Summary
Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias intracelulares
Abstract
Shigella flexneri são bactérias patogênicas que invadem células hospedeiras que entram em um vacúolo endocytic. Subsequentemente, a ruptura de membrana deste compartimento fechado permite que as bactérias para se deslocar dentro do citossol, proliferar e invadir mais células vizinhas. Mycobacterium tuberculosis é fagocitado por células do sistema imune, e, recentemente, tem sido demonstrado que a ruptura da membrana phagosomal em macrófagos. Nós desenvolvemos um teste robusto para rastreamento ruptura da membrana phagosomal após a entrada de Shigella flexneri ou Mycobacterium tuberculosis célula hospedeira. A abordagem faz uso de CCF4, um repórter sensível a FRET β-lactamase que se equilibra no citosol das células do hospedeiro. Após a invasão das células do hospedeiro por patogénios bacterianos, a sonda permanece intacta enquanto as bactérias residem em compartimentos por membranas. Após interrupção da, actividade β-lactamase vacúolo na superfície dos organismos patogénicos intracelulares cliva CCF4 instantaneamente levarção a uma perda de FRET sinal de comutação e o seu espectro de emissão. Este ensaio radiométrico robusta produz informação precisa sobre o momento de ruptura vacuolar induzido pelas bactérias invasoras, e pode ser acoplado a microscopia automatizado e de processamento de imagem por meio de algoritmos especializados para a detecção dos sinais de emissão do dador e aceitador de FRET. Além disso, permite investigar a dinâmica de ruptura vacuolar provocada por bactérias intracelulares, em tempo real, em células individuais. Finalmente, é perfeitamente adequado para a análise de alto rendimento com uma resolução espaço-temporal superior a métodos anteriores. Aqui, nós fornecemos os detalhes experimentais de protocolos de exemplares para o vacuolar ensaio CCF4 ruptura em células HeLa e THP-1 macrófagos para experimentos de lapso de tempo ou pontos finais experimentos usando Shigella flexneri, bem como várias cepas de micobactérias, como Mycobacterium marinum, Mycobacterium bovis, e Mycobacterium tuberculosis.
Introduction
Numerosas bactérias patogênicas são internalizados em compartimentos por membranas de células eucarióticas durante o curso da infecção. Entrada de célula ocorre através de fagocitose por células hospedeiras especializados, como é o caso para o Mycobacterium tuberculosis, que são ingeridas por macrófagos, ou os patógenos induzir activamente a sua absorção em células normalmente não fagocíticas. No caso da absorção de induzido, por exemplo, para a Shigella flexneri, o patógeno injecta proteínas efectoras para o citosol de acolhimento que sequestram entre outras funções celulares do endomembranar máquinas triagem firmemente regulado resultando em localização bacteriana dentro de um compartimento endossomal 1,2. Subsequentemente, Shigella rompe a membrana envolvente que leva à ruptura vacuolar e acesso citosólica do patógeno interferir com o tráfico de membrana de acolhimento e evitar a entrega ao lisossoma. Mais recentemente, a ruptura phagolysosomal também foi encontrado como str infecçãoategy usado por Mycobacterium tuberculosis, um agente patogénico que foi pensado por um longo período de tempo a ser exclusivamente localizada dentro de um compartimento ligado à membrana 3,17.
Para investigar a dinâmica do tráfico de membrana subcelular de patógenos invasores, grandes avanços têm sido realizados desde a microscopia eletrônica de transmissão (TEM) estudos sobre o final de 1980 de 4,5 base. Por exemplo, os métodos baseados em microscopia de fluorescência utilizando corantes, os anticorpos contra os componentes da superfície bacteriana, ou marcadores para a co-localização com compartimentos subcelulares assumiu 6,7. No entanto, eles ainda não deu resolução espaço-temporal preciso e robustez para medir ruptura vacuolar por patógenos bacterianos quantitativamente.
Este obstáculo foi tratada com um ensaio baseado no repórter derivado CCF4-AM FRET cefalosporina, que foi usado pela primeira vez para estudar a expressão do gene 8. Em seguida, utilizou-se no contexto da infbiologia exão para investigar secreção efetoras e acompanhar a captação de Neisseria em células hospedeiras 9,10,11. Nós desenvolvemos um ensaio aproveitando este repórter para estudar ruptura vacuolar induzida por Shigella flexneri 12 e Mycobacterium tuberculosis 17. O princípio do método é o descrito na Figura 1, usando a Shigella flexneri. Em primeiro lugar, as células hospedeiras são carregados com o traste substrato CCF4-AM que está preso no interior do citoplasma, depois cortando fora os PM metades éster. Em seguida, as células são infectadas com Shigella flexneri. β-lactamase presente na superfície da bactéria é capaz de clivar o substrato CCF4 logo que ocorre a ruptura vacuolar. Isto leva a uma perda de FRET sinal de comutação do pico de emissão de 535 nm a 450 nm, após excitação da sonda a 405 nm. A medição radiométrica das intensidades 450/535 nm destaca integridade vacuolar: baixos índices refletem membrana-enbactérias fechados ou extracelular, enquanto que altas taxas de refletir contato entre as bactérias eo citosol host. Nós também relatam uma adaptação do método para o estudo de ruptura phagosomal induzida por Mycobacterium tuberculosis em macrófagos THP-1. Os princípios experimentais permanecem os mesmos, embora a sequência é invertida, CCF4-AM carga é aplicada apenas após a infecção bacteriana.
Assim, por meio de medições de fluorescência raciométrica quantitativas ao nível de uma única célula, a ruptura vacuolar da Shigella flexneri pode ser monitorado em tempo real e em amostras fixadas de diferentes tipos de células 12,13,14. Além disso, este método pode ser adaptado a um certo número de outros agentes patogénicos invasivos, como mostrado neste estudo, utilizando Mycobacterium bovis e Mycobacterium tuberculosis. Finalmente, a miniaturização do nosso protocolo de 96 poços (ou 384 poços) formatos permite a exibição de inúmeras doenças de alto rendimento.
Protocol
O teste funciona em vários formatos, porém recomendamos da redução do volume da amostra para salvar os reagentes, especialmente CCF4-AM. Portanto, o protocolo seguinte é descrito para as células HeLa fixos ou células THP-1, macrófagos, como num formato de 96 poços, em seguida, para as células HeLa vivas em pratos de vidro de fundo 35 mm. O ensaio pode ser adaptado a outros agentes patogénicos. Além da infecção Shigella, descrevemos o ensaio para THP-1 fagocitando diferentes m y cepas cobacterial.
Importante, após CCF4-AM carregamento, todos os reagentes e tampões, incluindo tampões de lavagem requerem a presença de probenecid em 1 mM. A probenecida é um inibidor do canal do anião que promove a retenção de citosólica CCF4 longo de todos os passos do protocolo. As amostras devem ser fixos adquirida dentro de algumas horas após a experiência, desde o sinal de CCF4 não é estável durante períodos de tempo longos.
1. CCF4 Ensaio em amostras fixadas com Shigella flexneri (placas de 96 poços)
- Preparando-se para culturas de bactérias durante a noite. Inocular os pré-culturas bacterianas do tipo selvagem (M90T AFAI) e mutantes (BS176 AFAI) estirpes 1 dia antes da infecção em 8 ml de caldo de soja tríptica de caseína (TCSB) suplementado com ampicilina (50 ug / ml) num agitador a 37 ° C durante a noite .
- Células chapeamento de infecção. As células HeLa semente em placas de 96 poços um dia antes da infecção, com uma densidade de 5 x 10 3 culas por po em meio DMEM contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS) e 1% de penicilina-estreptomicina numa atmosfera de 5% de CO 2 incubadora num volume final de 100 ul. No caso de células THP-1, macrófagos, como, chapeamento de célula é feito 2 dias antes da infecção, a uma densidade de 5 x 4 10 células / poço, e são incubadas com 30 nM de acetato de forbol miristato (PMA) em meio RPMI contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol.
- Preparando-se para as bactérias subcultura. Inocular culturas bacterianas durante a noitea uma diluição de 1/100 em TCSB suplementado com 50 ug / ml de ampicilina num agitador a 37 ° C durante 2,5 horas (OD600 = 0,3 a 0,4).
