिए स्थानांतरण सेल समाधान 1 मिलीलीटर ट्यूब और अपकेंद्रित्र में rpm 300, 4 डिग्री सेल्सियस.
- सावधानी से एक चराई विंदुक का उपयोग तैरनेवाला हटाने और धीरे HbSS में spheroids resuspend.
- बरामद एक 24-अच्छी तरह से थाली उपगोल समाधान स्थानांतरण और बर्फ पर थाली जगह spheroids बसने की अनुमति है.
- आकार विश्लेषण के लिए, चरण बसे एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग spheroids के विपरीत छवियों को प्राप्त. उपाय उपगोल Nikon तत्व सॉफ्टवेयर या ImageJ के रूप में इस तरह के सॉफ्टवेयर का उपयोग कर diameters बरामद किए.
जी बरामद spheroids कार्यात्मक परख
G.1. उत्तेजित ग्लूकोज बरामद सेल spheroids से इंसुलिन स्राव
- एक 24 अच्छी तरह से थाली में, 2 मिमी कम ग्लूकोज Kerbs घंटी 1 घंटा के लिए बफर (KRb) के 500 μl में जैल सेते हैं.
- जेल इरोड और सेल F.6 F.1 चरणों का उपयोग spheroids ठीक.
- किसी भी बनाने के बिना तैरनेवाला ध्यान Aspirateसेल spheroids के साथ संपर्क और 2 मिमी कम ग्लूकोज KRb के 500 μl में spheroids resuspend.
- एक 0.6 मिलीलीटर ट्यूब के लिए सेल spheroids समाधान के 100 μl स्थानांतरण और बर्फ पर यह intracellular एटीपी मात्रा का ठहराव के लिए जगह है.
- शेष आधे में सेल उपगोल समाधान (दो microcentrifuge ट्यूब में) विभाजित rpm 300 और 4 पर 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र डिग्री सेल्सियस
- Aspirate (लगभग नीचे करने के लिए) तैरनेवाला और 25 मिमी उच्च ग्लूकोज और 2 मिमी कम ग्लूकोज KRb के 1 मिलीलीटर में दूसरी छमाही KRb के 1 मिलीलीटर में सेल spheroids की पहली छमाही resuspend.
- धीरे विंदुक और एक 24-अच्छी तरह से थाली बरामद सेल spheroids युक्त समाधान हस्तांतरण. 37 में 1 घंटे के लिए थाली सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2.
- ऊष्मायन के बाद, 1000 rpm पर 2 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए एक microcentrifuge ट्यूब और अपकेंद्रित्र स्थानांतरण समाधान
- 4 में एक और microcentrifuge ट्यूब की दुकान और डिग्री सेल्सियस Centrifuged ट्यूब से इंसुलिन के लिए सतह पर तैरनेवाला के 500 μl स्थानांतरणएलिसा.
- इंसुलिन एलिसा निम्नलिखित निर्माता प्रोटोकॉल प्रदर्शन.
G.2. CellTiter Glo परख
- मानकों एटीपी: एक 10 सुक्ष्ममापी एटीपी समाधान तैयार है और धारावाहिक dilutions प्रदर्शन 8 मानक समाधान की एक श्रृंखला प्राप्त.
- एक सफेद 96 अच्छी तरह से थाली, सेल उपगोल समाधान के 50 μl (G.1.6 कदम से) और मानकों को जोड़ने.
- प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त नमूने और मानकों, CellTiter Glo अभिकर्मक के 50 μl जोड़ने और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते हैं.
- निम्न ऊष्मायन, उपाय एक microplate पाठक और जांचना नमूना एटीपी एक रेखीय प्रतिगमन एटीपी मानकों के द्वारा उत्पन्न वक्र का उपयोग सांद्रता का उपयोग कर नमूने और मानकों की luminescence गिनती.
- नमूने में कुल एटीपी एकाग्रता का निर्धारण और मन्दन नमूना कारक से गुणा करने के लिए एक hydrogel सेल से लदी में intracellular एटीपी एकाग्रता प्राप्त.
G.3. इंसुलिन का स्राव निर्धारित
- Amou की गणनाNT के इंसुलिन के उच्च ग्लूकोज मध्यम में इंसुलिन की मात्रा कम ग्लूकोज मध्यम में secreted secreted इंसुलिन की मात्रा के अनुपात लेने के द्वारा बरामद spheroids से secreted.
- बरामद सेल spheroids के intracellular एटीपी के संबंधित राशि के साथ इंसुलिन सामग्री सेल spheroids की मात्रा निर्धारित मानक के अनुसार.
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Representative Results
Encapsulation, अस्तित्व, प्रसार, उपगोल गठन, और thiol - ene hydrogels में उपगोल वसूली के लिए 1-4 शो प्रतिनिधि परिणाम आंकड़े चित्रा 1 (1) कदम विकास thiol ene का उपयोग कर PEG4NB और CGGYC photopolymerization की प्रतिक्रिया योजनाबद्ध से पता चलता है, और ( ) 2 काइमोट्रिप्सिन मध्यस्थता जेल कटाव है जो एक सतह कटाव तंत्र के बाद 2 आंकड़े और 3 वर्तमान व्यवहार्यता परिणाम लाइव / मृत धुंधला हो और AlamarBlue परख का उपयोग कर प्राप्त की. हम कि कम घनत्व पैकिंग सेल भी PEG4NB CGGYC hydrogels में proliferated कोशिकाओं का पालन, thiol ene hydrogel प्रणाली की cytocompatibilty संकेत 4 समझाया और बरामद β सेल spheroids शो चरण विपरीत छवियों, चित्रा, के रूप में के रूप में अच्छी तरह के आकार के वितरण. β - सेल spheroids बरामद किए.
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चित्रा 1 कदम विकास के योजनाबद्ध. Thiol ene फोटो क्लिक प्रतिक्रिया PEG4NB और CGGYC का उपयोग करने के लिए खूंटी - पेप्टाइड संयुग्म फार्म. Hydrogels काइमोट्रिप्सिन उपचार द्वारा तेजी से घिस कर सकते हैं.
चित्रा 2 प्रारंभिक व्यवहार्यता और सेल उपगोल PEG4NB/CGGYC hydrogels में गठित. (क) लाइव / मृत धुंधला हो जाना तुरंत तस्वीर encapsulation निम्नलिखित प्रदर्शन किया गया था. (ख) लाइव / मृत धुंधला हो जाना इन विट्रो संस्कृति में 10 दिनों के प्रदर्शन के बाद. प्रतिनिधि confocal z MIN6 β कोशिकाओं के ढेर छवियों 4wt% PEG4NB/CGGYC hydrogels (2 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल, पैमाने = 100 सुक्ष्ममापी) में समझाया. सेल व्यवहार्यता कुल (हरी लाल) कोशिका गिनती पर रहते हैं (हरा) कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में परिभाषित किया गया था. (2 × 10 6 कोशिकाओं / एमएल, एन = 4, ± एसडी मतलब है).
चित्रा 3. MIN6 β कोशिकाओं के चयापचय गतिविधि AlamarBlue अभिकर्मक (एन = 3, ± एसडी मतलब) द्वारा समय के एक समारोह के रूप में मापा जाता है. MIN6 β 3wt% में समझाया कोशिकाओं, 4wt% और 2 में 5wt% PEG4NB/CGGYC hydrogels × 10 6 कोशिकाओं / एमएल.
चित्रा 4 बरामद MIN6 β सेल spheroids की विशेषता. सेल spheroids PEG4NB/CGGYC इन विट्रो संस्कृति में 10 दिनों के बाद 40 सुक्ष्ममापी काइमोट्रिप्सिन का उपयोग करने से बरामद किए गए. (क) समझाया β सेल spheroids के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि. (ख) बरामद β सेल spheroids के प्रतिनिधि चरण विपरीत छवि. (ग) वितरण ओके उपगोल च (सेल घनत्व = 1 × 7 कोशिकाओं 10 / एमएल) diameters.
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Discussion
वर्णित प्रोटोकॉल thiol ene कदम विकास photopolymerization द्वारा गठित hydrogels में कोशिकाओं की आसान encapsulation पर विवरण प्रस्तुत करता है. जबकि norbornene के 1:1 के एक stoichiometric thiol कार्य समूहों अनुपात इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया गया था, अनुपात प्रयोगों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है. एक सही तैयार करने के अलावा, यह पूर्व बहुलक समाधान में एकरूपता बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है. विशेष रूप से, कोमल pipetting का उपयोग करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं को अच्छी तरह से पूर्व बहुलक समाधान में वितरित कर रहे हैं क्रम में सेल और जेल गुणों में भिन्नता के clumping से बचने. हालांकि 2 मिनट के polymerization समय जेल crosslinking के लिए इस्तेमाल किया गया था, thiol ene hydrogels के लिए जेल बिंदु सबसे सेल encapsulation प्रासंगिक योगों (जैसे में कम से कम 10 सेकंड है, 4% wt PEG4NB/CGGYC hydrogel के लिए जेल बिंदु 7 ± 2 सेकंड और 5 wt% 6 ± 1 सेकंड) है. इस hydrogel प्रणाली के तेजी से जमाना तेजी से जगह में कोशिकाओं ताले, जिसके परिणामस्वरूप बेहतर cel3 डी में एल वितरण अन्य photopolymerization योजनाओं है कि मिनट या घंटे लेने के लिए जेल के बिंदु तक पहुँचने की तुलना में 7,20.
इसके अतिरिक्त, β सेल स्वाभाविक रूप से thiol ene hydrogels में गठन spheroids काइमोट्रिप्सिन की मध्यस्थता जेल कटाव से बरामद किए गए. काइमोट्रिप्सिन, तथापि, trypsin परिवार और उच्च एकाग्रता या इस एंजाइम की लंबी ऊष्मायन समय में एक एंजाइम है नकारात्मक सेल सेल बातचीत को प्रभावित कर सकते हैं या भी वसूली के दौरान उपगोल वास्तुकला को बाधित. आदेश में इस संभावित सीमा से बचने के लिए, hydrogels अन्य thiolated substrates द्वारा Crosslinked किया जा सकता है और जेल कटाव अभी भी उपयुक्त एंजाइमों कि प्रतिकूल बातचीत सेल सेल का कारण नहीं है के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है.
कुल मिलाकर, thiol ene hydrogels 3 डी में β कोशिकाओं के प्रसार को बढ़ावा देने के लिए एक cytocompatible वातावरण प्रदान करते हैं. इस प्रणाली को संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और 3 डी में विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं के शारीरिक व्यवहार का अध्ययन. इसके अलावा,इस प्रणाली सेल आगे कार्यात्मक और जैविक characterizations के लिए hydrogel मैट्रिक्स के भीतर गठित संरचनाओं के सतही वसूली के लिए अनुमति देता है. यह विविध और cytocompatible hydrogel प्रणाली इंजीनियरिंग पुनर्योजी दवा आवेदन के लिए जटिल 3D ऊतकों के लिए जेल मंच प्रदान करता है.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस परियोजना (R21EB013717) NIH और IUPUI OVCR (RSFG) द्वारा वित्त पोषित किया गया था. लेखक उसे तकनीकी सहायता के लिए सुश्री हान Shih धन्यवाद.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4-arm PEG (20kDa) | Jenkem Technology USA | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-amino acids | Anaspec | ||
| Live/Dead cell viability kit | Invitrogen | L3224 | Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1 |
| AlamarBlue reagent | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reagent | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | Without Ca+2 and Mg+2 |
| High Glucose DMEM | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Trypsin-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Trypsin-free α-chymotrypsin | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Mouse Inusin ELISA kit | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml disposable syringe | BD biosciences |
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