우리는 endomembrane 파열을 추적하는 방법을 설명하면 세포 내 박테리아에 의해 이끌어<em> 시겔 flexneri<em></em</em>와<em<em><em> 결핵균</em></em</em> 숙주 세포 침입시. 우리의 분석은 CCF4를 사용한다, 세포질 호스트는 라이브 또는 고정 된 세포에서 프로브를 무서워. 이 기자는 세균의 표면에 효소 활성의 존재에 의해 저하됩니다.
시겔 flexneri는 endocytic 공포에 입력 숙주 세포에 침입 병원성 세균이다. 그 후,이 막 동봉 된 구획의 파열, 박테리아 세포질 내에서 이동할 수 있습니다 급증하고 추가 주변 세포를 침공. 결핵균이 면역 세포에 의해 phagocytosed 세포이며, 최근 대식 세포의 파열 막의 phagosomal로 표시되었습니다. 우리는 시겔 flexneri 또는 결핵균의 숙주 세포 기입 한 후, 막의 phagosomal 중단을 추적하기위한 강력한 분석을 개발했다. 방법은 CCF4를 사용합니다,이 숙주 세포의 세포질에서 평형을 β-lactamase의에 민감한 기자 무서워. 박테리아가 막 동봉 된 구획에 상주으로 세균성 병원체에 의한 숙주 세포의 침공에, 프로브만큼 그대로 유지됩니다. 즉시 세포 내 병원균의 클리브 CCF4의 표면에 공포, β-lactamase의 활동 중단 후 리드신호를 FRET의 손실 ING 및 발광 스펙트럼을 전환. 이 강력한 비례 분석이 침입 박테리아에 의해 유도 된 액포 파열의 타이밍에 대한 정확한 정보를 얻을 수, 그리고 그것은의 방출 신호의 검출을위한 전문적인 알고리즘에 의해 자동으로 현미경 및 이미지 프로세싱에 결합 할 수있는 것은 기증자와 수용체를 무서워. 또한, 단일 세포에서 실시간으로 세포 내 세균에 의해 이끌어 액포 장애의 역학을 조사 할 수 있습니다. 마지막으로, 그것은 완벽하게 이전의 방법을 초과하는 시공간적 해상도 높은 처리량 분석에 적합합니다. 여기, 우리는 시겔 flexneri뿐만 아니라 결핵균 marinum, 진균의 bovis 등 여러 마이코 박테리아 균주를 사용하여 시간 경과 실험 또는 최종 점 실험 헬라 세포와 THP-1 대식 세포에 CCF4 액포 파열 분석을위한 모범적 인 프로토콜의 실험 세부 사항을 제공 그리고 결핵.
수많은 세균 병원균 감염의 그들의 과정 진핵 세포의 막 동봉 된 구획에 내장되어 있습니다. 대 식세포에 의해 섭취, 또는 병원균에 적극적으로 일반적으로 비 식세포 세포로 자신의 이해를 유도하는 결핵균의 경우는 같은 셀 항목은 전문 숙주 세포에 의한 식균 작용을 통해 하나 발생합니다. 유도 흡수의 경우, 시겔 flexneri 예를 들어, 병원체는 다른 세포의 기능 endosomal 구획 1,2에서 세균 현지화의 결과로 단단히 규제 endomembrane 정렬 기계 사이에 납치 호스트 세포질에 효과기 단백질을 삽입합니다. 그 후, 시겔은 액포 파열 및 호스트 멤브레인 인신 매매와 리소좀을 피하는 배달을 방해하는 병원체의 세포질 액세스로 이어지는 바깥 막 방해. 더 최근에, phagolysosomal 파열은 감염 STR로 발견되었습니다ategy 결핵균, 독점적으로 막 바인딩 된 구획 3,17에서 지역화 할 수있는 오랜 시간 동안 생각했다 병원균에 의해 사용됩니다.
침입 병원균의 세포 내 막 밀매의 역학을 조사하기 위해, 큰 개선은 4,5 1980 년대 후반의 연구를 기반으로 투과 전자 현미경 (TEM) 이후에 달성되었다. 예를 들어, 염료를 사용하여 형광 현미경 기반의 방법은 세균 표면의 구성 요소 또는 세포 내 구획과 공동 현지화 마커에 대한 항체는 6.7 이상했다. 그러나, 그들은 여전히 정확한 시공간적 해상도와 양적 세균성 병원체에 의해 액포 파열을 측정하는 견고성을 양보하지 않습니다.
이 장애물은 먼저 유전자 발현 8을 연구하는 데 사용 된 세 팔로 스포린 무서워 CCF4-AM 파생 기자에 따라 분석과 해결되었습니다. 그런 다음이 INF의 맥락에서 사용 된ection 생물학 이펙터 분비를 조사하고 숙주 세포 9,10,11로 네이 세리아의 이해를 따르십시오. 우리는 시겔 flexneri 12 결핵균 (17)에 의해 유도 된 액포 파열을 공부이 기자의 활용 분석을 개발했다. 우리의 방법의 원리는 시겔 flexneri를 사용하여 그림 1에 설명되어 있습니다. 첫째, 숙주 세포는 오전 에스테르 잔기를 쪼개는 후 세포질 안에 갇혀 무서워 CCF4-AM 기판과로드됩니다. 그런 다음, 세포 시겔 flexneri에 감염됩니다. 박테리아의 표면에 β-lactamase의 존재는 곧 액포 파열로 발생 다니엘 CCF4 기판 수 있습니다. 이 405 nm에서 프로브 여기에 450 nm의 535 nm의에서 방출 피크를 전환 FRET 신호의 손실로 연결됩니다. 535분의 450 nm의 강도의 비례 측정 액포 무결성을 강조 : 낮은 비율은 막 ko를 반영높은 비율 반면, 폐쇄 또는 세포 외 박테리아 박테리아와 호스트 세포질 사이의 접촉을 반영합니다. 우리는 또한 THP-1 대식 세포에서 결핵균에 의한 phagosomal 파열을 공부하고이 방법의 적응을보고합니다. 순서가 CCF4-AM로드 만 세균 감염 후 적용 반전되어 있지만 실험 원리는 동일하게 유지됩니다.
