Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler

doi: 10.3791/50081 Published: December 6, 2012

Summary

Følgende protokoll gir teknikker for innkapsling bukspyttkjertelen β-celler i trinn-vekst PEG-peptid hydrogeler dannet ved tiol-ENE foto-klikk reaksjoner. Dette materialet plattformen tilbyr ikke bare en cytocompatible mikromiljøet for celle innkapsling, men også tillater brukerstyrt rask gjenoppretting av cellestrukturer dannet innenfor hydrogeler.

Abstract

Hydrogeler er hydrofile tverrbundne polymerer som gir et tredimensjonalt mikromiljø med vev-lignende elastisitet og høy permeabilitet for dyrking terapeutisk relevante celler eller vev. Hydrogeler fremstilt fra poly (etylenglykol) (PEG) derivater blir stadig mer brukt for en rekke tissue engineering applikasjoner, blant annet på grunn av deres tunbare og cytocompatible egenskaper. I denne protokollen, benyttet vi tiol-ene step-vekst photopolymerizations å dikte PEG-peptid hydrogeler for innkapsling bukspyttkjertelen MIN6 b-celler. Gelene ble dannet av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og en chymotrypsin-følsom peptid tverrbinder (CGGYC). Den hydrofile og ikke-begroing natur PEG tilbyr cytocompatible mikromiljø for celleoverlevelse og proliferasjon i 3D, mens bruk av kymotrypsin-sensitive peptidsekvens (C GGY ↓ C, indikerer arrow enzymet spaltningssete, mens terminal cysteeine rester ble addert for tiol-en tverrbinding) tillater hurtig gjenoppretting av celle konstruerer dannet innen hydrogel. Følgende protokoll utdyper teknikker for: (1) Innkapsling av MIN6 β-celler i tiol-ene hydrogeler, (2) Kvalitative og kvantitative celleviabilitet analyser for å bestemme celleoverlevelse og proliferasjon, (3) Utvinning av celle sfæroider hjelp kymotrypsin-mediert gel erosjon, og (4) Strukturell og funksjonell analyse av innhentede sfæroider.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hydrogeler er hydrofile tverrbundne polymerer med eksepsjonell potensial som stillas materialer for reparasjon og regenererende vev. 1-3 Det høye vanninnhold hydrogeler tillater enkel diffusjon av oksygen og utveksling av næringsstoffer og cellulære metabolske produkter, som alle er viktige for å opprettholde cellelevedyktighet. I tillegg, hydrogeler er utmerkede bærere for kontrollert frigjøring og celle produksjonstid grunn deres høye tunability. 2 Syntetiske hydrogeler slik som de fremstilt fra poly (etylenglykol) (PEG) blir stadig mer brukt i tissue tekniske anvendelser, hovedsakelig på grunn cytocompatibility deres vev- liker elastisitet og høy tunability i materiale fysiske og mekaniske egenskaper. 4-6

Selv om en vanlig brukt hydrogel plattform, har studier vist at PEG diacrylate (PEGDA) hydrogeler dannet ved kjede-vekst photopolymerizations har en tendens til å skade innkapslede celler during nettverk kryssbinding og in situ celle innkapsling. 7 celleskader ble i stor grad tilskrives radikale arter som genereres av Fotoinitiatoren molekyler, som forplanter seg gjennom vinylgrupper på PEGDA til kryssbindingsfordelingen polymerkjeder inn hydrogeler. Dessverre er disse radikale arter også forårsake spenninger og cellulær skade under celle innkapsling, spesielt for radikal-sensitive celler, såsom bukspyttkjertelen β-celler. 8-10 For å oppnå en høyere maskevidde for bedre diffusjon og celleoverlevelse, høyere molekylvekter PEGDA brukes ofte for celle innkapsling. Dette imidlertid kompromisser polymerisasjons kinetikk og forårsaker suboptimale gel biofysiske egenskaper. 7,11,12 I tillegg til de ovenfor nevnte ulemper, er det svært vanskelig å gjenopprette cellestrukturer fra PEGDA hydrogeler grunnet heterogenitet og ikke nedbrytbart natur de tverrbundede nettverk. Mens protease-sensitive peptider kan inkorporeresinn PEG makromer ryggrad til å gjengi de ellers inerte PEGDA hydrogeler følsomme for enzymatisk spalting, bruker konjugering ofte dyre reagenser og de ​​resulterende nettverk som fremdeles inneholder høy grad av heterogenitet på grunn av beskaffenheten av kjetting-vekst polymerisasjon. 13-15

Nylig har PEG-peptid hydrogeler dannet via step-vekst tiol-ene fotopolymerisasjon vist seg å utvise fortrinnsrett egenskaper for celle innkapsling i hydrogeler dannet av kjede-vekst fotopolymerisasjon. 7 Den overlegne gelering kinetikk tiol-ene hydrogeler er knyttet til "klikk 'natur av reaksjon mellom tiol og ENE funksjonalitet. Sammenlignet med kjede-vekst polymerisasjon av PEGDA er tiol-ene reaksjonen mindre oksygen hemmet som resulterer i raskere gelering rate. 16,17 tiol-ene hydrogeler har også høyere polymerisasjon effektivitet og bedre gel biofysiske egenskaper sammenlignet med kjede-vekst PEGDA hydrogeler, 7 , 18 </ Sup>, som resulterer i begrenset celleskader forårsaket av radikale arter under fotopolymerisasjon.

Tidligere, tiol-ENE hydrogeler dannet av 4-arm PEG-norbornen (PEG4NB) makromer og bis-cysteine ​​inneholdende peptid tverrbindingsmidler, for eksempel protease-sensitive peptider er blitt benyttet for celle innkapsling. 7,18 Høy tunability av PEG hydrogel nettverk tilbyr fleksibel og kontrollerbar 3D mikromiljø for undersøkelse celleoverlevelse og aktivitet, mens bruk av protease-sensitive peptidsekvens gir en mild måte for gjenvinning av celle konstruerer dannet naturlig innenfor hydrogeler. I denne protokollen benytter vi trinn-vekst photopolymerized tiol-ene hydrogeler fremstille bruker 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) og en chymotrypsin-sensitive peptid tverrbinder (CGGY ↓ C) for innkapsling av MIN6 β-celler. Denne protokollen utdyper systematisk teknikker for å studere overlevelse, spredning og spheroid dannelse av MIN6β-celler i tiol-ene hydrogeler. Vi videre gi metode for β-celle spheroid utvinning og biologisk karakterisering av gjenvunne sfæroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

A. makromer og peptidsyntese

  1. Syntetisere 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) og fotoinitiator Lithium arylphosphanate (LAP) ved hjelp av etablerte protokoller. 18,19
  2. Syntetisere bis-cystein inneholdende kymotrypsin-sensitive peptid CGGY ↓ C (pil indikerer kymotrypsin spaltningssete) ved hjelp av standard fastfasepeptidsyntese i en mikrobølgeovn peptid synthesizer (CEM Discover SPS).
    1. Beregne mengden av harpiks (Rink-amid MBHA harpiks) behov basert på substitusjon forholdet mellom harpiks og syntesen skala. Svelle harpiksen i dimetylformamid (DMF) i en reaksjonsbeholder (RV) for 15 min.
    2. Fjern Fmoc-beskyttende gruppe fra harpiksen ved hjelp av en avbeskyttelse løsning inneholdende 20% piperidin og 0,1 M HOBt i DMF. Bruk parametrene oppført i tabellen nedenfor for mikrobølgeovn-assistert Fmoc-avbeskyttelse (for alle Fmoc-aminosyrer):
      Syntese skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Makt 20 W 50 W
      Temperatur 75 ° C 75 ° C
      Tid 3 min 3 min
    3. Etter avbeskyttelse, skyll harpiksen med DMF og utfør Ninhydrin test for å bekrefte fjerningen av Fmoc (eksponering av N-terminale amin). Harpiks bør bli blått etter 2 minutter ved 95 ° C.
    4. Etter vellykket avbeskyttelse, par første Fmoc-aminosyren i C-terminus (syntese går fra C-til N-terminus) i en aktivator baseløsning (0.28 M Diisopropyletylamin (DIEA) i DMF) med parametrene som er oppført i tabellen nedenfor .
      Syntese skala 0,1 mmol 0,2 mmol
      Makt 20 W 50 W
      Temperatur * 75 ° C 75 ° C
      Tid * 5 min 5 min

