Summary
Her beskriver vi en protokol til samtidig påvisning af histon ændringer ved immunofluorescens og DNA sekvenser ved DNA FISK efterfulgt af 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-DNA FISH).
Abstract
Fluorescerende in situ hybridisering med DNA-prober på 3-dimensionelt bevarede kerner efterfulgt af 3D konfokal mikroskopi (3D DNA FISH) repræsenterer den mest direkte måde at visualisere placeringen af gen loci, kromosomale subregioner eller hele områder i de enkelte celler. Denne type analyse giver indblik i den globale arkitektur af kernen samt opførsel af specifikke genomiske loci og regioner i det nukleare område. Immunofluorescens på den anden side tillader påvisning af kerneproteiner (modificerede histoner, histon varianter og modifikatorer, transkriptionsmekanisme og faktorer, nukleare delrum osv.). Den største udfordring i at kombinere immunofluorescens og 3D DNA FISH er, på den ene side at bevare epitopen detekteres af antistoffet såvel som 3D arkitektur af kernen, og på den anden side, for at tillade gennemtrængning af DNA-probe til påvisning gen loci eller kromosom territorier 1-5. Her giver vi en protokol, der kombinerer visualisering af kromatin modifikationer med genomiske loci i 3D konserveret kerner.
Introduction
Epigenetiske mekanismer udløser etablering og arv af udviklings-og celletype specifikke transkriptionelle profiler. På et niveau dette indebærer modulering af kromatin emballage, der definerer aktive eller stille genomiske regioner. I en større målestok, også global 3D organisering af genomet og nuklear struktur spiller en rolle i kontrollen af transkriptionelle mønstre. Således dissektion af disse epigenomic funktioner er afgørende for en fuld forståelse af, hvordan generne reguleres 6-11.
Kombineret immunofluorescens og 3D DNA FISH giver en unik mulighed for at supplere molekylære og biokemiske analyser ved at vurdere specifikke interaktioner / sammenslutninger af DNA-sekvenser og / eller proteiner i kernen. Og selv om genom-dækkende high throughput-teknikker, såsom chromatin immunoprecipitation (chip-seq) eller kromosom capture konformation kombineret med dyb sekventering (4C-seq, 5C, Hi-C) giver global daten på cellepopulationer 12, immunofluorescens / DNA FISH teknikker muliggøre analyser på enkelt celle niveau.
Her beskriver vi en protokol til samtidig påvisning af histon ændringer ved immunofluorescens og DNA sekvenser ved DNA FISK efterfulgt af 3D mikroskopi og analyser (3D immuno-FISH). Fordelen ved denne protokol er den kombinerede visualisering af DNA og bevarelse af proteinstrukturer. Vores erfaring på dette område har gjort det muligt for os at forbedre og forenkle eksisterende protokoller. Selv om vi har anvendt denne protokol til påvisning af DNA dobbeltstrengede brud i lymfocytter undergår rekombination, kan denne metode anvendes på andre proteiner og andre celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. DNA Probe Mærkning med fluoroforer: Nick Translation (~ 6 timer)
- Ren BAC DNA (fremstillet ved maxi-prep) eller plasmider eller PCR-produkter, alle resuspenderet i H2O, kan anvendes til mærkning. Bemærk, at for en robust FISH signal, bør prober spænde mindst 10 kb.
- Inkuber DNA i RNase A i 30 minutter ved 37 ° C (Alle reagenser er anført i tabel 1).
- Inkubér nick-translation reaktion i 2 timer ved 16 ° C (se tabel 2 og 3). Alternative metoder til direkte mærkning kan anvendes (Eksempel: FISH Tag, Invitrogen).
- Inaktivere reaktionsblandingen i en time ved -80 ° C eller natten over ved -20 ° C.
- Bestem probe størrelse på en 2% agarosegel. Den smøre skal være mellem 100 og 1.000 bp, med flertallet på ca 300-500 bp (Bemærk, at udstrygning af Cy5-sonder ikke er synlig). Hvis DNA ikke fordøjes nok, mere DNA Pol I ogDNase I kan tilsættes til reaktionsblandingen og inkuberes i yderligere to timer ved 16 ° C.
- Purify prober på 0,025 mm filtre i to liter bægerglas fyldt med H 2 0 for to timer i mørke.
- Læg blokerende faktorer til proberne som følger: 10 ug Cot-1-DNA, 10 ug af Hybloc DNA og 100 ug laksesperma til 10 ug af DNA-prober. Opbevar DNA-prober ved -20 ° C.