따라서, 단일 세포 수준에서 양적 비례 형광 측정을 통해, 시겔 flexneri의 액포 파열 실시간으로 다른 세포 유형 12,13,14에서 고정 된 샘플에서 추적 할 수 있습니다. 또한,이 방법은 Mycobacterium의 bovis와 결핵을 사용하여이 연구에서와 같이 다른 침입 병원균의 숫자에 적용 할 수 있습니다. 마지막으로, 잘 96 (또는 잘 384) 우리의 프로토콜 형식의 소형화는 높은 처리량에 여러 조건을 검사 할 수 있습니다.
CCF4-AM/β-lactamase 분석은 세포 내 시겔 flexneri 다른 세포 유형에서 결핵균에 의해 유도 된 액포 중단을 추적하는 간단한 방법입니다. 그것은 박테리아의 표면에 활성 효소에 의해 쪼개 lactamase의 민감한 세포질 무서워 기자를 사용합니다.
CCF4-AM 기판의 손실은 쉽게 기판로드 한 후 모든 솔루션 프로 베네 시드를 추가하여 피할 수 있습니다. 알 수 있듯이, 분석은 여러 종류의 세포 (상피 세포, 탐식 세포)과 형식 (96도, 35mm 유리 바닥 요리 6/12/24 잘 접시)에 적용 할 수 있습니다. 6/12/24 잘 플레이트의 사용, 멸균의 coverslips는 세포를 파종하기 전에 각 우물의 바닥에 배포됩니다. 실험의 끝에, 커버 슬립은 골드 Antifade 시약 (Invitrogen 사)를 연장과 같은 설치 매체에 슬라이드에 전송됩니다. 이 방법은 신호를 분석 후 긴 시간 동안 안정샘플은 고정 후 PBS에 보존 된 96 웰 형식으로 비교했다. CCF4-AM 기판의 높은 비용은 샘플 볼륨을 결정하기 전에 고려되어야한다. 우리가 그들을 확장 좋습니다 이유입니다. 실험 6/12/24 잘 형식으로 더 비싸지 만 신호가 일간 안정합니다. 반대로, 실험은 96도 형식으로 저렴하지만 샘플은 실험의 날에 분석해야합니다. 그것은 실제 실험도 96도 또는 384도 형식에서 수행 할 수있는 주목할 만하다. 이 아니라 당 위치의 숫자를 동시에 (돌연변이 박테리아, MOI, 플라스미드 또는 siRNA를 transfection을, 화학 등)에서 조건 수십을 사용하여 실시간 실험을 수행 할 수 있습니다. 시겔 flexneri에 적합하지만, 우리는 감염주기가 세포질에서 유지 될 수 CCF4의 측정 농도를 초과하여 "true"로 실시간 또는 시간 경과 실험 결핵균 연구에 적합하지 것을 강조 표시합니다. 용이러한 이유는 CCF4-AM 기판은 침략이 달성 된 후에 만 셀에 적용됩니다.
MetaMorph 소프트웨어가 수집 및 분석에 사용되는 경우에, 우리는 잘 당 사진의 지정된 번호와 전체 384분의 96 잘 플레이트를 획득 할 수 있습니다 모듈 "화면 취득"을 사용하는 것이 좋습니다. 또한, 모듈 "리뷰 스크린 데이터는"수 (나는) 큰 "포스터"에 동시에 모든 채널에 대해 잘 각각의 바느질 그림 모자이크를 시각화하고 (II) 535 농도를 측정하기위한 특수 알고리즘을 반복하고 450 nm의 채널. 비록 우리가 시간 경과 현미경을 사용하여 하나의 박테리아에 의해 액포 파열을 측정 할 수 있었다, 우리는 렌더링 개별 박테리아의 표면에 효소 활동이 어려운 정확하게 세포 내 박테리아와 액포의 효과의 수의 상관 관계를 변화하는주의하고 싶습니다 파열.
분석의 견고성을 감안할 때, 그것은 시간에 적합합니다고등학교의 처리량은 96 또는 384도 형식으로 접근한다. 우리는 또한 성공적으로 정지 16 세포의 감염을 연구하는 FACS 분석을 위해이 프로토콜을 적용했다. 분석은 광범위한 애플리케이션에 이르는 자신의 표면에 lactamase를 제시 다른 세균이나 사업자의 조사에 사용할 수 있습니다. 예를 들어,이 방식은 같은 β-lactamase를 표현하는 레지오넬라 pneumophila를, 리스테리아 또는 살모넬라 티피 뮤 리움 12 같은 다른 병원체에 의해 유도 된 액포 파열을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 리스테리아는 시겔 flexneri에 비해 짧은 감염주기를 가지고 있기 때문에, 시간 경과 실험이 가능합니다. 반면에, 때문에 레지오넬라 pneumophila를하고 살모넬라 티피 뮤 리움 디스플레이 긴 감염주기, 우리는 종점 실험을 수행하는 것이 좋습니다.
가능한 응용 프로그램의 다양한 CCF4-AM/β-lactamase 분석한다고정 샘플 실시간으로 세포 내 병원균에 의해 유도 된 액포 파열을 추적 흥미 형광 방법.
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 회사 직원 국립 부어 라 공들인 의해 유럽 연구위원회에 의해 투자되었다.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |