Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno DNA FISH).
Fluorescente in situ hybridisatie met DNA probes on 3-dimensionaal bewaard kernen gevolgd door 3D confocale microscopie (3D DNA FISH) is de meest directe manier om de locatie van genloci, chromosomale deelgebieden of gehele grondgebied in individuele cellen te visualiseren. Dit type analyse geeft inzicht in de globale architectuur van de kern en het gedrag van specifieke genomische loci en gebieden binnen de nucleaire ruimte. Immunofluorescentie, anderzijds, voor het vaststellen van nucleaire eiwitten (gemodificeerde histonen, histon varianten en modifiers, transcriptiemachinerie en factoren, nucleaire subcompartimenten, etc). De grote uitdaging in combinatie immunofluorescentie en 3D DNA FISH is enerzijds aan de epitoop herkend door het antilichaam en de 3D structuur van de kern te behouden en anderzijds, zodat de penetratie van de DNA probe te detecteren genloci of chromosoom gebieden 1 tot 5. Hier bieden wij een protocol dat visualisatie van chromatine modificaties met genomische loci in 3D bewaarde kernen combineert.
Epigenetische mechanismen trekker vestiging en overerving van ontwikkelings-en cel-type specifieke transcriptionele profielen. Op een bepaald niveau gaat het om de modulatie van chromatine verpakking dat de actieve of stille genomische regio's definieert. Op grotere schaal, algemene 3D organisatie van het genoom en nucleaire architectuur een rol spelen in de controle van transcriptionele patronen. Zo dissectie van deze epigenomisch functies is van essentieel belang voor een goed begrip van de manier waarop genen worden gereguleerd 6-11.
Gecombineerd immunofluorescentie en 3D DNA FISH bieden een unieke gelegenheid om moleculaire en biochemische analyses aan te vullen met het beoordelen van specifieke interacties / verenigingen van DNA-sequenties en / of eiwitten in de kern. Bovendien, terwijl genoom-brede high throughput technieken zoals chromatine immunoprecipitatie (ChIP-seq) of chromosoom capture conformatie in combinatie met diepe sequencing (4C-seq, 5C, Hi-C) bieden wereldwijde thateen op celpopulaties 12, immunofluorescentie / DNA FISH technieken maken van de analyses op de enkele cel niveau.
Hier beschrijven we een protocol voor gelijktijdige detectie van histonmodificaties door immunofluorescentie en DNA-sequenties van DNA FISH gevolgd door 3D microscopie en analyses (3D-immuno FISH). Het voordeel van dit protocol is de gecombineerde visualisatie van DNA en behoud van eiwitstructuren. Onze ervaring op dit gebied heeft ons in staat te verbeteren en vereenvoudiging van de bestaande protocollen. Hoewel we hebben dit protocol DNA dubbelstrengs breuken gedetecteerd in lymfocyten ondergaan recómbinatie, kan deze werkwijze worden toegepast op andere eiwitten en andere celtypen.
De hierboven beschreven technieken werden in ons laboratorium van de regulering van V (D) J recombinatie van het immunoglobuline en Tcra / d loci in ontwikkeling lymfocyten 30,31 analyseren. We zijn ervan overtuigd dat deze techniek kan worden aangepast voor detectie van verschillende nucleaire eiwitten, nucleaire compartimenten en loci, in verschillende celtypen. Wijzigingen van het protocol noodzakelijk zijn, en in dit geval de belangrijke stappen te concentreren op de volgende. Ten eerste…
The authors have nothing to disclose.
We willen de leden van de Skok lab, in het bijzonder Susannah Hewitt, bedanken voor discussies en commentaar. Dit werk wordt ondersteund door de National Institute of Health subsidies R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS is een Leukemia & Lymphoma Society geleerde. JC is een Irvington Instituut Fellow van het Cancer Research Institute. MM wordt ondersteund door een National Science Foundation Grant Integratieve Graduate Onderwijs en Onderzoek Traineeship (NSF IGERT 0333389).
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |