여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno-DNA의 물고기)에 의해 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다.
3D 공 촛점 현미경에 이어 3 치수 보존 핵에 DNA 프로브를 사용하여 원위치 하이브리드 화에 형광은 (3 차원 DNA 물고기) 각 셀의 하위 지역 염색체 유전자 loci의 위치, 또는 전체 지역을 시각화 할 수있는 가장 직접적인 방법을 나타냅니다. 분석이 유형의 핵의 글로벌 아키텍처뿐만 아니라 핵 공간 내의 특정 게놈의 loci와 지역의 행동에 대한 통찰력을 제공합니다. Immunofluorescence는 반면에, 핵 단백질의 검출을 (수정 histones, 히스톤 변형과 수식, 전사 기계 요소, 핵 하위 구획 등) 할 수 있습니다. immunofluorescence 및 3D DNA 물고기를 결합의 주요 과제는 핵의 3D 아키텍처뿐만 아니라 항체에 의해 검출 된 에피토프를 유지하기 위해 한 손에 있으며, 반면에, DNA 프로브의 침투가 감지 할 수 있도록 유전자 loci 또는 염색체 지역 1-5. 여기 3D 보존 핵의 게놈 loci과 염색질 수정 시각화를 결합한 프로토콜을 제공합니다.
Epigenetic 메커니즘을 트리거 설치 및 발달 및 세포 유형의 특정 전사의 프로필 상속. 한 수준에서이 활성 또는 자동 게놈 영역을 정의 염색질 포장 변조를 포함합니다. 큰 규모에서 게놈과 핵 건축의 글로벌 3D 조직은 전사 패턴의 제어 역할을한다. 따라서, 이러한 epigenomic 기능의 해부는 유전자 6-11을 규제하는 방법의 전체 이해 필수적입니다.
결합 immunofluorescence 및 3D DNA의 물고기는 특정 상호 작용 / 핵 내에서 DNA 시퀀스 및 / 또는 단백질의 연결을 평가하여 분자 및 생화학 분석을 보완 할 수있는 독특한 기회를 제공합니다. 동안 또한, 같은 염색질 immunoprecipitation (칩 seq) 또는 깊은 시퀀싱와 결합 염색체 캡쳐 형태로 게놈 전체의 높은 처리량 기술 (4C-seq, 5C는, 하이-C) 글로벌 DAT를 제공합니다세포 인구 12, immunofluorescence / DNA 물고기 기술은 단일 세포 수준에서 분석 할 수 있습니다.
여기 3D 현미경 및 분석 (3D immuno – 물고기) 다음 DNA 생선의 immunofluorescence와 DNA 시퀀스에 의한 히스톤 수정의 동시 검출을위한 프로토콜을 설명합니다. 이 프로토콜의 장점은 DNA와 단백질 구조의 보존을 결합 시각화입니다. 이 분야에 경험은 기존 프로토콜을 개선하고 단순화 할 수있게되었습니다. 우리가 재조합를 겪고 림프구에 DNA 이중 좌초 휴식을 감지하는이 프로토콜을 사용했지만,이 방법은 다른 단백질과 다른 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.
위에 설명 된 기술은 림프구에게 30,31 개발에 면역 글로불린 및 Tcra / D loci의 V (D) J 재조합의 규정을 분석하기 위해 실험실에서 사용되었습니다. 우리는이 기술이 다른 세포 유형의 다양한 핵 단백질, 핵 구획과 loci의 감지,에 적응 될 수 있다는 확신합니다. 프로토콜의 수정이 필요할 수 있습니다,이 경우에 초점을 주요 단계는 다음과 같습니다. 첫째, permeabilization의 길이는 ?…
The authors have nothing to disclose.
우리는 토론과 의견 Skok 실험실, 특히 수잔나 휴잇의 회원 감사드립니다. 이 작품은 건강 교부금의 국립 연구소 R01GM086852, RC1CA145746 (JAS)에 의해 지원됩니다. JAS는 백혈병과 림프종 사회 학자이다. JC는 암 연구소의 Irvington 연구소 연구원입니다. MM은 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 기금 통합 대학원 교육과 연구 Traineeship (NSF IGERT 0,333,389)에 의해 지원됩니다.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
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Table 1. Specific reagents and small equipment. |