2. Probe Precipitation / Denaturering / Pre-annealing (3-4 hr)
- Mellem 0,3 pg og 1 pg DNA probe anvendes pr dækglas. Mix prober med 0,1 volumen 3 M NaAc (pH 5,2) og 2,5 volumener af 100% ethanol, inkuberes i en time ved -80 ° C eller natten over ved -20 ° C og centrifuger ved 13.000 rpm ved 4 ° C i 30 minutter. Bemærk, at størrelsen af DNA-proben kan justeres afhængigt af kvaliteten af DNA og den nukleare region hybridisering. Alternative metoder til direkte mærkning kan tillade anvendelsen af reducerede mængder afprobe. Til påvisning af multiple DNA FISH signaler på et lysbillede kan de forskellige prober udfældes sammen (med undtagelse af prober som ikke skal være for-udglødet, som gentagelsessekvenser). Prober til adskillige forsøg udført på samme tid kan også udfældes sammen. Pellets bør let farver afhængig af de fluoroforer, der anvendes (hvis små mængder prober udfældes, kan pelleten ikke synlige).
- Tørre pellets og resuspendere dem i 15 pi hybridiserings-puffer (se tabel 4) pr dækglas under omrystning (ved anvendelse af en Eppendorf Thermomixer) i mørke ved 37-45 ° C (i ca 20 min).
- Denaturere prober i 5 minutter ved 75-95 ° C.
- Pre-anneal prober ved 37 ° C i 30-60 min. Længden af før-annealing kan justeres afhængigt af kompleksiteten og kvaliteten af proberne.
- Anvend prober til dækglassene for hybridisering natten (se afsnit 3).
3. 3-Dimensional DNA FISH - First Day (~ 3 timer)
- Ikke-adhærente celler er koncentreret i et lille volumen 1 x PBS (~ 2x10 5 celler i 5-10 pi 1x PBS pr dækglas) og dryppet på midten af en poly-L-lysin-overtrukne dækglas. Adhærente celler skal dyrkes på dækglas i mindst 24 timer (~ 70% sammenflydning) (dækglas kan være overtrukket med 0,1% gelatine). Square 18x18 til 24-24 mm dækglas er placeret i 6-brønds plader, og i hele protokollen, to ml af hver opløsning, der anvendes per brønd (alternativt runde 1,5 mm dækglas kan placeres i 12/24-well plader).
- Fix celler i 2% paraformaldehyd / 1 x PBS, pH 7 til 7,4, i 10 minutter ved stuetemperatur (4% PFA lagre kan alikvoteret, opbevaret ved -20 ° C). Paraformaldehyd kan købes i opløsning (16%), eller 4% stamopløsninger kan fremstilles ud fra pulver / prills. Paraformaldehyd Pulveret opløses i 1 x PBS ved> 60 ° C (pH kan forøges til 8-9 at lette opløsning), afkølet og ned på is, indstiled til pH 7-7,4, filtreret, opdelt i portioner i falke og opbevares i flere uger ved -20 ° C.
- Efter tre skylninger i 1 x PBS, permeabilisere celler i ice-cold 0.4% Triton-X-100/1 x PBS i 5 minutter på is. Længde af permeabilisering kan justeres afhængigt af den celle-type NB:. Hvis DNA FISH er kombineret med immunofluorescens, bør immunfarvning udføres på dette tidspunkt (se afsnit 4).
- Efter tre skylninger i 1 x PBS, inkuber celler med 0,1 pg / pl RNase A i 1 x PBS i en time ved 37 ° C. Dækglas placeres celle nedad på en dråbe af 100 gl opløsning på parafilm eller en side i et fugtigt kammer. Dækglas derefter forsigtigt fjernet med pincet. Hvis nogen modstand, bør dækglas blive oversvømmet med 1 x PBS for at undgå beskadigelse af cellerne.
- Efter tre skylninger i 1 x PBS, permeabilisere celler i ice-cold 0.7% Triton-X-100 / 0,1 M HCI i 10 minutter på is.
- Efter tre skylninger in 1x PBS, denaturerer celler i 1,9 M HCI i 30 minutter ved stuetemperatur. Alternativt kan celler denatureres i 50% formamid / 2 x SSC ved 75-80 ° C i mindst 30 min. Bemærk, at hybridisering længde (og temperatur) kan optimeres afhængigt af celletype.
- Efter tre skylninger i iskold 1 x PBS, hybridiserer celler med prober natten over ved 37 ° C i et mørkt og fugtigt kammer. Dækglas placeres celle nedad på en dråbe på 15 ul probe på et objektglas og forseglet med gummi cement.