- Carregar pilhas com CCF4-AM. Preparar a mistura de CCF4-AM carregamento para um volume final de 25 ul por poço contendo probenecid 1 mM (Sigma), 1,5 jaM CCF4-AM (6 uM, no caso de células THP-1) e 1,25 mL de carga de solução B (100 mg / ml surfactante Pluronic-F127 em ácido acético DMSO/0.1% proporcionado ao longo CCF4-AM LiveBlazer carregando Kit pela Invitrogen) em EM tampão (120 mM de NaCl, 7 mM de KCl, 1,8 mM de CaCl2, 0,8 mM MgCl2, 5 mM de glicose, HEPES 25 mM a pH 7,3). Lave as células uma vez com PBS e adicionar 25 ul de CCF4-AM carregamento mistura por cavidade à temperatura ambiente no escuro durante 2,5 horas.
- Preparando-se para a infecção por bactérias. Rotação 1 ml de subculturas bacterianas a 9.000 rpm durante 1 min. Lavar uma vez com 500 ul de PBS, centrifugação a 9.000 rpm durante 1 min e ressuspender em 500 de PBS suplementado com 10 ug / ml de poli-L-lisina (Sigma) e 40 ng / ml β-lactamase (Sigma). Após 10 minutos de incubação numa roda rotativa à temperatura ambiente, lavar uma vez com 500 ul de PBS e as bactérias ressuspender em 500 ul de tampão de EM / 1 mM de probenecida.
- Infecção celular e fixação. Lave as células uma vez com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida, preparar uma mistura de 10 uL de bactérias foram ressuspensas num volume final de 100 ul de tampão de EM / 1 mM de probenecida e distribuí-lo a cada poço. Após 15 minutos de incubação no escuro à temperatura ambiente, a placa de exibir até 37 ° C durante 1 hora (90 minutos, no caso de células THP-1), lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e fixar com 50 uL de paraformaldeído 4% / 1 mM de probenecid durante 10 minutos no escuro. Em seguida, lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida, incubar durante 30 minutos com 30 ul de 10 mM núcleos corante DRAQ5 (Biostatus), lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e deixar as amostras em 100 ul de PBS / 1 mM de probenecida.
- Configurações de aquisição de amostras fixas. A aquisição é realizada utilizando (i) um invertido micros epifluorescêncialidar com um 20x (0,5 Abertura numérica (NA), 2,1 Distância de trabalho (WD)) ou 40x (0,75 NA, 0,72 WD) objetiva ar N-Plano ou (ii) usando um microscópio confocal com uma objetiva de 10x. Fluorescência de imagem é realizada com excitação a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) e detectada por meio de emissão de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtros Semrock, FF01-520/35- 25), utilizando tempos de exposição de 5 ms (luz transmitida), 1.000 ms (535 nm) e 500 ms (450 nm). Imagiologia confocal é realizada utilizando o seguinte tempo de exposição: 240 mseg (450 nm) e de 360 mseg (535 nm) para o laser de 405 nm (870 μW), 640 mseg (DRAQ5) para o laser de 640 nm (2560 μW).
- Análise pós-aquisição. Posteriormente, as imagens são analisados por um algoritmo de computador que permite marcar automatizado do sinal de fluorescência para cada células individuais. Programas tais como Metamorph 7.1 ou Acapella pode ser usado para criar um script para medir a proporção entre os sinais de emissão de 450nm e 535nm (disponível a pedido). De notar que o uso de um dispositivo de calibração de focagem acoplado a microscopia durante a aquisição automatizada permite a aquisição de dezenas de diferentes posições em múltiplos poços ao mesmo tempo.
2. CCF4 Ensaio sobre amostras ao vivo usando Shigella flexneri (35 milímetros Formato de vidro de fundo, MatTek)
- Preparando-se para culturas de bactérias durante a noite. Proceder como descrito anteriormente.
- Células chapeamento de infecção. As células HeLa semente de vidro em placas de cultura de 35 mm de fundo (MatTek 10 milímetros de micropoços, MatTek corporação) um dia antes da infecção, com uma densidade de 2 x 10 5 células / placa num volume final de 2 ml.
- Preparando-se para as bactérias subcultura. Proceder como descrito anteriormente.
- Carregar pilhas com CCF4-AM. Preparar a mistura de carga de CCF-AM conforme anteriormente descrito para um volume final de 2 ml por prato. Antes do carregamento, lavagem das células uma vez com PBS.
- Preparando-se para a infecção por bactérias. Proceder como descrito anteriormente.
- Acquisitconfigurações de iões de amostras vivas. A aquisição é realizada durante 60 min a cada 90 segundos com um microscópio de epifluorescência invertido usando uma 20x (0,5 NA, 2,1 DT) ou de uma objectiva de 40x de ar N-Plano (0,75 NA, 0,72 WD) ° C dentro de uma câmara de aquecimento 37. Fluorescência de imagem é realizada com excitação a 405 nm (Semrock, FF01-387/11-25) e detectada por meio de emissão de 450 nm (Semrock, FF02-447/60-25) e 535 nm (filtros Semrock, FF01-520/35- 25), utilizando tempos de exposição de 5 ms (luz transmitida), 200 ms (535 nm) e 100 ms (450 nm).
- Infecção celular e aquisição vivo. Lave as células uma vez com 2 ml de PBS / 1 mM de probenecida, adicionar 2 ml de EM / 1 mM de probenecida, montar o prato no estágio do microscópio e iniciar a aquisição. Após 6 min (ponto 4 do tempo), coloque a aquisição em espera, adicionar 250 ml de bactérias ressuspensão em cima das células e reiniciar a aquisição.
- Análise pós-aquisição. Os filmes podem ser visualizados usando Metamorph ou ImageJ. 450/535 nm rácios de intensidade para cada indivíduocélula dupla pode ser obtido utilizando o ImageJ. Como mencionado anteriormente, a utilização de um dispositivo de calibração de focagem acoplado a microscopia durante a aquisição automatizada permite a aquisição de várias posições diferentes, dependendo do intervalo de tempo.
3. CCF4 Ensaio em amostras fixadas com Micobactérias (96 Formato Well)
- Preparação das bactérias. Crescer cepas de micobactérias a fase mid-log em 7H9 contendo dextrose albumina catalase (ADC) a 30 ° C (para Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis).
- Células chapeamento de infecção. Placa de THP-1 macrófagos dois dias antes da infecção incubando-os com 30 nM de PMA, em meio RPMI contendo 10% de Soro Fetal de Vitela (FCS), 1% de penicilina-estreptomicina, e 0,05 mM de 2-mercaptoetanol numa atmosfera de 5% incubadora de CO 2, num volume final de 100 ul a uma densidade de 5 x 4 10 células / poço.
- Preparando-se para a infecção por bactérias. Harvculturas est, lavar e ressuspender com PBS antes da sonicação e filtração através de uma seringa, a fim de evitar aglomeração. Determinar a concentração de cada estirpe por medição de OD600 e infectar células THP-1 a um MOI de 1:01 a 30 ° C (para Mycobacterium marinum) ou 37 ° C (por Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis) em meio RPMI com 5% CO 2. Após 2 h, remova o meio, lavar 3 vezes com PBS e adicionar meio fresco completo por 1 a 2 dias (no caso de Mycobacterium marinum) ou 3-7 dias (no caso de Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis).
- Células com CCF4-AM e fixação de carga. Lave as células uma vez com PBS e preparam a mistura AM CCF4-carregamento, como descrito anteriormente, para um volume final de 25 ul por poço usando um CCF4-AM concentração final de 6 mM. Carregando tem lugar à temperatura ambiente no escuro durante 2 horas antes de se lavar com 150 ul probenecida PBS / 1 mM e corrigirção com 50 uL de paraformaldeído a 4% suplementado with1 mM de probenecid durante 30 minutos no escuro. Em seguida, lava-se com 150 ul de PBS / 1 mM de probenecida e deixar as amostras em 100 ul de PBS / 1 mM de probenecida.
- Configurações de aquisição e análise de pós-aquisição. Proceder como anteriormente descrito no primeiro parágrafo com Shigella flexneri.
Protocolo Suplementar
Os ensaios são realizados fluorimétrica, a fim de verificar a actividade β-lactamase na superfície das bactérias. Isto deve ser feito para cada estirpe bacteriana destinada a ser utilizada no ensaio descrito. Para este efeito, as bactérias são lavadas posto em contacto com 100 nM CCF4-AM (Invitrogen), 50 ug / ml de esterase de fígado porcino extractos (Sigma) em 1 ml de PBS durante 1 hora a 37 ° C no escuro. Solúvel lactamase 1 mg / ml (Invitrogen), pode ser usado como um controlo positivo. Em seguida, uma verificação é feita de emissão com excitação a 405 nm usando um PTI Quantamaster fluorímetro e um 1 ml de quartz cuvete. A perda de FRET a 535 nm, e o aparecimento de um pico alto de 450 nm, são visualizados sobre bactérias adição à sonda CCF4.
Representative Results
A abordagem CCF4-AM/β-lactamase é um método robusto e sensíveis para rastrear ruptura vacuolar de agentes patogénicos intracelulares, tais como Shigella flexneri (Figura 1). As estirpes de Shigella que são usados neste estudo são denominados M90T AFAI e BS176 AFAI. M90T AFAI é uma estirpe de Shigella flexneri que expressa a adesina AfaE, que é capaz de se ligar de forma eficiente o CD55 na superfície das células epiteliais 15. Estirpes que expressam Portanto AfaE exibir capacidades muito mais elevadas invasão comparado com a estirpe de tipo selvagem M90T em células epiteliais. BS176 AFAI é um mutante que expressa AfaE Shigella flexneri estirpe desprovida do plasmídeo de virulência Shigella. Esta estirpe é capaz de invadir células HeLa. No entanto, esta estirpe é capaz de entrar nas células THP-1 uma vez que a absorção nesta linha celular de contar apenas com a fagocitose clássica e não necessita de um sistema de secreção de tipo-3 funcional. Ambas as estirpes expressam β-lactamaseE exibir actividade β-lactamase na sua superfície, devido à presença do plasmídeo de codificação AfaE. Após a infecção de células HeLa com o não-invasiva BS176 AFAI tensão durante 1 hora, a FRET CCF4 sonda permanece intacta, conforme mostrado na Figura 2A através do sinal verde (535 nm). Pelo contrário, a infecção com a estirpe M90T AFAI virulenta, durante 1 hora leva a um comutador de sinal para o azul (450 nm), com destaque para a clivagem da sonda no citosol. Para quantificar isto, nós desenvolvemos um script para o software Metamorph Acapella e que permite a detecção automática de células e a medição das intensidades nos canais 535 e 450 nm para a determinação do sinal de medida proporcional. Tal como mostrado na Figura 2B, os núcleos e citosol de células são segmentados utilizando o canal de DRAQ5. Em seguida, o algoritmo é capaz de detectar os 450 nm e os ns 535 populações de células positivas para o cálculo das proporções entre as duas intensidades de cada célula individual, que érepresentada como um histograma na Figura 2C. Baixos índices são obtidos para a cepa mutante contra altos índices para a cepa virulenta. Embora esta experiência representativa infecção foi adquirida através de microscopia confocal, microscopia de epifluorescência, também é adequado para esta tarefa Figuras 3 e 4 mostram exemplos usando dois diferentes tipos de células humanas:. Células epiteliais HeLa e células THP-1, macrófagos, como. Após a infecção com a estirpe Shigella M90T AFAI virulenta, durante 1 hora e 90 min para células HeLa e células THP-1, um interruptor de sinal de verde (535 nm) para o azul (450 nm) é observada em comparação com as células infectadas BS176 AFAI (Figuras 3A e 4A). O script desenvolvemos em software Metamorph detecta directamente a população positiva CCF4 das células e calcular a relação entre as intensidades de 450 e 535 nm, para cada um dos canais de células individuais. Em seguida, as células são classificadas como uma função da sua relação com uma macro desenped no Excel, obtendo-se assim os histogramas que mostram a distribuição das células. Tal como tem sido o caso para o outro roteiro desenvolvido para Acapella, BS176 células infectadas AFAI são caracterizados por rácios baixos, enquanto que as células infectadas AFAI M90T exibem elevados índices usando o algoritmo MetaMorph sobre as células HeLa e as células THP-1, macrófagos (Figuras 3B e 4B) . Finalmente, uma adaptação deste método para o estudo das micobactérias é mostrado na Figura 5. Mycobacterium bovis BCG reside no fagossoma durante todo o decurso da experiência, tal como reflectido pela forte sinal detectado 535 nm ao longo do decurso de tempo da experiência. Em contraste, o Mycobacterium tuberculosis provoca a ruptura da membrana phagosomal THP-1 em macrófagos, após mais de 3 dias de infecção, conforme salientado por um sinal de 450 nm a 7 dias após a infecção (Figura 5A e 5B). Usando o mesmo algoritmo para estudar ruptura vacuolar por Shigella Mycobacterium tuberculosis apresentar maiores proporções 450/535 nm do que Mycobacterium bovis BCG após 7 dias de infecção (Figuras 5C e 5D).
Figura 1. Esquema que representa o princípio do ensaio para rastrear CCF4-AM/β-lactamase Shigella flexneri ruptura vacuolar. CCF4-AM difunde livremente através da membrana do plasma para o citoplasma, onde porções éster são clivados por esterases citossólicas produtoras CCF4 aniões. Esta reacção CCF4 impede a entrada de qualquer membrana compartimento incorporado. Neste passo, CCF4 provoca FRET a 535 nm após excitação a 405 nm. A sonda permanece intacta até bactérias expressando β-lactamase RUPTURE o vacúolo endocytic. Neste passo, o sinal FRET é perdido porque CCF4 é clivada por β-lactamase provocando uma mudança na emissão de 535 nm a 450 nm após excitação a 405 nm.
Figura 2. Acompanhando ruptura Shigella flexneri vacuolar utilizando microscopia confocal. (D) Após 2 h 30 min de carregamento CCF4-AM, células HeLa são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 hora e fixos , utilizando 4% de paraformaldeído durante 10 min. Em seguida, os núcleos são corados com DRAQ5 e as células são fotografada usando um microscópio confocal com uma objetiva de 10x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais incorporadas: a sonda intacta CCF4 aparece em 535 nm (green), a sonda clivada CCF4 aparece em 450 nm (azul). (B) Exemplos de fotos destacando o sistema de detecção do nosso algoritmo automatizado no software Acapella. A segmentação das células (núcleos + citosol) é obtido através do canal de DRAQ5. CCF4 células positivas são obtidos utilizando os canais 450 e 535 nm agrupados juntos. (C) Histograma mostrando o resultado de nossa análise automatizada em Acapella usando Shigella flexneri BS176 AFAI cepa mutante ou M90T AFAI cepa virulenta. O rácio significativo representa a relação entre a intensidade dos canais 450 e 535 nm. clique aqui para ver figura maior .
Figura 3. Rastreamento Shigella fleruptura vacuolar xneri em células HeLa, utilizando microscopia de epifluorescência. (D) Após 2 h 30 min de CCF4-AM carregamento, as células HeLa são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 hora e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 min. Em seguida, as células foram fotografadas usando um microscópio de epifluorescência, com uma objectiva 20x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais:. CCF4 intacto sonda de 535 nm (verde) e CCF4 clivados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa o resultado de nossa análise automatizada de software MetaMorph. As células individuais são distribuídas em função da sua relação das intensidades nos canais 450 e 535 nm.
> Figura 4. Acompanhando Shigella flexneri ruptura vacuolar em células THP-1, utilizando microscopia de epifluorescência. (D) Após 2 h 30 min de carregamento CCF4-AM, THP-1 As células são infectadas com o β-lactamase expressa Shigella flexneri BS176 AFAI estirpe mutante ou o M90T AFAI estirpe virulenta, durante 1 h 30 min, e fixo por meio de 4% de paraformaldeído durante 10 min. Em seguida, as células foram fotografadas usando um microscópio de epifluorescência, com uma objectiva 20x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais:. CCF4 intacto sonda de 535 nm (verde) e CCF4 clivados sonda 450 nm (azul) (B) Histograma que representa o resultado de nossa análise automatizada usando o software MetaMorph. As células individuais são distribuídas em função da sua relação das intensidades nos canais 450 e 535 nm.
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Figura 5. Acompanhando o Mycobacterium bovis BCG e Mycobacterium tuberculosis ruptura phagosomal THP-1 em macrófagos, utilizando microscopia de epifluorescência. (A, B), THP-1 As células são infectadas com β-lactamase expressa Mycobacterium bovis BCG ou Mycobacterium tuberculosis durante 2 horas e cultivadas durante 3 a 7 dias . Após a lavagem, as células são carregadas com CCF-4-AM durante 2 horas e fixo, utilizando 4% de paraformaldeído durante 30 min antes de imagem usando um microscópio de epifluorescência, com um objectivo de 40x. Fotos representativas foram escolhidos com os seguintes canais: intacto CCF4 sonda, 535 nm (verde); clivada CCF4, sonda 450 nm (azul) (C, D) histogramas apresentando o resultado de nossa análise automatizada usando software MetaMorph.. As células individuais são distribuídas como função da razão entre a intensidade dos canais 450 e 535 nm.
Discussion
O ensaio CCF4-AM/β-lactamase é um método simples para controlar perturbações vacuolar intracelular induzida por Shigella flexneri e micobactérias em diferentes tipos de células. Ele faz uso de um citoplasmática sensível FRET repórter lactamase que é clivada por uma enzima activa na superfície das bactérias.
A perda do substrato CCF4-AM podem ser facilmente evitados por adição de probenecida para todas as soluções, após o carregamento do substrato. Tal como demonstrado, o ensaio pode ser adaptado para vários tipos de células (células epiteliais, células fagocíticas) e formatos (96 poços, 35 pratos de vidro de fundo mm, 6/12/24 placas de poços). Para a utilização da placa de 6/12/24, lamelas estéreis são distribuídos na parte inferior de cada poço antes de semear as células. No fim do experimento, lamelas são transferidos em lâminas em meio de montagem, tal como prolongar Reagente Antifade Gold (Invitrogen). Desta forma, o sinal é estável durante períodos de tempo mais longos, após testeem comparação com o formato de 96 cavidades em que as amostras são mantidas em PBS após a fixação. O elevado custo do substrato CCF4-AM devem ser tidos em conta antes da determinação do volume da amostra. É por isso que recomendamos a dimensioná-las para baixo. As experiências são mais caros em 6/12/24 formato bem, mas os sinais são estáveis durante vários dias. Pelo contrário, as experiências são mais baratas no formato de 96 poços, mas as amostras têm de ser analisados no dia da experiência. É de salientar que as experiências vivo também pode ser realizada a 96 a 384 ou formato bem bem. Isto permite a realização de experiências vivo usando dezenas de condições, ao mesmo tempo (bactérias mutantes, Moi, transfecção de plasmídeo ou siRNA, produtos químicos, etc) com o número de posições por poço. Embora adequado para Shigella flexneri, destacamos que "verdadeiro" tempo real ou experiências de lapso de tempo não são viáveis para estudos de micobactérias desde que o ciclo de infecção ultrapassa concentrações mensuráveis de CCF4 que podem ser retidos no citoplasma. Paraesta razão, o substrato CCF4-AM é aplicada apenas sobre as células é conseguido após a invasão.
No caso de software MetaMorph é utilizado para a aquisição e análise, recomendamos a utilização do módulo de "aquisição screen", que permite a aquisição de todo um 96/384 com placa de um determinado número de imagens por bem. Além disso, os dados da tela "avaliação" do módulo permite que (i) a visualização da imagem em mosaico costurado de cada bem para qualquer canal ao mesmo tempo em um grande "poster" e (ii) looping um algoritmo especializado para medir as intensidades no 535 e os canais 450 nm. Mesmo assim, temos sido capazes de medir ruptura vacuolar por bactérias isoladas usando microscopia de lapso de tempo, gostaríamos de advertir que a atividade enzimática na superfície de bactérias individuais varia tornando-o difícil de correlacionar com precisão o número de bactérias e efetividade das vacuolar intracelulares ruptura.
Dada a robustez do ensaio, que é adequado para hrendimento igh se aproxima em 96 ou 384 formatos também. Também este protocolo adaptado com sucesso para a análise de FACS para o estudo da infecção de células em suspensão 16. O ensaio também pode ser utilizado para a investigação de outras bactérias ou transportadores que apresentam lactamase na sua superfície, o que conduz a uma ampla gama de aplicações. Por exemplo, esta abordagem pode ser utilizada para estudar vacuolar ruptura induzida por outros agentes patogénicos, tais como β-lactamase expressa Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes e Salmonella typhimurium 12. Desde Listeria monocytogenes tem um curto ciclo de infecção comparável a Shigella flexneri, as experiências de lapso de tempo são possíveis. Em contraste, porque Legionella pneumophila e Salmonella typhimurium exibição longos ciclos de infecção, sugerimos a realização de experimentos ponto final.
A variedade de aplicações possíveis torna o ensaio de uma CCF4-AM/β-lactamasemétodo fluorimétrico interessante para acompanhar ruptura vacuolar induzida por patógenos intracelulares em amostras fixas ou em tempo real.
Disclosures
Não temos nada a divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Agence Nationale pour la Recherche e pelo Conselho Europeu de Investigação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
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