      * For Cyste og hans bruk 50 ° C og 10 min å redusere racemization.
    5. Skyll harpiksen og utfør Ninhydrin test for å kvalitativt bekrefte ferdigstillelse av koblingen (forsvinning av N-terminale amin). Harpiks skal være klar etter 5 min ved 95 ° C. Gjenta kopling trinn (A.2.d) hvis Ninhydrin test returnerer positivt resultat (blå farge).
    6. Gjenta avbeskyttelse (trinn A.2.b) og koblingen (trinn A.2.d) for ytterligere aminosyrer i sekvensen slutter med en endelig avbeskyttelse trinn.
    7. Drain RV, skyll harpiks med 25 ml diklormetan (DCM). Dette trinnet er å skylle av DMF, som er en base, og vil hindre peptid spaltning.
    8. Forbered cleavage cocktail ved å blande 250 mg fenol i 4,75 ml trifluoreddiksyre (TFA), 0,125 ml Triisopropylsilane (TIS) og 0,125 ml DDH 2 O.
    9. Legg cleavage løsning i RV og Cleave i 30 min i mikrobølgeovn peptid synthesizer (Power = 20 W; Temperatur = 38 ° C).
    10. Samle peptidet løsningen i en 50 ml sentrifugerør med vakuummanifold.
    11. Bunnfall kløyvde peptid i 40 ml eter, vortex røret og sentrifuger ved 3000 rpm i 5 min for å samle peptidet.
    12. Renne supernatanten og gjenta trinn A.2.k to ganger.
    13. Utlevering og tørk peptidet i vakuum.
    14. Rense peptidet ved bruk av HPLC og karakterisere det med massespektrometri.

B. Materiale Forberedelse og sterilisering

  1. Forbered 20 vekt% løsning i PBS PEG4NB, vortex blandingen inntil den makromer oppløses fullstendig, og sterilisere makromer løsning ved hjelp av en sprøyte-filter. Oppbevar sterilisert løsning på -20 ° C (forberede alikvoterfor langsiktig lagring).
  2. Forbered og steriliser 2 vekt% fotoinitiator (LAP) oppløsning i PBS. Oppbevar steriliseres oppløsningen ved romtemperatur beskyttet mot lys.
  3. Oppløs peptidet (CGGYC) i PBS, vortex blandingen og sprøyten filtrer løsningen for sterilisering. Delmengde peptid løsning og oppbevar ved -20 ° C til bruk (forhindre fryse-tine sykluser).
  4. Bestem tiol (-SH) konsentrasjonen i forberedt peptid løsning ved hjelp Ellman reagens (følg produsentens protokoll). Dette trinnet vil gi nøyaktig peptid konsentrasjon (dvs. [SH] / 2) som er nødvendig for beregning av peptid beløp som skal brukes i tiol-ENE blide klikk reaksjoner.
  5. Forbered gelering muggsopp ved å kutte den øverste delen av av sterile 1 ml engangssprøyter med en barberblad (åpen tips for gel fjerning). Sterilisere sprøyten former, ved autoklav.
  6. Basert på ønsket gelformulering (tiol til ENE ratio = 1) og konsentrasjoner av lager materijaler, beregne det nødvendige volumet av polymer, peptid tverrbinder, fotoinitiator og bufferløsninger kreves.

C. celleforberedelsen

  1. Equilibrate cellekulturmedium (høy glukose DMEM inneholdende 10% føtalt bovint serum; Antibiotikaassosiert antimycotic med 100 U / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin, 250 ng / ml Fungizone, og 50 uM β-merkaptoetanol), Hanks balanserte saltløsning ( HBSS, 2 Ca +, Mg 2 + fri), og trypsin-EDTA til 37 ° C.
  2. Fjern kolber inneholdende MIN6 β-celler fra CO 2 inkubator og legg flaskene i laminær strømning hette.
  3. Aspirer cellekulturmedier fra kolbene og skyll cellen med HBSS.
  4. Trypsinize cellene ved hjelp av 3 ml av 2X (0,1%) Trypsin-EDTA og inkuber kolbene i 4 minutter ved 37 ° C og 5% CO 2.
    • Merk: Bruk 2X trypsin løsning gir full dissosiasjon av MIN6 β-celler i én celle suspensjon.
    </ Li>
  5. Etter inkubering, pek kolbene på overflaten av hetten forsiktig å fullstendig løsne cellene. Bekreft løsgjøring og dissosiasjon av cellene ved hjelp av et mikroskop.
  6. Legg likt volum cellekulturmedium å nøytralisere trypsin. Bland løsningen godt ved forsiktig pipettering, og deretter overføre blandingen til en kanonisk rør og sentrifuger i 5 minutter ved 1000 rpm.
  7. Aspirer supernatanten og forsiktig resuspendere cellene i 4-5 ml av kulturmedium.
  8. Bestem celletetthet anvendelse av 50% Trypan blå buffer i en hemocytometer.

D. Hydrogel Fabrikasjon og Cell Innkapsling

  1. Når cellene er klare, blanding (basert på en 1:1 tiol til ene ratio) de nødvendige volumer av PEG4NB, CGGYC, LAP celleløsning og HBSS i en mikrosentrifugerør.
  2. Bland oppløsningen forsiktig med en pipette for å oppnå en homogen blanding og tilsett 25 pl av den resulterende løsning til en sprøyte mold. Utsett sprøyten for UV-lys (365nm, 5 mW / cm 2) i 2 min.
  3. Etter fotopolymerisasjon, stupe geler til en steril 24-brønners plate som inneholder cellekulturmedium og inkuber hydrogeler i 37 ° C og 5% CO 2.
  4. Vask celle-Laden hydrogeler i cellekultur medium for 30 min å skylle av løst tilknyttede celler og un-tverrbundede macromers. Overfør gels i frisk medium.
  5. Refresh cellekulturmedier hver 2 til 3 dager.

E. celleviabilitet Assay

Encapsulated cellemorfologi kan observeres ved hjelp av lys mikroskop (siden de syntetiserte hydrogeler er gjennomsiktig). Celleviabilitet kan visualiseres og måles kvalitativt bruke Live / Død flekker og kvantitativt med AlamarBlue reagens.

E.1. Live / død farging

  1. Tine Levende / død flekker reagenser ved romtemperatur.
  2. I en kanonisk rør legger PBS ifølge antall prøver (n) for å være farget:
    Totalt volum av PBS = n × 500 ul
  3. Pipetter 0,25 ul Calcein AM og 2 pl EthD-1 per 1 ml PBS til den kanoniske røret inneholder PBS. Vortex løsningen å blande komponentene.
  4. Inkuber celle-laden hydrogeler i Live / døde farging løsning (0,5 ml / prøve) i 1 time ved romtemperatur på en orbital rister.
  5. Ved hjelp av en Pasteur-pipette, fjern fargeløsning og skyll prøven to ganger med PBS.
  6. Plasser prøven på en dekkglass eller glass lysbilde. Observere og bildet celler ved hjelp av en confocal mikroskop.

