Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-DNA FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar.
3D konfokal mikroskopi ardından 3 boyutlu korunmuş çekirdekleri üzerinde DNA problar kullanılarak floresan in situ hibridizasyon (3D DNA FISH) bireysel hücrelerin alt bölgeler kromozomal gen lokuslarının yeri veya tüm ülkelerle görselleştirmek için en doğru yolu gösterir. Bu tip analiz çekirdeğin küresel mimari gibi nükleer boşluk içinde belirli lokus ve genomik bölgenin davranışının fikir verir. Immunofluorescence, diğer taraftan, nükleer proteinlerin tespiti (modifiye edilmiş histon, histon türevleri ve değiştiriciler, transkripsiyon faktörleri ve makine, nükleer alt-bölme, vb) izin verir. Immünofloresan ve 3B DNA FISH birleştirme içinde önemli bir sorun çekirdeğin 3D mimarisi yanı sıra antikor tarafından tespit edilen epitopu korumak için bir taraftan, ve diğer taraftan, DNA prob nüfuz tespit etmesi için gen lokus veya kromozom bölgeleri 1-5. Burada 3D korunmuş çekirdeklerinde genomik lokus ile kromatin modifikasyonları görselleştirme birleştiren bir protokol sağlar.
Epigenetik mekanizmalar tetik kuruluş ve gelişim ve hücre tipi özel transkripsiyonel profilleri kalıtım. Bir düzeyde bu aktif veya sessiz genomik bölgelerde tanımlar kromatin paketlenmesi modülasyonu içerir. Daha büyük ölçekte, genom ve nükleer mimarisinin küresel 3D organizasyonu da transkripsiyonel desen kontrolünde bir rol oynamaktadır. Böylece, bu epigenomic özelliklerin diseksiyonu genler 6-11 düzenlenir nasıl tam bir anlayış için önemlidir.
Kombine immünofloresan ve 3D DNA FISH spesifik etkileşimler / çekirdeğin içinde DNA dizileri ve / veya protein dernekler değerlendirerek, biyokimyasal ve moleküler analizler tamamlamak için eşsiz bir fırsat sunmaktadır. Bunun yanında, bu tür kromatin immünopresipitasyon (ChIP-seq) veya derin dizileme ile birleştiğinde kromozom yakalama konformasyon olarak genom yüksek verimlilik teknikleri (4C-seq, 5C, Hi-C) küresel dat sağlamakhücre popülasyonlarının 12 üzerinde, immünofloresan / DNA FISH teknikleri tek hücre düzeyinde analiz sağlar.
Burada 3D mikroskopi ve analizler (3D immuno-FISH) izledi DNA FISH immünofloresan ve DNA dizileri tarafından histon modifikasyonları eşzamanlı tespiti için bir protokol açıklar. Bu protokolün avantaj DNA ve protein yapılarının korunması kombine görselleştirme olduğunu. Bu alanda tecrübemiz mevcut protokoller geliştirmek ve kolaylaştırmak için bize sağladı. Bu rekombinasyon geçiren lenfosit çift-sarmallı DNA mola tespit etmek için bu protokol kullanılmıştır, ancak bu yöntem, diğer proteinlere ve diğer hücre türleri uygulanabilir.
Yukarıda ayrıntılı teknikler lenfositler 30,31 geliştirme İmmunoglobulin ve Tcra / d loci V (D) J rekombinasyon düzenleme analiz etmek için, laboratuar kullanılmıştır. Biz bu tekniği farklı hücre tiplerinde çeşitli nükleer proteinler, nükleer bölmeleri ve lokus tespiti için adapte edilebilir eminiz. Protokol değişiklikler gerekli olabilir, ve bu durumda, odaklanmak için önemli adımlar aşağıdaki gibidir. İlk olarak, geçirgenliği uzunluğu hücre tipine bağlı …
The authors have nothing to disclose.
Biz tartışmalar ve yorumlar için Skok laboratuar, özellikle Susannah Hewitt, üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık hibe Ulusal Enstitüsü R01GM086852, RC1CA145746 (JAS) tarafından desteklenmektedir. JAS Bir Lösemi ve Lenfoma Derneği bilgindir. JC Kanser Araştırma Enstitüsü Irvington Enstitüsü üyesidir. MM Ulusal Bilim Vakfı Hibe Bütünleştirici Lisansüstü Eğitim ve Araştırma Staj (NSF IGERT 0333389) tarafından desteklenmektedir.
Name of Reagent/Material | Company | Catalogue Number | Comments |
H2O | Fisher | # BP2470 | |
RNase A | Sigma | # R4642 | |
dNTP | Sigma | # DNTP100 | |
Alexa dUTP | Invitrogen | # C11397 to C-11401 | |
Cy3 or Cy5 dUTP | Fisher | # 45-001-xxx | |
DNase I | Roche | # 04536282001 | |
DNA Pol I | Biolabs | # M0209 | |
0.025 μm filters | Millipore | # VSWP02500 | |
Cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | # 18440 | |
Hybloc DNA 1 mg/ml | Applied Genetics | # MHB | |
Salmon sperm | Sigma | # D1626 | powder to be resuspended at 10 mg/ml in H2O |
NaAc (Sodium Acetate, pH 5.2, buffer solution) | Sigma | # S7899 | |
Ficoll 400 (Mol Biol grade) | Fisher | # 525 | |
Polyvinylpyrrolidone (Mol Biol grade) | Fisher | # BP431 | |
Dextran sulfate powder | Sigma | # D8906 | |
SSPE (Saline-Sodium Phosphate-EDTA) 20x solution | Fisher | # BP1328 | |
Formamide | Fisher | # BP227 | |
Coverslips | Fisher | # 12-548-B | |
Slides | Fisher | # 12-550 | |
6-well plates | Fisher | # 0720080 | |
PBS, 10x | Fisher | # MT-46-013-CM | |
Poly-L-lysine solution | Sigma | # P8920 | |
Paraformaldehyde, prills, 95% | Sigma | # 441244 | |
Triton-X-100, Mol Biol grade | Sigma | # T8787 | |
BSA (Bovine Serum Albumin) Fraction V | Fisher | # BP 1600 | |
Normal goat serum | Vector Labs | # S-1000 | |
Tween-20, Mol Biol grade | Sigma | # P9416 | |
SSC (Saline Sodium Citrate) 20x solution | Fisher | # BP1325 | |
ProLong Gold antifade reagent | Invitrogen | # P36930 | |
DAPI (4′,6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma | # D9542 | |
Best test one coat rubber cement | Art or office supply stores | ||
Table 1. Specific reagents and small equipment. |