Summary
Här beskriver vi ett protokoll för samtidig detektion av histon ändringar genom immunofluorescens och DNA-sekvenser med DNA-FISK följt av 3D mikroskopi och analyser (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Fluorescent in situ hybridisering med DNA-sonder på 3-dimensionellt bevarade kärnor följt av 3D konfokalmikroskopi (3D-DNA FISH) är det mest direkta sättet att visualisera placeringen av genloci, kromosomal delregioner eller hela territorier i enskilda celler. Denna typ av analys ger en inblick i den globala arkitekturen i kärnan samt uppförande av specifika genomiska loci och regioner inom den nukleära utrymmet. Immunofluorescens, å andra sidan, för detektering av nukleära proteiner (modifierade histoner, histon varianter och modifieringsmedel, transkription maskiner och faktorer, nukleära sub-fack, etc). Den stora utmaningen att kombinera immunofluorescens och 3D-DNA FISK är, å ena sidan för att bevara den epitop som detekteras av antikroppen såväl som 3D-arkitektur av kärnan, och å andra sidan, för att tillåta penetrering av DNA-prob för att detektera genloci eller territorier kromosom 1-5. Här erbjuder vi ett protokoll som kombinerar visualisering av kromatin ändringar med genomiska loci i 3D bevarade kärnor.
Introduction
Epigenetiska mekanismer utlöser etablering och arv av utvecklings-och celltyp specifika transkriptionella profiler. På en nivå handlar det modulering av kromatin förpackningar som definierar aktiva eller tysta genomiska regioner. På en större skala, den globala 3D organisation av genomet och nukleära arkitektur spelar också en roll i kontrollen av transkriptionella mönster. Således är dissektion av dessa epigenomic funktioner nödvändiga för en fullständig förståelse av hur gener regleras 6-11.
Kombinerad immunofluorescens och 3D-DNA FISH ger en unik möjlighet att komplettera molekylära och biokemiska analyser genom att bedöma specifika interaktioner / sammanslutningar av DNA-sekvenser och / eller proteiner i kärnan. Vidare, medan genomet hela hög kapacitet tekniker såsom kromatin immunoprecipitation (chip-seq) eller kromosom fånga konformation i kombination med djup sekvensering (4C-seq, 5C, Hi-C) ger den globala data på cellpopulationer 12, immunofluorescens / DNA FISH teknik möjliggör analyser på en enda cell nivå.
Här beskriver vi ett protokoll för samtidig detektion av histon ändringar av immunofluorescens och DNA-sekvenser med DNA-FISK följt av 3D mikroskopi och analyser (3D immuno-FISH). Fördelen med detta protokoll är den kombinerade visualisering av DNA och bevarande av proteinstrukturer. Vår erfarenhet på detta område har gjort det möjligt för oss att förbättra och förenkla existerande protokoll. Även om vi har använt detta protokoll för att upptäcka DNA dubbelsträngade avbrott i lymfocyter som genomgår rekombination, kan denna metod tillämpas på andra proteiner och andra celltyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Probe märkning med Fluoroforer: nicktranslation (~ 6 timmar)
- Ren BAC-DNA (framställd genom maxi-prep) eller plasmider eller PCR-produkter, alla återsuspenderades i H 2 O, kan användas för märkning. Observera att för en robust FISH signal bör sönder spänna minst 10 kb.
- Inkubera DNA i RNas A under 30 min vid 37 ° C (Alla reagens listas i tabell 1).
- Inkubera nicktranslation reaktionen under 2 timmar vid 16 ° C (se tabellerna 2 och 3). Alternativa metoder för direkt märkning kan användas (exempel: FISH Tag, Invitrogen).
- Inaktiverar reaktionen under en timme vid -80 ° C eller över natten vid -20 ° C.
- Bestäm sond storlek på en 2% agarosgel. Utstryket bör vara mellan 100 och 1.000 bp, med majoriteten på ungefär 300-500 bp (Observera att utstryk av Cy5-prober syns inte). Om DNA inte digereras tillräckligt, mer DNA Pol I ochDNas I kan sättas till reaktionsblandningen och inkuberades under ytterligare två timmar vid 16 ° C.
- Rena sönder på 0,025 mm filter i två liters bägare fyllda med H 2 0 för två timmar i mörker.
- Lägg blockerande faktorer till sonderna enligt följande: 10 | ig av Cot-1-DNA, 10 pg Hybloc DNA och 100 pg laxsperma under 10 pg av DNA-prober. Förvara DNA-prober vid -20 ° C.
2. Sond Nederbörd / Denaturering / Pre-glödgning (3-4 tim)
- Mellan 0,3 pg och 1 pg av DNA-sond används per täckglas. Mix prober med 0,1 volym 3 M NaAc (pH 5,2) och 2,5 volymer av 100% etanol, inkubera under en timme vid -80 ° C eller över natten vid -20 ° C och spinn ner vid 13.000 rpm vid 4 ° C under 30 minuter. Notera att mängden DNA-proben kan justeras beroende på kvaliteten av DNA och den nukleära regionen för hybridisering. Alternativa metoder för direkt märkning kan tillåta användning av reducerade mängdersond. För detektering av flera signaler DNA Fisk på en bild, kan de olika sonderna fällas ihop (förutom givare som inte bör vara för-glödgade, liksom upprepade sekvenser). Prober för flera experiment utförda på samma gång kan också fällas ihop. Pellets bör lätt färgade enligt fluoroforer används (om små mängder av sönder fälls, kan pelleten inte syns).
- Torra pellets och återsuspendera dem i 15 pl hybridiseringsbuffert (se tabell 4) per täckglas med skakning (med användning av en Eppendorf Thermomixer) i mörker vid 37-45 ° C (under ca 20 minuter).
- Denaturera prober för 5 minuter vid 75-95 ° C.
- Pre-aducering sönder vid 37 ° C under 30-60 min. Längd före glödgning kan justeras beroende på komplexiteten och kvaliteten på sonderna.
- Applicera sonder till täckglasen för natten hybridisering (se avsnitt 3).
3. 3-Dimensionell DNA-FISK - första dagen (~ 3 timmar)
- Icke-adherenta celler koncentreras i en liten volym av 1 x PBS (~ 2x10 5 celler i 5-10 | il 1 x PBS per täckglas) och droppades på centrum av en poly-L-lysin belagda täckglas. Vidhäftande celler bör odlas på täckglas under minst 24 timmar (~ 70% konfluens) (täckglas kan beläggas med 0,1% gelatin). Square 18x18 till 24-24 mm täckglas placeras i 6-brunnar, och i hela protokollet, två ml av varje lösning som används per brunn (alternativt runda 1,5 mm täckglas kan placeras i 12/24-well plattor).
- Fixera celler i 2% paraformaldehyd / 1 x PBS, pH 7-7,4, under 10 min vid RT (4% PFA lager kan alikvoter, lagras vid -20 ° C). Paraformaldehyd kan köpas i lösning (16%), eller 4% stamlösningar kan framställas från pulver / prills. Paraformaldehyd pulver löses i 1 x PBS vid> 60 ° C (pH kan höjas till 8-9 för att underlätta upplösning), kyld-ner på is, justerased till pH 7-7,4, filtrerades, alikvoterades i falkar och lagrades i flera veckor vid -20 ° C.
- Efter tre sköljningar i 1 x PBS, permeabilisering celler i iskallt-kall 0,4% Triton-X-100/1 x PBS under 5 min på is. Längd permeabilisering kan justeras beroende på celltyp OBS:. Om DNA FISK kombineras med immunofluorescens ska immunfärgning göras i detta skede (se avsnitt 4).
- Efter tre sköljningar i 1 x PBS, inkubera celler med 0,1 ug / ul RNas A i 1 x PBS under en timme vid 37 ° C. Täckglas placeras cell nedåt på en droppe 100 ul lösning på parafilm eller en bild i en fuktig kammare. Täckglas sedan försiktigt bort med pincett. Om något motstånd påträffas bör täckglas att översvämmas med 1x PBS för att undvika skada cellerna.
- Efter tre sköljningar i 1 x PBS, permeabilisering celler i iskallt-kall 0,7% Triton-X-100 / 0,1 M HCl under 10 min på is.
- Efter tre sköljningar iN 1x PBS, denaturerar celler i 1,9 M HCl under 30 min vid RT. Alternativt, kan celler denaturerades i 50% formamid / 2 x SSC vid 75-80 ° C under minst 30 minuter. Observera att hybridisering längd (och temperatur) kan optimeras beroende på celltyp.
- Efter tre sköljningar i iskall 1 x PBS, hybridisera celler med prober över natt vid 37 ° C i en mörk och fuktig kammare. Täckglas placeras cell nedåt på en droppe 15 pl prob på en bild och förseglade med gummi cement.
4. 3-dimensionell Immuno-FISH - första dagen (~ 6-7 timmar)
- För kombinerad immunofluorescens / DNA-fisk, immunofärgning utföras efter permeabilisering i 0,4% Triton-X-100 (steg 3,3).
- Inkubera cellerna i blockerande lösning under 30 min vid rumstemperatur (2,5% bovint serumalbumin (BSA), 10% normalt getserum, 0,1% Tween-20). Den blockerande lösningen filtreras, alikvoterades i 1,5 ml Eppendorf-rör och lagras för månader vid -20 ° C.
- Inkubera cellerna med den primära antikroppen framtagen mot proteinet eller histon modifiering av intresse utspätt i blockeringslösning under en timme vid rumstemperatur i en fuktig kammare. Här visar vi ett exempel på en antikropp mot fosforylerade serin-139 i H2AX (γ-H2AX, Millipore, se tabell 5 för detaljer). Täckglas placeras cell nedåt på en droppe 100 ul lösning på parafilm eller en bild i en fuktig kammare. Täckglas sedan försiktigt bort med pincett (översvämmade med 1x PBS vid behov). Observera att utspädning och inkubation längd kan justeras beroende på kvaliteten av antikroppen och cell-typer.
- Tvätta cellerna i 0,2% BSA / 0,1% Tween-20/1 x PBS, tre gånger 5 min vid RT med skakning.
- Inkubera cellerna med lämplig fluorofor-konjugerad sekundär antikropp utspädd i blockeringslösning under en timme vid rumstemperatur i en mörk och fuktig kammare. Här visar vi ett exempel på detektion med ensekundär get-anti-mus-antikropp (Alexa Fluor 488 eller 555, Invitrogen, Se Tabell 5 för detaljer). Hapten-konjugerade sekundära antikroppar (biotin, digoxigenin, etc) kan också användas. I detta fall kan ett extra steg för lämplig detektion (streptavidin, anti-DIG, etc.) utföras antingen före eller efter över-natten-DNA-hybridisering FISH.
- Skölj celler i 0,1% Tween-20/1 x PBS, tre gånger 5 min vid rumstemperatur med skakning i mörker.
- Efter positionsbestämningen celler i 2% paraformaldehyd / 1 x PBS under 10 minuter vid rumstemperatur i mörker.
- Fortsätt DNA fisk som ovan från inkubation i RNas A (steg 3,4).
5. 3-dimensionell DNA-FISH / Immuno-FISH - andra dagen (~ 2 timmar)
- Ta försiktigt bort gummi cement, översvämningar täckglas med 2x SSC, försiktigt bort med pincett och placera dem i brunnar som innehåller tvättlösning.
- Tvätta cellerna i 2x SSC under 30 minuter vid 37 ° C i mörker med skakning.
- Tvätta cellerna i 2x SSC under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker med skakning.
- Tvätta cellerna i 1 x SSC under 30 minuter vid rumstemperatur i mörker med skakning Notera att i händelse av denaturering med formamid, bör tvättningarna ersättas med följande:. 3 tvättar i 50% formamid / 2 x SSC och 3 tvättningar i 2x SSC, 5 min vardera, vid 37 ° C.
- Montera celler i förlänga guld montering medium innehållande 1,5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-fenylindol) för motfärgning av totalt DNA. Täckglas placeras cell nedåt på en droppe 10-15 il monteringsmedium på en bild och förseglad med nagellack. Diabilder förvaras i månader vid -20 ° C.
6. 3D Mikroskopi och analys
- 3D-bilder kan förvärvas med olika mikroskop system. I våra experiment, är optiska grupper åtskilda av 0,3 um uppsamlades på en Leica SP5 AOB-bakterier konfokalt system (akusto-optiska stråldelare). Observera att separationen mellan optical plan kan justeras beroende på typ av analys.
- 3D bildstaplar kan analyseras med olika programvaror och verktyg. Vi använder Image J för att bedöma avståndsmätningar mellan loci av intresse och för att analysera olika typer av sammanslutning av lokus av intresse med sub-nukleära fack eller proteiner.
- Alla statistiska analyser utförs för att jämföra två (eller flera) olika biologiska förutsättningar med parvis bedömning (ar) av betydelse: jämförelse mellan olika celltyper eller stadier, jämförelse mellan olika loci av intresse. I alla statistiska test, P-värden ≤ 5,00 E-2 (a = 0,05) tas för att vara signifikant (1,00 E-2 ≤ P ≤ 5,00 E-2 * signifikant, 1,00 E-3 ≤ P ≤ 1,00 E-2 * * mycket betydande, P <1,00 E-3 *** stor betydelse).
Statistisk analys av hela fördelningen av avstånden mellan två alleler. Vi först c.onstruct kumulativa kurvor Utdelningsfrekvens över hela området av uppmätta avståndet mellan två alleles.To bedöma betydelsen av skillnader i fördelningen av empiriska mellan alleliska avstånd vi använder icke-parametriska tvåprovs Kolmogorov-Smirnov (KS) test 13,14.
Statistisk analys av nära association (dvs. parning) av två alleler med användning av en optimalt avstånd avskärning. Att identifiera intervallet mest robusta skillnader i avstånd mellan två alleler eller loci, använder vi en serie av tvåsidig Fishers exakta test 15 sekunder. Nämligen vid varje uppmätt avstånd vi testa om ett villkor är signifikant överrepresenterade vid kortare avstånd mellan de två proven. Det minsta i fördelningen av p-värden indikerar olika avstånd som bör betraktas som en cut-off för nära samarbete (dvs. parning) av de två allelerna. Därefter tvåsidig Fishers exakta test används to bedöma betydelsen av parning av två alleler vid den identifierade gränsvärdet 15. Flera tester korrigeringar tillämpas ta hänsyn till det totala antalet Fisher tester 16.
Statistisk analys av association av locus av intresse med sub-nukleära fack eller proteiner. De tvåsidig Fisher-exakt test används för att analysera betydelsen av association av locus av intresse med olika fack eller proteiner 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA och immuno-FISH används i Skok labbet för att studera förändringar i kärn organisation i samband med processen för V (D) J-rekombination av loci antigenreceptor under B-och T-lymfocyter utveckling. De tekniker som beskrivs ovan gör att vi kan i) mäta avstånd mellan de två ändarna av ett lokus (kontraktion) ii) mäta avstånd mellan alleler eller loci (parning), iii) analysera DNA-skador som inträffar inom lokus, iv) bedöma placeringen av alleler och loci relativt nukleära sub-fack (repressiva pericentromera heterokromatin i vår studie), och v) bedöma Association of Nuclear proteiner på alleler och loci (sammanslutning av den fosforylerade histon γ-H2AX i vår studie). I synnerhet analyserade vi roll locus dynamik i regleringen av V (D) J-rekombination av immunoglobulin-loci i utvecklingen B-celler 17-30 och i regleringen av härstamning engagemang mellan CD4 + och CD8 + Tceller 14. Vi bedömde också DNA-skada på en av T-cellreceptor-locus, Tcra / d, i utvecklingen av T-celler som bär en mutant form av rekombinaset proteinet RAG2 31.
Figur 1. Analys av avstånd mellan två alleler eller loci. (A) Konfokala sektioner som visar representativa oparade (höger) eller parade (vänster) alleler i enskilda kärnor. Den DNA FISH sond genererades från en BAC (~ 200 kb) spänner över lokus av intresse. Avstånden mellan alleler mättes mellan centrum av massan av varje BAC signal i 3D bildstaplar. Streckade cirklar beskriva nucleus former. Skala barer = 1 um. (B) Sammantagen frekvensfördelningsprofiler kurvor som visar hela bredden av avstånd mellan två allelens mätt i två olika biologiska förhållanden (vildtyp kontra mutant). De icke-parametriska tvåprovs KS testet användes för att bedöma betydelsen av skillnaderna mellan de två fördelningarna. Utbudet av mest robusta skillnader i mellan alleliska avstånd bedömdes med hjälp av en serie av två-svans Fisher exakta test (blå punkter). De mest robusta P-värden (högre punkter) påträffades för avstånd runt 1 pm. Således cut-off för nära samarbete (dvs. parning) av de två allelerna inrättades vid 1 pm. (C) kumulativ frekvens kurvor som visar avstånden mellan de två allelerna från 0 till 1,5 um i de två olika biologiska förhållanden. Betydelsen av parning av två alleler bedömdes med hjälp av två-tail Fisher exakt test för en cut-off på 1 pm. Klicka här för att se större bild .
Figur 2. Analys av läget för ett lokus i förhållande till sub-nukleära fack. I våra studier analyserar vi sambandet mellan våra lokus av intresse och den repressiva sub-nukleära fack som bildas av pericentromera heterokromatin (PCH) 32. Alleler anses ligger i PCH när BAC signalen för orten av intresse är intill eller överlappande med γ-satellitsignalen som hybridiserar till PCH (ingen pixel i mellan kanterna på BAC och γ-satellit-DNA-signaler fisk). Konfokala sektioner representerar placeringen av Tcra alleler i förhållande till PCH: (överst) ingen allel finns på PCH, (mitten) en allel i PCH, (längst ned) två alleler vid PCH. Locus i rött och γ-satellit i vitt. Gula pilar visar alleler som finns på PCH. Streckade cirklar beskriva nucleus former. Skala bar = 1 um.
Figur 3. Analys av Association of Nuclear proteiner och histon ändringar i ett lokus. (A) I våra studier analyserar vi sambandet mellan våra lokus av intresse och den fosforylerade formen av histon H2AX (γ-H2AX), som avläsning för DNA dubbel -strängade avbrott 33. Konfokala delar visar exempel på några γ-H2AX Association (överst) eller en sammanslutning på ett Tcra allel (nederst) i enskilda kärnor. Alleler definierades som associerade med γ-H2AX om BAC signaler och immunofluorescens foki var åtminstone delvis överlappade (åtminstone en pixel av samlokalisering). Locus visas i rött och γ-H2AX i vitt. Streckade cirklar kontur nucleus former. Skala bar = 1 um. Det är att notera att samlokalisering analyser av BAC signalen med PCH eller γ-H2AX fokus utförs manuellt med Image J utan automatisk tröskel. (B) förlust av en del av γ-H2AX signal efter denaturering är en av de viktigaste tekniska frågorna i denna immuno-DNA FISH protokoll. Här visar vi ett exempel på immunofluorescens före (överst) och efter (nederst) HCl-baserad denaturering behandling (Formamid-behandling gav liknande resultat (visas ej)). Även om signalen var svagare, huvuddragen i färgningen, särskilt antalet foci, återstår efter behandlingen. Använda en SP5 Leica konfokala var inställningarna för 561 lasern före och efter denaturering följande: 35% effekt / smarta vinst på 730V och 45% effekt / smarta förstärkning vid 750V, respektive. Dessutom visar vi här ett exempel på en immunofluorescensfärgning för en annan histon mNDRING, H3K27me3 (Right paneler) visar att detta protokoll kan tillämpas på andra histon märken, såsom tidigare har publicerats 1,3. γ-H2AX visas i gult och H3K27me3 i rött. Streckade cirklar beskriva nucleus former. Skala bar = 2 am. Klicka här för att se större bild .
| Namn på reagens / material | Företag | Catalogm nummer | Kommentarer |
| H 2 O | Fisher | # BP2470 | |
| RNas A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 till C-11.401 | |
| Cy3 eller Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNas I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA-Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 im filter | Millipore | # VSWP02500 | |
| Barnsäng-1-DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Tillämpad genetik | # MHB | |
| Laxsperma | Sigma | # D1626 | pulver som skall återsuspenderas vid 10 mg / ml i H 2 O |
| NaAc (natriumacetat, pH 5,2, buffertlösning) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol kvalitet) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol kvalitet) | Fisher | # BP431 | |
| Dextransulfat pulver | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (saltlösning-natriumfosfat-EDTA) 20x lösning | Fisher | # BP1328 | |
| Formamid | Fisher | # BP227 | |
| Täckglas | Fisher | # 12-548-B | |
| Diabilder | Fisher | # 12-550 | |
| 6-brunnsplattor | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyd, pellets, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grad | Sigma | # T8787 | |
| BSA (bovint serumalbumin) fraktion V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normalt getserum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grad | Sigma | # P9416 | |
| SSC (saltlösning natriumcitrat) 20x lösning | Fisher | # BP1325 | |
| Förlänga guld antifad reagens | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-fenylindol) | Sigma | # D9542 | |
| Bästa testet en päls gummi cement | Konst eller kontor leverans butiker |
Tabell 1. Särskilda reagenser och mindre utrustning.
| NT med dUTP tillsammans med Alexa-fluoroforer | Belopp | Slutlig koncentration |
| 10 pg DNA | X ul | |
| RNas A - 0,17 ug / ul | 10 il | |
| H 2 O | Fyll till 260 ul | |
| TOTALT - 30 minuter vid 37 ° C | 260 ul | |
| 10x NT-buffert | 50 il | 1x |
| 100 mm & varaTA,-merkaptoetanol | 50 il | 10 pM |
| dNTP-blandning | 40 il | 40 ^ M av varje dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 il | 10 pM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 ^ | 30 pM |
| DNas I (arbetslösning, se tabell nedan) | 30 il | |
| DNA-Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTALT - 2 timmar vid 16 ° C | 500 pl | |
| NT med dUTP tillsammans med Cy3 eller Cy5 | Belopp | Slutlig koncentration |
| 10 pg DNA | X ul | |
| RNas A - 0,17 ug / ul | 10 il | |
| H 2 O | Fyll till 300 pl | |
| TOTALT - 30 minuter vid 37 ° C | 300 pl | |
| 10x NT-buffert | 50 il | 1x |
| 100 mM β-merkaptoetanol | 50 il | 10 pM |
| dNTP-blandning | 50 il | 50 pM av varje dNTP |
| 1 mM Cy3-eller Cy5-dUTP | 12 ^ | 30 pM |
| DNas I | ~ 30 | il | ~ 1,2 U / | il |
| DNA-Pol I | 7,5 pl | 15 U / ml |
| TOTALT - 2 timmar vid 16 ° C | 500 pl |
Tabell 2. RNas A behandling och Nick Översättning för 10 pg DNA.
| Lösningar | Aktier | |
| RNas A | Arbetslösning: 0,17 ug / ul | Består färska |
| 10x NT-buffert: | 0,5 M Tris-HCl, pH 8, 50 mM MgClj 2, 0,5 mg / ml BSA | 1,5 ml rör vid -20 ° C. |
| dNTP-blandning: | dATP, dCTP och dGTP: 0,5 mM vardera i H 2 O | 1,5 ml rör vid -20 ° C |
| DNas I: | Stamlösning: rekonstituerades vid 20.000 U / ml i 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCl | 0,5 ml rör vid -20 ° C |
| Arbetslösning: Varje ny sats av DNas I stamlösning bör testas vid olika utspädningar (10 U / ml, 20 U / ml och 40 U / ml i H 2 O). Utspädningen som ger en DNA-utstryk mellan 100 och 1.000 bp (sesteg 5) bör användas som arbetslösning. | Består färska |
Tabell 3. Lösningar för RNas En behandling och Nick översättning.
| Hybridiseringsbuffert | Lösningar | Aktier | |
| 10% | 50x Denhardfs lösning: | 1 g Ficoll 400, 1 g Polyvinylpyrrolidon och 100 ml H 2 0 - Filtrerat | 50 ml Falcon vid -20 ° C |
| 40% | 25% dextransulfat: | Dextransulfat pulver löses i 12.5x SSPE vid 37-65 ° C | 50 ml Falcon vid -20 ° C |
| 50% | Formamid | Flaskor vid +4 ° C | |
| Alikvoter på 1,5 ml Eppendorf lagras vid -20 &grader, C | |||
Tabell 4. Hybridiseringsbuffert.
| Antikroppar | Leverantör | Katalognummer | Utspädning |
| γ-H2AX - fosfor H2A.X, klon JBW301, mus monoklonal | Millipore | # 05636 | 1/200 |
| H3K27me3, klon, kanin polyklonala | Millipore | # 07449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-mus | Invitrogen | # A-31.570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 get-anti-mus | Invitrogen | # A-11001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 get-anti-kanin | Invitrogen | # A-11.008 | 1/500 | </ Tr>
Tabell 5. Primära och sekundära antikroppar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De tekniker som beskrivs ovan användes i vårt labb för att analysera regleringen av V (D) J-rekombination av immunglobulin och Tcra / d loci utveckla lymfocyter 30,31. Vi är övertygade om att denna teknik kan anpassas för detektion av olika nukleära proteiner, nukleära fack och loci i olika celltyper. Ändringar av protokollet kan vara nödvändigt, och i detta fall de viktigaste stegen för att fokusera på är följande. Först, kan längden på permeabilisering justeras beroende på celltyp. Andra längden av den primära antikroppen inkubationen kan också justeras i enlighet med kvaliteten av antikroppen och mängden av proteinet av intresse (t.ex. i vissa fall kan inkubation ske över natten vid 4 ° C). Viktigt kan denatureringssteget anpassas och HCl behandling kan ersättas av denaturering i Formamid 3,4,34 och NaOH för DNA FISH 20. Också upprepaed frysnings-upptiningscykler av flytande kväve kan tillämpas på cellerna efter fixering / permeabilisering för DNA FISH enbart 4,34. Slutligen, medan flera histon modifieringar, RNA-polymeras II och co-faktorer har framgångsrikt detekteras med denna metod 30,35, kan immunofärgning för andra nukleära proteiner utföras efter DNA-FISH hybridisering 4.
3D bildanalys kan innebära användning av olika typer av mikroskop, inbegripet brett fält epifluorescens (kopplad med avfaltning) och konfokal lasermikroskopi 36. Valet av det bildgivande metoden kommer att bero på den erforderliga upplösningen, antalet fluoroforer, djupet av proven och kvaliteten av DNA och protein signaler. Utvecklingen av nya högupplösta mikroskop öppnar en helt ny väg i exakt visualisering av nukleära och cellulära processer 37-39. Dessutom har nya tekniker för generation skräddarsydda prober som innehåller någon upprepad sekvens möjliggöra ren detektion av genomiska regioner, från en 15-kb specifikt lokus, till komplexa pooler av exonerna 40. Detta ökar noggrannheten och känsligheten hos högupplösta mikroskopi att spåra dynamiken i nukleära processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Vi vill tacka medlemmarna i Skok labbet, speciellt Susannah Hewitt, för diskussioner och kommentarer. Detta arbete stöds av National Institute of Health bidrag R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS är en Leukemia & Lymphoma Society forskare. JC är en Irvington institut kamrat av Cancer Research Institute. MM stöds av National Science Foundation integrativ forskarutbildning och forskning Praktik (NSF IGERT 0.333.389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