4. 3-dimensionel Immuno-FISH - First Day (~ 6-7 timer)
- For kombineret immunofluorescens / DNA FISH, bør immunofarvning udføres efter permeabilisering i 0,4% Triton-X-100 (trin 3.3).
- Cellerne inkuberes i blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur (2,5% okseserumalbumin (BSA), 10% normalt gedeserum, 0,1% Tween-20). Den blokerende opløsning filtreres, alikvoteret i 1,5 ml Eppendorfs og lagres for months ved -20 ° C.
- Cellerne inkuberes med det primære antistof dannet mod proteinet eller histon modifikation af interesse fortyndet i blokeringsopløsning, i en time ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Her viser vi et eksempel på et antistof mod phosphorylerede serin-139 i H2AX (γ-H2AX, Millipore, se tabel 5 for detaljer). Dækglas placeres celle nedad på en dråbe af 100 gl opløsning på parafilm eller en side i et fugtigt kammer. Dækglas derefter forsigtigt fjernet med pincet (oversvømmet med 1 x PBS om nødvendigt). Bemærk, at fortynding og inkubering længde kan justeres afhængigt af kvaliteten af antistoffet og celletyper.
- Vask cellerne i 0,2% BSA / 0,1% Tween-20/1 x PBS, tre gange 5 minutter ved stuetemperatur under omrystning.
- Cellerne inkuberes med den passende fluorofor-konjugeret sekundært antistof fortyndet i blokeringsopløsning i en time ved stuetemperatur i et mørkt og fugtigt kammer. Her viser vi et eksempel på påvisning med ensekundært gede-anti-muse-antistof (Alexa Fluor ® 488 eller 555, Invitrogen, se tabel 5 for detaljer). Hapten-konjugerede sekundære antistoffer (biotin, digoxigenin, etc.) kan også anvendes. I dette tilfælde kan et ekstra skridt for passende detektion (streptavidin, anti-dig osv) udføres enten før eller efter over-night DNA-FISH hybridisering.
- Skyl celler i 0,1% Tween-20/1 x PBS, tre gange 5 minutter ved stuetemperatur under omrystning i mørke.
- Post-fix celler i 2% paraformaldehyd / 1 x PBS i 10 minutter ved stuetemperatur i mørke.
- Fortsæt DNA FISH som ovenfor fra inkubation i RNase A (trin 3,4).
5. 3-dimensionel DNA FISH / Immuno-FISH - Anden dag (~ 2 timer)
- Fjern forsigtigt gummi cement, oversvømmelse dækglas med 2x SSC, fjernes forsigtigt med en pincet og placere dem i fordybninger indeholdende vaskeopløsning.
- Vask cellerne i 2 x SSC i 30 min ved 37 ° C i mørke under omrystning.
- Vask cellerne i 2 x SSC i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke under omrystning.
- Vask cellerne i 1 x SSC i 30 minutter ved stuetemperatur i mørke under omrystning Bemærk, at i tilfælde af denaturering med formamid, bør vask erstattes af følgende:. Tre gange vask i 50% formamid / 2 x SSC og 3 vaske i 2 x SSC, 5 min hver, ved 37 ° C.
- Montere celler i forlænge Gold montering medium indeholdende 1,5 ug / ml DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) til modfarvning af totalt DNA. Dækglas anbringes celle-side ned på et fald på 10-15 ul monteringsmedium på et objektglas og forseglet med neglelak. Objektglas opbevares i flere måneder ved -20 ° C.
6. 3D Microscopy and Analysis
- 3D-billeder kan erhverves med forskellige mikroskop systemer. I vores eksperimenter, er optiske dele adskilt af 0,3 um opsamlet på et Leica SP5 AOB'er konfokalt system (akustooptiske stråledeler). Bemærk, at adskillelsen mellem optical fly kan justeres afhængigt af den type analyse.
- 3D billedstakke kan analyseres ved hjælp af forskellige software og værktøjer. Vi bruger billedet J software til at vurdere afstandsmålinger mellem loci af interesse og analysere forskellige former for inddragelse af loci af interesse med sub-nukleare rum eller proteiner.
- Alle statistiske analyser er udført for at sammenligne to (eller flere) forskellige biologiske betingelser med parvis vurdering (er) af betydning: sammenligning mellem forskellige celletyper eller faser, sammenligning mellem forskellige loci af interesse. I alle statistiske test, P-værdier ≤ 5.00E-2 (a = 0,05) er taget for at være betydelig (1.00E-2 ≤ P ≤ 5.00E-2 * signifikant; 1.00E-3 ≤ P ≤ 1.00E-2 * * meget betydelige; P <1.00E-3 *** meget signifikant).
Statistisk analyse af hele fordelinger af afstande mellem to alleler. Vi først construct kumulative fordeling frekvenskurver over hele spektret af målte afstande mellem de to alleles.To vurdere betydningen af forskelle i fordelingerne af empiriske inter-allele afstande vi bruger den ikke-parametriske to stikprøver Kolmogorov-Smirnov (KS) test 13,14.
Statistisk analyse af tæt association (dvs. parring) af to alleler med en optimal afstand afskæring. At identificere området mest robuste forskelle i afstande mellem to alleler eller loci, bruger vi en serie af to-tail Fisher exact test 15 sek. Nemlig, at hver målt afstand vi tester, om en betingelse er signifikant overrepræsenteret på kortere afstande mellem de to prøver. Den mindste i fordelingen af p-værdier indikerer forskellige afstande, bør betragtes som en cut-off for tæt samarbejde (dvs. parring) af de to alleler. Efterfølgende den to-tail Fisher exact test anvendes to vurdere betydningen af parring af to alleler i den identificerede afskæringsværdi 15. Multiple test korrektioner at tage højde for det samlede antal Fisher test udført 16.
Statistisk analyse af associering af locuset af interesse med sub-nukleare rum eller proteiner. De to-tail Fisher-eksakt test bruges til at analysere betydningen af associering af locuset af interesse med forskellige rum eller proteiner 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
DNA og immuno-FISH anvendes i Skok laboratoriet at studere ændringer i nuklear organisering i forbindelse med fremgangsmåden ifølge V (D) J rekombination af antigen-receptor loci i B-og T-lymfocyt-udvikling. De teknikker beskrevet ovenfor giver os mulighed for i) måle afstande mellem de to ender af et locus (sammentrækning) ii) måle afstande mellem alleler eller loci (parring), iii) at analysere DNA-skader forekommer inden loci, iv) vurdere placeringen af alleler og loci i forhold til nukleare delrum (repressive pericentromeric heterokromatin i vores undersøgelse), og v) vurdere sammenslutning af nukleare proteiner på alleler og loci (sammenslutning af den phosphorylerede histon γ-H2AX i vores undersøgelse). Mere specifikt analyserede vi rollen som locus dynamik i reguleringen af V (D) J rekombination af de immunoglobulinloci i udviklingen B-celler 17-30, og i reguleringen af afstamning engagement mellem CD4 + og CD8 + Tceller 14. Vi vurderede også DNA-beskadigelse på en af T-cellereceptor-locuset, Tcra / d, i udviklingen af T-celler, der bærer en mutant form af rekombinasen protein RAG2 31.
Figur 1. Analyse af afstande mellem to alleler eller loci. (A) Konfokale sektioner viser repræsentative uparrede (til højre) eller parret (venstre) alleler i enkelte kerner. DNA'et FISH probe blev genereret fra et BAC (~ 200 kb) spænder over locus af interesse. Afstand mellem alleler blev målt mellem midten af massen af hver BAC signal i 3D billedstakke. Stiplede cirkler skitsere nucleus figurer. Scale bars = 1 um. (B) Kumulative frekvens fordelingskurver der viser hele området af afstande mellem de to allels målt i to forskellige biologiske betingelser (vildtype versus mutant). De ikke-parametrisk to stikprøver KS test blev anvendt til at vurdere betydningen af forskellene mellem de to fordelinger. Rækken af de fleste robuste forskelle i inter-allele afstande blev vurderet ved hjælp af en serie af to-tail Fisher eksakte test (blå prikker). De mest robuste P-værdier (højere punkter) blev fundet for de afstande omkring 1 um. Således cut-off for tæt samarbejde (dvs. parring) af de to alleler blev oprettet på 1 um. (C) Kumulative frekvens kurver viser afstandene mellem de to alleler 0-1,5 um i de to forskellige biologiske forhold. Betydningen af parring af de to alleler blev vurderet ved hjælp af to-hale Fisher eksakt test for en cut-off på 1 um. Klik her for at se større figur .
Figur 2. Analyse af placering af en locus i forhold til sub-nukleare rum. I vores undersøgelser har vi analysere forholdet mellem vores loci af interesse og den repressive sub-nukleare rum dannet af pericentromeric heterokromatin (PCH) 32. Alleler betragtes som placeret i PCH når BAC signal til locus af interesse er tilstødende eller overlapper γ-satellitsignal, der hybridiserer til PCH (ingen pixel i mellem kanterne af BAC-og γ-satellit-DNA-FISH-signaler). Konfokale sektioner repræsentative for placeringen af Tcra alleler i forhold til PCH: (Top) ingen allel placeret på PCH, (Middle) en allel på PCH, (Bund) to alleler i PCH. Locus i rød og γ-satellit i hvidt. Gule pile viser allelerne placeret på PCH. Stiplede cirkler skitsere nucleus figurer. Scale bar = 1 um.
Figur 3. Analyse af sammenslutningen af nukleare proteiner og histon ændringer på et locus. (A) I vores undersøgelser har vi analysere forholdet mellem vores loci af interesse og den phosphorylerede form af histon H2AX (γ-H2AX), som udlæsning for DNA dobbelt -strengede lejligheder 33. Konfokale afsnit vises eksempler på ingen γ-H2AX forening (Top) eller sammenslutning på én Tcra allel (bund) i enkelte kerner. Alleler blev defineret som forbundet med γ-H2AX hvis BAC signaler og immunofluorescens foci var mindst delvist overlappet (mindst en pixel i colokalisering). Locus er vist i rødt og γ-H2AX i hvid. Stiplede cirkler kontur nucleus former. Scale bar = 1 um. Det er at bemærke, at colokalisering analyser af BAC-signalet med PCH eller γ-H2AX foci udføres manuelt ved hjælp af billedet J software uden automatiseret tærskel. (B) tab af en del af γ-H2AX signal efter denaturering er en af de vigtigste tekniske spørgsmål rejst af denne immuno-DNA FISH protokol. Her viser vi et eksempel på immunfluorescens før (øverst) og efter (nederst) HCI-baserede denaturering behandling (Formamid-behandling gav lignende resultater (ikke vist)). Selv om signalet var svagere, de vigtigste træk ved den farvning, især antallet af foci, forbliver efter behandlingen. Ved hjælp af en SP5 Leica konfokal, indstillingerne for 561 laser før og efter denaturering var følgende: 35% effekt / smart gevinst på 730V, og 45% effekt / smart gevinst på 750V hhv. Endvidere viser vi her et eksempel på en immunfluorescensfarvning for en anden histon mNDRING, H3K27me3 (højre panel), der viser, at denne protokol kan anvendes på andre histon varemærker, som tidligere har været udgivet 1,3. γ-H2AX er vist i gult og H3K27me3 i rødt. Stiplede cirkler skitsere nucleus figurer. Scale bar = 2 um. Klik her for at se større figur .
| Navn på reagens / Material | Firma | Catalogm Nummer | Kommentarer |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | #C11397 til C-11401 | |
| Cy3 eller Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0,025 um filtre | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1-DNA 1 mg / ml | Invitrogen | # 18.440 | |
| Hybloc DNA 1 mg / ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Laksesperma | Sigma | # D1626 | pulver, der skal resuspenderes ved 10 mg / ml i H2O |
| NaAc (natriumacetat, pH 5,2, pufferopløsning) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol kvalitet) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidon (Mol Biol kvalitet) | Fisher | # BP431 | |
| Dextransulfat pulver | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (saltvand-natriumphosphat-EDTA) 20x opløsning | Fisher | # BP1328 | |
| Formamid | Fisher | # BP227 | |
| Dækglas | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-brøndsplader | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Sigma | # P8920 | ||
| Paraformaldehyd, prills, 95% | Sigma | # 441.244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol kvalitet | Sigma | # T8787 | |
| BSA (bovint serumalbumin) fraktion V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normalt gedeserum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol kvalitet | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline natriumcitrat) 20x opløsning | Fisher | # BP1325 | |
| Forlæng Guld antiblegemiddel reagens | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4 ',6-diamidino-2-phenylindol) | Sigma | # D9542 | |
| Best test ét lag gummi cement | Kunst eller på kontoret levering butikker |
Tabel 1. Specifikke reagenser og mindre udstyr.
| NT med dUTP koblet med Alexa-fluoroforer | Beløb | Slutkoncentration |
| 10 ug DNA | X pi | |
| RNase A - 0,17 pg / pl | 10 ul | |
| H2O | Fyld til 260 gl | |
| ALT - 30 minutter ved 37 ° C | 260 gl | |
| 10x NT buffer | 50 pi | 1x |
| 100 mM & væreta;-mercaptoethanol | 50 pi | 10 uM |
| dNTP-blanding | 40 ul | 40 uM af hver dNTP |
| 0,1 mM dTTP | 50 pi | 10 uM |
| 1 mM Alexa dUTP | 12 gl | 30 uM |
| DNase I (arbejdsopløsning, se tabel nedenfor) | 30 pi | |
| DNA Pol I | 7,5 gl | 15 U / ml |
| ALT - 2 timer ved 16 ° C | 500 pi | |
| NT med dUTP koblet med Cy3 eller Cy5 | Beløb | Slutkoncentration |
| 10 ug DNA | X pi | |
| RNase A - 0,17 pg / pl | 10 ul | |
| H2O | Fyld til 300 gl | |
| ALT - 30 minutter ved 37 ° C | 300 gl | |
| 10x NT buffer | 50 pi | 1x |
| 100 mM β-mercaptoethanol | 50 pi | 10 uM |
| dNTP-blanding | 50 pi | 50 uM af hver dNTP |
| 1 mM Cy3-eller Cy5-dUTP | 12 gl | 30 uM |
| DNase I | ~ 30 ul | ~ 1,2 U / gl |
| DNA Pol I | 7,5 gl | 15 U / ml |
| ALT - 2 timer ved 16 ° C | 500 pi |
Tabel 2. RNase A-behandling og Nick Translation i 10 ug DNA.
| Løsninger | Lagre | |
| RNase A | Arbejde løsning: 0,17 pg / pl | Fremstilles frisk |
| 10x NT-puffer: | 0,5 M Tris-HCI, pH 8, 50 mM MgCl2, 0,5 mg / ml BSA | 1,5 ml rør ved -20 ° C. |
| dNTP mix: | dATP, dCTP og dGTP: 0,5 mM hver i H2O | 1,5 ml rør ved -20 ° C |
| DNase I: | Stamopløsning: rekonstitueret ved 20.000 U / ml i 20 mM Tris pH 7.5/50% glycerol/50 mM NaCI | 0,5 ml rør ved -20 ° C |
| Arbejdsopløsning: Hver ny batch af DNase I stamopløsning skal testes ved forskellige fortyndinger (10 U / ml, 20 U / ml og 40 U / ml i H2O). Den fortynding, der gav et DNA-smear mellem 100 og 1.000 bp (setrin 5) anvendes som arbejdsopløsningen. | Fremstilles frisk |
Tabel 3. Løsninger til RNase A behandling og Nick Translation.
| Hybridiseringsbuffer | Løsninger | Lagre | |
| 10% | 50x Denhardts opløsning: | 1 g Ficoll ® 400, 1 g polyvinylpyrrolidon og 100 ml H 2 0 - Filtreret | 50 ml falcon ved -20 ° C |
| 40% | 25% dextransulfat: | Dextransulfat Pulveret opløses i 12,5 x SSPE ved 37-65 ° C | 50 ml falcon ved -20 ° C |
| 50% | Formamid | Flasker ved +4 ° C | |
| Portioner på 1,5 ml Eppendorfs opbevares ved -20 ° C | |||
Tabel 4. Hybridiseringspuffer.
| Antistoffer | Leverandør | Katalog nummer | Fortynding |
| γ-H2AX - phospho H2A.X, klon JBW301, monoklonale muse | Millipore | # 05.636 | 1/200 |
| H3K27me3, klon, kaninpolyklonalt | Millipore | # 07.449 | 1/200 |
| Alexa Fluor 555 Donkey Anti-mus | Invitrogen | # A-31.570 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 gede anti-mus | Invitrogen | # A-11.001 | 1/500 |
| Alexa Fluor 488 gede anti-kanin | Invitrogen | # A-11.008 | 1/500 | </ Tr>
Tabel 5. Primære og sekundære antistoffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknikkerne beskrevet ovenfor blev anvendt i vores laboratorium til analyse reguleringen af V (D) J rekombination af immunoglobulinet og Tcra / d loci i udviklingen af lymfocytter 30,31. Vi tror på, at denne teknik kan tilpasses til påvisning af forskellige nukleare proteiner, nukleare rum og loci, i forskellige celletyper. Ændringer af protokollen kan være nødvendig, og i dette tilfælde de vigtigste trin til at fokusere på, er følgende. For det første kan længden af permeabilisering justeres afhængigt af celletype. Andet længden af det primære antistof inkubering kan også justeres i overensstemmelse med kvaliteten af antistoffet og overflod af proteinet af interesse (for eksempel i nogle tilfælde kan inkubationen udføres natten over ved 4 ° C). Vigtigt er det, kan det denatureringstrin tilpasses, og HCI-behandling kan erstattes af denaturering i formamid 3,4,34 og NaOH for DNA FISH 20. Også gentageed fryse-tø cykler af flydende nitrogen kan anvendes til cellerne efter fiksering / permeabilisering for DNA FISH alene 4,34. Endelig, mens flere histon modifikationer, RNA-polymerase II og co-faktorer er blevet påvist under anvendelse af denne metode 30,35, kan immunfarvning for andre kerneproteiner udføres efter DNA FISH hybridisering 4.
3D-billede analyse kan indebære brug af forskellige typer af mikroskoper, herunder bred felt epifluorescens (kombineret med dekonvolution) og konfokal laser mikroskopi 36. Valget af den billeddannende metode vil afhænge af den ønskede opløsning, antallet af fluoroforer, dybden af prøverne og kvaliteten af DNA og protein signaler. Udviklingen af nye højopløselige mikroskoper åbner en helt ny avenue i præcis visualisering af nukleare og cellulære processer 37-39. Endvidere nye teknikker til generation af skræddersyede prober, der ikke indeholder repetitive sekvens gøre det muligt rent påvisning af genomiske regioner, fra en 15-kb specifik locus, til komplekse puljer af exonerne 40. Dette øger nøjagtigheden og følsomheden af høj opløsning mikroskopi i at spore dynamikken i nukleare processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke medlemmerne af Skok lab, især Susannah Hewitt, for diskussioner og kommentarer. Dette arbejde er støttet af National Institute of Health tilskud R01GM086852, RC1CA145746 (JAS). JAS er en Leukemia & Lymphoma Society lærd. JC er en Irvington Institute Fellow af Cancer Research Institute. MM er støttet af en National Science Foundation Grant Integrativ Graduate Uddannelse og Forskning praktik (NSF IGERT 0.333.389).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| H2O | Fisher | # BP2470 | |
| RNase A | Sigma | # R4642 | |
| dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
| Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
| Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
| DNase I | Roche | # 04536282001 | |
| DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
| 0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
| Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
| Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
| Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
| NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
| Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
| Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
| Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
| SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
| Formamide | Fisher | # BP227 | |
| Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
| Slides | Fisher | # 12-550 | |
| 6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
| PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
| Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
| Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
| Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
| BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
| Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
| Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
| SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
| ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
| Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
| Table 1. Specific reagents and small equipment. | |||
References
- Chaumeil, J., Okamoto, I., Heard, E. X-chromosome inactivation in mouse embryonic stem cells: analysis of histone modifications and transcriptional activity using immunofluorescence and FISH. Methods in enzymology. , 376-405 (2004).
- Cremer, M., et al. Multicolor 3D fluorescence in situ hybridization for imaging interphase chromosomes. Methods Mol. Biol. 463, 205-239 (2008).
- Chaumeil, J., Augui, S., Chow, J. C., Heard, E. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol. Biol. 463, 297-308 (2008).
- Solovei, I., Cremer, M. 3D-FISH on cultured cells combined with immunostaining. Methods Mol. Biol. 659, 117-126 (2010).
- Markaki, Y. The potential of 3D-FISH and super-resolution structured illumination microscopy for studies of 3D nuclear architecture: 3D structured illumination microscopy of defined chromosomal structures visualized by 3D (immuno)-FISH opens new perspectives for studies of nuclear architecture. BioEssays : news and reviews in molecular, cellular and developmental biology. 34, 412-426 (2012).
- Heard, E., Bickmore, W. The ins and outs of gene regulation and chromosome territory organisation. Current opinion in cell biology. 19, 311-316 (2007).
- Misteli, T. Beyond the sequence: cellular organization of genome function. Cell. 128, 787-800 (1016).
- Fraser, P., Bickmore, W. Nuclear organization of the genome and the potential for gene regulation. Nature. 447, 413-417 (2007).
- Cremer, T., et al. Chromosome territories--a functional nuclear landscape. Current opinion in cell biology. 18, 307-316 (2006).
- Mao, Y. S., Zhang, B., Spector, D. L. Biogenesis and function of nuclear bodies. Trends in genetics : TIG. 27, 295-306 (2011).
- Dostie, J., Bickmore, W. A. Chromosome organization in the nucleus - charting new territory across the Hi-Cs. Current opinion in genetics & development. 22, 125-131 (2012).
- van Steensel, B., Dekker, J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture. Nature. 28, 1089-1095 (2010).
- Massey, F. J. The Kolmogorov-Smirnov Test for Goodness of Fit. Journal of the American Statistical Association. 253, 1951 (1951).
- Collins, A., et al. RUNX transcription factor-mediated association of Cd4 and Cd8 enables coordinate gene regulation. Immunity. 34, 303-314 (2011).
- Fisher, R. A. On the interpretation of χ2 from contingency tables, and the calculation of P. Journal of the Royal Statistical Society. 85, 87-94 (1922).
- Benjamini, Y. H., Yosef, Controlling the false discovery rate: a practical and powerful approach to multiple testing. Journal of the Royal Statistical Society, Series B (Methodological). 57, 125-133 (1995).
- Fitzsimmons, S. P., Bernstein, R. M., Max, E. E., Skok, J. A., Shapiro, M. A. Dynamic changes in accessibility, nuclear positioning, recombination, and transcription at the Igkappa locus. J. Immunol. 179, 5264-5273 (2007).
- Fuxa, M., et al. Pax5 induces V-to-DJ rearrangements and locus contraction of the immunoglobulin heavy-chain gene. Genes Dev. 18, 411-422 (2004).
- Goldmit, M. Epigenetic ontogeny of the Igk locus during B cell development. Nature. 6, 198-203 (2005).
- Hewitt, S. L. Association between the Igk and Igh immunoglobulin loci mediated by the 3' Igk enhancer induces 'decontraction' of the Igh locus in pre-B cells. Nature. 9, 396-404 (2008).
- Johnson, K. IL-7 Functionally Segregates the Pro-B Cell Stage by Regulating Transcription of Recombination Mediators across Cell Cycle. Journal of Immunology. , (2012).
- Karnowski, A., et al. Silencing and nuclear repositioning of the lambda5 gene locus at the pre-b cell stage requires Aiolos and OBF-1. PLoS ONE. 3, e3568 (2008).
- Kosak, S. T. Subnuclear compartmentalization of immunoglobulin loci during lymphocyte development. Science. 296, 158-162 (2002).
- Liu, H., et al. Yin Yang 1 is a critical regulator of B-cell development. Genes Dev. 21, 1179-1189 (2007).
- Parker, M. J. The pre-B-cell receptor induces silencing of VpreB and lambda5 transcription. Embo J. 24, 3895-3905 (2005).
- Roldan, E., et al. Locus 'decontraction' and centromeric recruitment contribute to allelic exclusion of the immunoglobulin heavy-chain gene. Nature immunology. 6, 31-41 (2005).
- Skok, J. A. Nonequivalent nuclear location of immunoglobulin alleles in B lymphocytes. Nature. 2, 848-854 (2001).
- Skok, J. A. Reversible contraction by looping of the Tcra and Tcrb loci in rearranging thymocytes. Nature immunology. 8, 378-387 (2007).
- Xiang, Y., Zhou, X., Hewitt, S. L., Skok, J. A., Garrard, W. T. A multifunctional element in the mouse Igkappa locus that specifies repertoire and Ig loci subnuclear location. Journal of Immunology. 186, 5356-5366 (2011).
- Hewitt, S. L. RAG-1 and ATM coordinate monoallelic recombination and nuclear positioning of immunoglobulin loci. Nature immunology. 10, 655-664 (2009).
- Deriano, L., et al. The RAG2 C terminus suppresses genomic instability and lymphomagenesis. Nature. 471, 119-123 (2011).
- Brown, K. E., Baxter, J., Graf, D., Merkenschlager, M., Fisher, A. G. Dynamic repositioning of genes in the nucleus of lymphocytes preparing for cell division. Molecular cell. 3, 207-217 (1999).
- Fernandez-Capetillo, O., Lee, A., Nussenzweig, M., Nussenzweig, A. H2AX: the histone guardian of the genome. DNA repair. 3, 959-967 (2004).
- Croft, J. A., et al. Differences in the localization and morphology of chromosomes in the human nucleus. The Journal of cell biology. 145, 1119-1131 (1999).
- Chaumeil, J., Le Baccon, P., Wutz, A., Heard, E. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Walter, J., et al. Towards many colors in FISH on 3D-preserved interphase nuclei. Cytogenetic and genome research. 114, 367-378 (2006).
- Toomre, D., Bewersdorf, J. A new wave of cellular imaging. Annual review of cell and developmental biology. 26, 285-314 (2010).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. The Journal of cell biology. 190, 165-175 (2010).
- Dobbie, I. M. OMX: a new platform for multimodal, multichannel wide-field imaging. Cold Spring Harbor protocols. , 899-909 (2011).
- Boyle, S., Rodesch, M. J., Halvensleben, H. A., Jeddeloh, J. A., Bickmore, W. A. Fluorescence in situ hybridization with high-complexity repeat-free oligonucleotide probes generated by massively parallel synthesis. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. 19, 901-909 (2011).