E.2. AlamarBlue Assay

  1. Forbered 10 v / v% AlamarBlue løsning i cellekultur medium.
  2. Fjern hydrogeler fra inkubator og aspirere mediet ut av hver brønn uten å gjøre noen kontakt med hydrogel.
  3. Inkuber celle-laden hydrogeler og en tom brønn (negativ kontroll) i 500 ul av 10% AlamarBlue løsning i 16 timer.
  4. Etter inkubering, pipette 200 plav AlamarBlue løsning i en 96 brønns plate og måle fluorescens ved hjelp av en mikroplateleser (eksitasjon: 560 nm, emisjon: 590 nm).
    • Høyere cellulær metabolsk aktivitet reduserer fargestoff til å gi høyere fluorescens lesing.
    • Sørg for å inkludere minst to brønner på 10% Alamarblue løsning som blanks. Når du analyserer data, trekke den gjennomsnittlige blank fluorescens verdi fra fluorescens lesing av prøvene.

F. Chymotrypsin mediert Gel Erosjon og Spheroid Recovery

  1. Forbered 1 mg / ml trypsin-fri α-kymotrypsin løsning HBBS og sterilt filtrer løsningen.
  2. Inkuber hydrogeler i kymotrypsin løsning (500 ul for hver gel) ved romtemperatur med forsiktig risting inntil komplett gel erosjon er oppnådd.
    • For en 25 pl gel, er tiden for fullstendig erosjon ca 5 min.
  3. Sett platen på is i noen minutter for å redusere aktiviteten avchymotrypsin.
  4. Overfør celleløsning i 1 ml rør og sentrifuger ved 300 rpm, 4 ° C i 2 min.
  5. Fjern forsiktig supernatanten ved hjelp av en beite pipette og forsiktig Resuspender sfæroider i HBSS.
  6. Overfør den gjenopprettede sfæroide løsningen til en 24-brønns plate og plasser platen på isen å tillate sfæroider å slå seg ned.
  7. For størrelse analyse, erverve fasekontrast bilder av avgjort sfæroider hjelp et lysmikroskop. Mål utvinnes sfæroide diameter ved hjelp av programvare som Nikon Element programvare eller ImageJ.

G. Funksjonell Assay av returpapir sfæroider

G.1. Glukose stimulert insulin sekresjon fra den gjenopprettede celle sfæroider

  1. I en 24 brønns plate, inkuber gelene i 500 ul av 2 mm lav glukose Kerbs-Ringer buffer (KRB) i 1 time.
  2. Erodere gel og gjenopprette celle sfæroider bruker trinn F.1 til F.6.
  3. Aspirer supernatanten forsiktig uten å gjøre noekontakt med cellen sfæroider og Resuspender sfæroider i 500 ul av 2 mm lav glukose KRB.
  4. Overfør 100 ul celle sfæroider løsning på et 0,6 ml tube og plassere den på is for intracellulær ATP kvantifisering.
  5. Deler den gjenværende celle sfæroide løsning i halvparten (i to mikrosentrifugerør) og sentrifuger i 2 min ved 300 rpm og 4 ° C.
  6. Aspirat supernatant (nesten til bunnen) og resuspender første halvdel av cellen sfæroider i 1 ml 25 mM høy glukose KRB og andre halvparten i 1 ml 2 mM lav glukose KRB.
  7. Forsiktig pipettere og overføre oppløsningen inneholdende gjenopprettede celle sfæroider til en 24-brønns plate. Inkuber platen i 1 time ved 37 ° C og 5% CO 2.
  8. Etter inkubering, overføres løsningen til en mikrosentrifugerør og sentrifuger i 2 min ved 1000 rpm og 4 ° C.
  9. Overfør 500 ul av supernatanten fra den sentrifugerte røret til en annen mikrosentrifugerør og oppbevar ved 4 ° C for insulinELISA.
  10. Utfør insulin ELISA følgende produsentens protokoll.

G.2. CellTiter Glo Assay

  1. ATP standarder: Forbered et 10 uM ATP-løsning og utføre serielle fortynninger for å få en serie av 8 standardløsninger.
  2. Til en hvit 96 brønn plate, tilsett 50 pl av celle sfæroide løsning (fra trinn G.1.6) og standarder.
  3. Til hver brønn inneholder prøver og standarder, tilsett 50 ul CellTiter Glo reagens og inkuber ved romtemperatur i 15 min.
  4. Etter inkubasjon, måle luminescence greven av prøvene og standarder ved hjelp av en mikroplateleser og kalibrere sample ATP konsentrasjoner ved hjelp av en lineær regresjon kurve generert av ATP-standarder.
  5. Fastslå den totale ATP konsentrasjon i prøven og multiplisere med prøvefortynning faktor for å få den intracellulære ATP konsentrasjon i en celle-laden hydrogel.

G.3. Bestem insulinutskillelse

  1. Beregn Amount av insulin utskilt fra de gjenvunne sfæroider ved å ta forholdet av mengden av insulin skilles i høy glukose medium til mengde insulin utskilt i lav glukose medium.
  2. Normalisere kvantifisert insulin innholdet i celle sfæroider med respektive mengde intracellulær ATP av innhentede celle sfæroider.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Figurene 1-4 viser representative resultater for innkapsling, overlevelse, spredning, sfæroide formasjon, og sfæroide utvinning i tiol-ENE hydrogeler. Figur 1 viser reaksjonen skjematisk av (1) trinn-vekst tiol-en fotopolymerisasjon hjelp PEG4NB og CGGYC, og ( 2) kymotrypsin mediert gel erosjon som følger en overflate erosjon mekanisme. Fig. 2 og 3 stede levedyktighet resultater oppnådd ved anvendelse av Sanntids / døde flekker og AlamarBlue assay. Vi observerer at cellene proliferated i PEG4NB-CGGYC hydrogeler selv ved lav celle pakketetthet, indikerer cytocompatibilty av tiol-en hydrogel-systemet. Fig. 4 viser fasekontrast bilder av innkapslet og utvinnes β-celle sfæroider, samt størrelsen fordelingen av gjenvunnet β-celle sfæroider.

_upload/50081/50081fig1highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/50081/50081fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk av trinn-vekst tiol-ene foto-klikk reaksjon med PEG4NB og CGGYC å danne PEG-peptid konjugat. Hydrogeler kan bli erodert raskt ved chymotrypsin behandling.

Figur 2
Figur 2. Første levedyktighet og celle spheroid dannet i PEG4NB/CGGYC hydrogeler. (A) Live / Død farging ble utført umiddelbart etter foto-innkapsling. (B) Live / Død farging utføres etter 10 dager med in vitro kultur. Representative confocal z-stack bilder av MIN6 β-celler innkapslet i 4wt% PEG4NB/CGGYC hydrogeler (2 × 10 6 celler / ml, skala = 100 mikrometer). Celleviabilitet ble definert som prosentandelen av levende (grønn) celler over hele cellen (grønn + rød) teller. (2 x 10 6 celler / ml, N = 4, gjennomsnitt ± SD).

Figur 3
Figur 3. Metabolsk aktivitet MIN6 β-celler målt som en funksjon av tid ved AlamarBlue reagens (N = 3, gjennomsnitt ± SD). MIN6 β-celler innkapslet i 3wt%, 4wt% og 5wt% PEG4NB/CGGYC hydrogeler på 2 × 10 6 celler / ml.

Figur 4
Figur 4. Karakterisering av gjenvunne MIN6 β-celle sfæroider. Cell sfæroider ble gjenvunnet fra PEG4NB/CGGYC bruke 40 uM kymotrypsin etter 10 dager in vitro kultur. (A) representant fasekontrast bilde av innkapslede β-celle sfæroider. (B) Representative fasekontrast bilde av gjenvunne β-celle sfæroider. (C) Fordeling of sfæroide diametere (celletetthet = 1 x 10 7 celler / ml).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den beskrevne protokollen presenterer informasjon om enkel innkapsling av celler i tiol-ene hydrogeler dannet steg-vekst fotopolymerisasjon. Mens en støkiometrisk forhold på 1:1 av norbornen til tiol-funksjonelle grupper ble benyttet i denne protokollen, kan forholdet justeres avhengig forsøkene. I tillegg til en korrekt formulering, er det viktig å opprettholde homogenitet i den pre-polymerløsning. Spesielt bruker skånsom pipettering for å sikre at cellene er godt fordelt i den pre-polymer-løsning for å unngå klumping av celle og variasjon i gelegenskaper. Selv om en polymerisasjon tid på 2 min ble brukt for gel tverrbinding, er gel punkt for tiol-ene hydrogeler mindre enn 10 sekunder i de fleste cellers innkapsling-relevante formuleringer (f.eks, er gel punkt for 4 vekt% PEG4NB/CGGYC hydrogel 7 ± 2 sek og 5 vekt% er 6 ± 1 sek). Den raske gelering av denne hydrogel systemet låser raskt cellene på plass, noe som resulterer i bedre cell distribusjon i 3D i forhold til andre fotopolymerisasjon ordninger som tar minutter eller timer å nå gel punkt. 7,20

I tillegg ble β celle sfæroider naturlig dannet i tiol-ene hydrogeler gjenvunnet ved kymotrypsin-mediert gel erosjon. Chymotrypsin, imidlertid er et enzym i trypsin familien og høy konsentrasjon eller lang inkubasjonstid av dette enzymet kan negativt påvirke celle-celle interaksjoner eller også forstyrre sfæroide arkitektur under utvinning. For å unngå dette potensielle begrensning, kan hydrogeler bli tverrbundet av andre thiolated substrater og gel erosjon kan fortsatt oppnås ved egnede enzymer som ikke forårsaker uønskede celle-celle interaksjon.

Total, tiol-ENE hydrogeler gir et cytocompatible miljø for å fremme spredning av β-celler i 3D. Dette systemet kan brukes til kultur og studere den fysiologiske oppførsel av ulike celletyper i 3D. VidereDette systemet gjør det mulig for lettvinte utvinning av cellen konstruerer stiftet i hydrogel matrise for videre funksjonelle og biologiske karakteristikker. Denne mangfoldige og cytocompatible hydrogel gir gel plattform for tekniske komplekse 3D vev for regenerativ medisin programmet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Dette prosjektet ble finansiert av NIH (R21EB013717) og IUPUI OVCR (RSFG). Forfatteren takker Ms Han Shih for henne teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-arm PEG (20kDa) Jenkem Technology USA 4ARM-PEG-20K
Fmoc-amino acids Anaspec
Live/Dead cell viability kit Invitrogen L3224 Includes Calcein AM and Ethidium homodimer-1
AlamarBlue reagent AbD Serotec BUF012
CellTiter Glo reagent Promega G7570
DPBS Lonza 17-512F Without Ca+2 and Mg+2
HBSS Lonza 10547F Without Ca+2 and Mg+2
High Glucose DMEM Hyclone SH30243.01
FBS Gibco 16000-044
Antibiotic-Antimycotic Invitrogen 15240-062
β-Mercapt–thanol Sigma-Aldrich M7522-100ML
Trypsin-EDTA Invitrogen 15400-054
Trypsin-free α-chymotrypsin Worthington Biochemical Corp LS001432
Mouse Inusin ELISA kit Mercodia 10-1247-01
1 ml disposable syringe BD biosciences

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
  2. Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative medicine. Pharmaceutical research. 26, 631-643 (2009).
  3. Lin, C. C., Metters, A. T. Hydrogels in controlled release formulations: network design and mathematical modeling. Advanced drug delivery reviews. 58, 1379-1408 (2006).
  4. Khetan, S., Burdick, J. A. Patterning hydrogels in three dimensions towards controlling cellular interactions. Soft Matter. 7, 830-838 (2011).
  5. Aimetti, A. A., Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Human neutrophil elastase responsive delivery from poly(ethylene glycol) hydrogels. Biomacromolecules. 10, 1484-1489 (2009).
  6. Weber, L. M., He, J., Bradley, B., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled beta-cell microenvironments. Acta biomaterialia. 2, 1-8 (2006).
  7. Lin, C. C., Raza, A., Shih, H. PEG hydrogels formed by thiol-ene photo-click chemistry and their effect on the formation and recovery of insulin-secreting cell spheroids. Biomaterials. 32, 9685-9695 (2011).
  8. Lin, C. C., Anseth, K. S. Glucagon-like peptide-1 functionalized PEG hydrogels promote survival and function of encapsulated pancreatic beta-cells. Biomacromolecules. 10, 2460-2467 (2009).
  9. Lin, C. C., Anseth, K. S. Cell-cell communication mimicry with poly(ethylene glycol) hydrogels for enhancing beta-cell function. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 6380-6385 (2011).
  10. Hui, H., Nourparvar, A., Zhao, X., Perfetti, R. Glucagon-like peptide-1 inhibits apoptosis of insulin-secreting cells via a cyclic 5'-adenosine monophosphate-dependent protein kinase A- and a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent pathway. Endocrinology. 144, 1444-1445 (2003).
  11. Weber, L. M., Lopez, C. G., Anseth, K. S. Effects of PEG hydrogel crosslinking density on protein diffusion and encapsulated islet survival and function. Journal of biomedical materials research. Part A. 90, 720-729 (2009).
  12. Weber, L. M., Hayda, K. N., Haskins, K., Anseth, K. S. The effects of cell-matrix interactions on encapsulated beta-cell function within hydrogels functionalized with matrix-derived adhesive peptides. Biomaterials. 28, 3004-3011 (2007).
  13. Hsu, C. W., Olabisi, R. M., Olmsted-Davis, E. A., Davis, A. R., West, J. L. Cathepsin K-sensitive poly(ethylene glycol) hydrogels for degradation in response to bone resorption. Journal of biomedical materials research. Part A. 98, 53-62 (2011).
  14. Leslie-Barbick, J. E., Moon, J. J., West, J. L. Covalently-immobilized vascular endothelial growth factor promotes endothelial cell tubulogenesis in poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels. Journal of biomaterials science. Polymer. 20, 1763-1779 (2009).
  15. Moon, J. J., Hahn, M. S., Kim, I., Nsiah, B. A., West, J. L. Micropatterning of poly(ethylene glycol) diacrylate hydrogels with biomolecules to regulate and guide endothelial morphogenesis. Tissue engineering. Part A. 15, 579-585 (2009).
  16. Hoyle, C. E., Bowman, C. N. Thiol-ene click chemistry. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 49, 1540-1573 (2010).
  17. Hoyle, C. E., Lowe, A. B., Bowman, C. N. Thiol-click chemistry: a multifaceted toolbox for small molecule and polymer synthesis. Chemical Society reviews. 39, 1355-1387 (2010).
  18. Fairbanks, B. D., et al. A Versatile Synthetic Extracellular Matrix Mimic via Thiol-Norbornene Photopolymerization. Adv. Mater. 21, 5005 (2009).
  19. Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility. Biomaterials. 30, 6702-6707 (2009).
  20. Zustiak, S. P., Leach, J. B. Characterization of protein release from hydrolytically degradable poly(ethylene glycol) hydrogels. Biotechnology and bioengineering. 108, 197-206 (2011).
Produksjon og gjenoppretting av β-celle sfæroider Fra Step-vekst PEG-peptid Hydrogeler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).More

Raza, A., Lin, C. C. Generation and Recovery of β-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels. J. Vis. Exp. (70), e50081, doi:10.3791/50081 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter