Summary
نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا
Abstract
الشيجلا الفلكسنرية هي البكتيريا المسببة للأمراض التي تغزو الخلايا المضيفة الدخول في فجوة التقامي. وفي وقت لاحق، وتمزق هذا الغشاء المقصورة المغلقة يسمح البكتيريا للتحرك داخل العصارة الخلوية، تتكاثر وتغزو المزيد من الخلايا المجاورة. والمبتلعة المتفطرة السلية من قبل الخلايا المناعية، ولقد ثبت مؤخرا إلى تمزق غشاء phagosomal في الضامة. وضعنا مقايسة قوية لتتبع phagosomal اضطراب الغشاء بعد دخول الخلية المضيفة من الشغيلة الفلكسنرية أو المتفطرة السلية. نهج يجعل من استخدام CCF4، والحنق مراسل حساسة للβ اكتاماز أن equilibrates في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة. على غزو الخلايا المضيفة من قبل مسببات الأمراض البكتيرية، لا يزال التحقيق سليمة طالما أن البكتيريا الموجودة في غشاء المقصورات المغلقة. بعد انقطاع فجوة، والنشاط β اكتاماز على سطح يشق الممرض داخل الخلايا CCF4 على الفور تؤديجي إلى فقدان الحنق إشارة والتبديل طيف الانبعاث لها. هذا الاختبار ratiometric قوية تعطي معلومات دقيقة حول توقيت تمزق فجوي الناجمة عن البكتيريا الغازية، وأنه يمكن أن يقترن إلى المجهر الآلي ومعالجة الصور بواسطة خوارزميات المتخصصة للكشف عن الإشارات الانبعاثات من الحنق المانحة ومتقبل. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التحقيق في ديناميات الاضطراب فجوي التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا في الوقت الحقيقي في الخلايا واحد. وأخيرا، هي مناسبة تماما لتحليل الإنتاجية العالية مع قرار المكانية والزمانية تتجاوز الأساليب السابقة. هنا، ونحن نقدم تفاصيل تجريبية من البروتوكولات المثالية لCCF4 فجوي مقايسة تمزق في خلايا هيلا وTHP-1 الضامة للتجارب الوقت الفاصل بين التجارب أو نقطة نهاية باستخدام الشيجلا الفلكسنرية وكذلك سلالات المتفطرات متعددة مثل المتفطرة البحرية، المتفطرة البقرية، والمتفطرة السلية.
Introduction
يتم إدماج العديد من مسببات الأمراض البكتيرية في المقصورات المغلقة غشاء الخلايا حقيقية النواة خلال مسارها من العدوى. يحدث إدخال خلية إما عن طريق البلعمة بواسطة الخلايا المضيفة المتخصصة، كما هو الحال بالنسبة لالمتفطرة السلية التي يتم تناولها من قبل الضامة، أو مسببات الأمراض تحفز بنشاط امتصاص بهم إلى عادة الخلايا غير البلعمية. في حالة امتصاص يسببها، على سبيل المثال لالشيجلا الفلكسنرية، الممرض بحقن البروتينات المستجيب في العصارة الخلوية المضيف الذي خطف من بين وظائف الخلية الأخرى ينظم بإحكام endomembrane آلات الفرز مما أدى إلى توطين البكتيرية داخل مقصورة 1،2 endosomal. وفي وقت لاحق، الشيجلا يعطل غشاء أرفق مما يؤدي إلى تمزق فجوي والوصول عصاري خلوي من مسببات المرض تتداخل مع المضيف الاتجار غشاء وتجنب التسليم إلى يحلول. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجد تمزق phagolysosomal أيضا باسم شارع العدوىتستخدم ategy بواسطة المتفطرة السلية، الممرض الذي كان يعتقد لفترة طويلة إلى أن تكون مترجمة حصرا داخل مقصورة غشاء محدد 3،17.
للتحقيق في ديناميات الاتجار غشاء التحت خلوية من مسببات الأمراض الغازية، وقد تم تحقيق تحسينات كبيرة منذ المجهر الإلكتروني انتقال (TEM) دراسات من أواخر 1980s 4،5 القائمة. على سبيل المثال، أحاطت طرق الفحص المجهري مضان القائمة على استخدام الأجسام المضادة ضد الأصباغ مكونات سطح البكتيرية، أو علامات لاشتراكهما في توطين التحت خلوية مع مقصورات أكثر من 6،7. ومع ذلك، فإنها لا تزال لا تعطي القرار الزمانية المكانية دقة ومتانة لقياس تمزق فجوي من قبل مسببات الأمراض البكتيرية كميا.
وقد عولجت هذه العقبة مع مقايسة على أساس مستمد CCF4-AM الحنق مراسل السيفالوسبورين الذي استخدم لأول مرة لدراسة التعبير الجيني 8. ثم، تم استخدامه في سياق INFعلم الأحياء ection للتحقيق في إفراز المستجيب ومتابعة امتصاص النيسيري في الخلايا المضيفة 9،10،11. وضعنا مقايسة الاستفادة من هذا المراسل لدراسة تمزق فجوي الناجم عن دوسنتاريا الفلكسنرية 12 و 17 المتفطرة السلية. يوصف مبدأ أسلوب لدينا في الشكل 1 باستخدام الشيجلا الفلكسنرية. أولا، يتم تحميل خلايا المضيف مع الحنق الركيزة CCF4-AM التي يتم محاصرين داخل السيتوبلازم بعد الشق قبالة AM الأنصاف استر. ثم، يصاب الخلايا مع الشغيلة الفلكسنرية. الحاضر β اكتاماز على السطح من البكتيريا قادرة على يلتصق الركيزة CCF4 حالما يحدث تمزق فجوي. وهذا يؤدي إلى فقدان إشارة الحنق التحول ذروة الانبعاثات من 535 نانومتر إلى 450 نانومتر على الإثارة من لجنة التحقيق في 405 نانومتر. قياس ratiometric من شدة نانومتر 450/535 يسلط الضوء على سلامة فجوي: النسب المنخفضة تعكس غشاء ENالبكتيريا مغلق أو خارج الخلية بينما نسب عالية تعكس الاتصال بين البكتيريا والعصارة الخلوية المضيف. نحن أيضا تقريرا للتكيف من هذا الأسلوب لدراسة تمزق phagosomal الناجم عن المتفطرة السلية في THP-1 الضامة. المبادئ التجريبية لا تزال هي نفسها على الرغم من أن التسلسل هو عكسه، يتم تطبيق CCF4-AM تحميل فقط بعد الإصابة البكتيرية.
وهكذا، من خلال القياسات الكمية مضان ratiometric على مستوى خلية واحدة، يمكن تتبع تمزق فجوي من الشغيلة الفلكسنرية في الوقت الحقيقي والثابت في عينات من أنواع مختلفة من الخلايا 12،13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لعدد من مسببات الأمراض الغازية الأخرى كما هو موضح في هذه الدراسة باستخدام المتفطرة البقرية والمتفطرة السلية. وأخيرا، فإن التصغير من بروتوكول لدينا إلى 96 جيدا (أو 384 أيضا) صيغ يسمح فحص ظروف عديدة في إنتاجية عالية.
Protocol
يعمل الفحص في أشكال مختلفة، إلا أننا نوصي في خفض حجم العينة لحفظ الكواشف، وخاصة CCF4-AM. لذلك، يتم وصف بروتوكول التالية للخلايا هيلا ثابت أو THP-1 الخلايا الشبيهة بلعم في شكل جيد 96، ثم لخلايا هيلا الحية في 35 ملم أطباق أسفل الزجاج. ويمكن تكييف مقايسة لمسببات الأمراض الأخرى. وإلى جانب عدوى الشغيلة، ونحن تصف مقايسة لTHP-1 phagocytosing مختلف م ذ سلالات cobacterial.
الأهم من ذلك، بعد CCF4-AM جار، كل الكواشف ومخازن بما في ذلك غسل مخازن تتطلب وجود البروبينسيد في 1 ملم. البروبينسيد هو قناة أنيون المانع أن يعزز الاحتفاظ عصاري خلوي من CCF4 في جميع الخطوات من البروتوكول. ينبغي الحصول على عينات ثابتة في غضون ساعات قليلة بعد التجربة منذ CCF4 إشارة ليست مستقرة لفترات زمنية طويلة.
1. CCF4 الفحص على عينات الثابتة باستخدام الشغيلة وlexneri (96 لوحات جيدة)
- إعداد البكتيريا للثقافات بين عشية وضحاها. تطعيم البكتيرية قبل الثقافات النوع البري (M90T الفجر العالمية) ومتحولة (BS176 الفجر العالمية) سلالات قبل الإصابة 1 يوم في 8 مل زيتية الكازين الصويا مرق (TCSB) تستكمل مع الأمبيسلين (50 ميكروغرام / مل) في شاكر عند 37 درجة مئوية خلال الليل .
- الخلايا تصفيح للعدوى. البذور خلايا هيلا في 96 لوحات جيدة قبل الإصابة 1 يوم في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 3 خلايا لكل بئر في DMEM تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) و 1٪ البنسلين، الستربتوميسين في 5٪ CO 2 الحاضنة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر. في حالة الخلايا THP-1-بلعم مثل، يتم طلي الخلية قبل 2 أيام عدوى في مناطق ذات كثافة من 5 × 10 4 خلايا / جيد، ويتم تحضين أنها مع 30 نانومتر Phorbol خلات ميريستيت (سلطة النقد الفلسطينية) في RPMI تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين streptomycine و 0.05 مم 2 المركابتويثانول.
- إعداد البكتيريا لثقافة فرعية. تطعيم الثقافات البكتيرية بين عشية وضحاهافي 1/100 التخفيف في TCSB تستكمل مع 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في شاكر عند 37 درجة مئوية لمدة 2.5 ساعة (OD600 = 0،3-0،4).
- تحميل الخلايا مع CCF4-AM. تحضير مزيج CCF4 آم التحميل عن الحجم النهائي من 25 ميكرولتر لكل بئر تحتوي على 1 ملم البروبينسيد (سيغما)، و 1.5 ميكرومتر CCF4-AM (6 ميكرومتر في حالة THP-1) و 1.25 ميكرولتر من التحميل الحل B (100 ملغ / مل بلورونيك-F127 السطحي في حامض الخليك DMSO/0.1٪ قدمت على طول CCF4-AM LiveBlazer كيت التحميل بواسطة إينفيتروجن) في EM العازلة (120 ملي مول كلوريد الصوديوم، 7 ملم بوكل، 1.8 مم CaCl 2، 0.8 ملم MgCl 2، 5 ملي الجلوكوز، 25 HEPES ملم على الرقم الهيدروجيني 7.3). غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وإضافة 25 ميكرولتر من CCF4-AM المزيج التحميل لكل بئر في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ساعة 2.5.
- إعداد البكتيريا لعدوى. تدور 1 مل من ثقافات فرعية البكتيرية في 9،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة. يغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر PBS، وتدور في 9،000 دورة في الدقيقة لمدة 1 دقيقة و resuspend في 500 ميكرولتر PBS تستكمل مع 10 ميكروغرام / مل بولي-L-يسين (سيغما) و 40 ميكروغرام / مل β-ألبانماس (سيغما). بعد 10 دقيقة من الحضانة على عجلة دوارة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرة واحدة مع 500 ميكرولتر PBS والبكتيريا resuspend في 500 ميكرولتر العازلة EM / 1 ملي البروبينسيد.
- عدوى الخلية والتثبيت. غسل خلايا مرة واحدة مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد، وإعداد مزيج من 10 ميكرولتر من البكتيريا معلق في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر من العازلة EM / 1 ملي البروبينسيد وتوزيعها على كل بئر. بعد 15 دقيقة حضانة في الظلام في درجة حرارة الغرفة، وتبديل لوحة إلى 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة (90 دقيقة في حالة THP-1)، ويغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وإصلاح مع 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ / 1 ملي البروبينسيد من أجل 10 دقيقة في الظلام. ثم، يغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد، واحتضان لمدة 30 دقيقة مع 30 ميكرولتر من 10 ميكرومتر نوى صبغ Draq5 (Biostatus)، ويغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وترك العينات في 100 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد.
- إعدادات اقتناء عينات ثابتة. يتم تنفيذ الاستحواذ إما باستخدام (ط) على صغار جدا epifluorescence مقلوبالتعامل مع 20X (0.5 الفتحة العددية (NA)، 2.1 العمل عن بعد (WD)) أو 40X (NA 0.75، 0.72 WD) الهدف الهواء N-خطة أو (II) باستخدام مجهر متحد البؤر مع الهدف 10X. يتم تنفيذ مضان التصوير مع الإثارة في 405 نانومتر (Semrock، FF01-387/11-25) والانبعاثات الكشف عن 450 نانومتر عبر (Semrock، FF02-447/60-25) و 535 نانومتر الفلاتر (Semrock، FF01-520/35- 25) استخدام مرات التعرض من 5 ميللي ثانية (الضوء المرسل)، 1،000 مللي ثانية (535 نانومتر) و 500 ميللي ثانية (450 نانومتر). يتم إجراء التصوير متحد البؤر باستخدام وقت التعرض التالية: 240 ميللي ثانية (450 نانومتر) و 360 ميللي ثانية (535 نانومتر) لنانومتر ليزر 405 (870 μW)، 640 ميللي ثانية (Draq5) لنانومتر ليزر 640 (2560 μW).
- تحليل ما بعد الاستحواذ. وفي وقت لاحق، ويتم تحليل الصور بواسطة خوارزمية الكمبيوتر الذي يسمح التهديف الآلي للإشارة مضان لكل الخلايا الفردية. البرمجيات مثل Metamorph 7.1 أو Acapella يمكن استخدامها لإنشاء برنامج نصي لقياس النسبة بين إشارات الانبعاثات 450NM و535nm (متوفر عند الطلب). من المذكرة، واستخدام جهاز معايرة التركيز بالإضافة إلى المجهر الآلي خلال اقتناء يسمح الحصول على عشرات من المواقف المختلفة في الآبار متعددة في نفس الوقت.
2. CCF4 الفحص على عينات حية باستخدام الشيجلا الفلكسنرية (35 ملم تنسيق زجاج القاع، ماتيك)
- إعداد البكتيريا للثقافات بين عشية وضحاها. المضي قدما كما هو موضح سابقا.
- الخلايا تصفيح للعدوى. البذور خلايا هيلا في 35 ملم أسفل الزجاج أطباق ثقافة (ماتيك 10 ملم Microwell، ماتيك شركة) قبل 1 يوم عدوى في مناطق ذات كثافة من 2 × 10 5 خلية / طبق في الحجم النهائي من 2 مل.
- إعداد البكتيريا لثقافة فرعية. المضي قدما كما هو موضح سابقا.
- تحميل الخلايا مع CCF4-AM. إعداد إطار التعاون القطري-AM المزيج التحميل كما هو موضح سابقا عن الحجم النهائي من 2 مل لكل طبق. قبل التحميل، وغسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
- إعداد البكتيريا لعدوى. المضي قدما كما هو موضح سابقا.
- Acquisitإعدادات أيون العينات الحية. يتم تنفيذ الاستحواذ لمدة 60 دقيقة كل 90 ثانية مع مجهر epifluorescence مقلوب باستخدام 20X (0.5 NA، 2.1 WD) أو 40X (NA 0.75، 0.72 WD) الهدف الهواء N-خطة داخل 37 ° C غرفة التدفئة. يتم تنفيذ مضان التصوير مع الإثارة في 405 نانومتر (Semrock، FF01-387/11-25) والانبعاثات الكشف عن 450 نانومتر عبر (Semrock، FF02-447/60-25) و 535 نانومتر الفلاتر (Semrock، FF01-520/35- 25) استخدام مرات التعرض من 5 ميللي ثانية (الضوء المرسل)، و 200 ميللي ثانية (535 نانومتر) و 100 ميللي ثانية (450 نانومتر).
- عدوى الخلية واكتساب الحية. غسل خلايا مرة واحدة مع 2 مل PBS / 1 ملي البروبينسيد، إضافة 2 مل من EM / 1 ملي البروبينسيد، تركيب الطبق على مرحلة من مراحل المجهر والبدء في عملية الاستحواذ. بعد 6 دقائق (الوقت النقطة 4)، ووضع الاستملاك في الانتظار، إضافة 250 ميكرولتر من البكتيريا إعادة تعليق على الجزء العلوي من الخلايا وإعادة تشغيل عملية الاستحواذ.
- تحليل ما بعد الاستحواذ. يمكن أن تكون الأفلام تصور باستخدام Metamorph أو يماغيج. 450/535 نسب كثافة نانومتر لكل indiviويمكن الحصول على الخلية المزدوجة باستخدام يماغيج. كما ذكر سابقا، فإن استخدام جهاز معايرة التركيز على جانب المجهر الآلي خلال اقتناء يسمح الحصول على وظائف مختلفة متعددة اعتمادا على مرور الوقت.
3. CCF4 الفحص على عينات الثابتة باستخدام المتفطرات (96 تنسيق حسنا)
- إعداد البكتيريا. تنمو سلالات المتفطرات إلى مرحلة منتصف السجل في 7H9 التي تحتوي على سكر العنب الزلال الكاتالاز (ADC) في 30 ° C (لالمتفطرة البحرية) أو 37 ° C (لالمتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية).
- الخلايا تصفيح للعدوى. لوحة THP-1 الضامة قبل 2 أيام عدوى تفرخ لهم مع 30 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية في RPMI تحتوي على 10٪ مصل العجل الجنين (FCS)، 1٪ البنسلين الستربتوميسين و 0.05 مم 2 المركابتويثانول في 5٪ CO 2 الحاضنة في الحجم النهائي من 100 ميكرولتر في كثافة 5 × 10 4 خلايا / جيد.
- إعداد البكتيريا لعدوى. حارفالثقافات EST، غسل و resuspend مع برنامج تلفزيوني قبل صوتنة والترشيح من خلال حقنة من أجل تجنب تراكمها. تحديد تركيز كل سلالة من قبل OD600 قياس وتصيب THP-1 الخلايا في وزارة الداخلية 1:1 في 30 ° C (لالمتفطرة البحرية) أو 37 ° C (لالمتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية) في RPMI المتوسطة مع 5٪ CO 2. بعد 2 ساعة، وإزالة المتوسطة، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني وإضافة متوسطة جديدة كاملة ل1-2 أيام (في حالة المتفطرة البحرية) أو 3-7 أيام (في حالة المتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية).
- تحميل الخلايا مع CCF4-AM والتثبيت. غسل خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وتحضير مزيج جار CCF4-AM كما هو موضح سابقا عن الحجم النهائي من 25 ميكرولتر لكل بئر باستخدام تركيز النهائي CCF4-AM من 6 ميكرومتر. جار يحدث في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 2 ساعة قبل غسل مع 150 ميكرولتر البروبينسيد PBS / 1 ملم وإصلاحأوجه استخدام 50 ميكرولتر بارافورمالدهيد عند 4٪ تستكمل with1 ملي البروبينسيد من أجل 30 دقيقة في الظلام. ثم، يغسل مع 150 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد وترك العينات في 100 ميكرولتر PBS / 1 ملي البروبينسيد.
- إعدادات اقتناء وتحليل ما بعد الاستحواذ. المضي قدما كما هو موضح سابقا في الفقرة الأولى باستخدام الشيجلا الفلكسنرية.
بروتوكول إضافي
يتم تنفيذ المقايسات الفلور من أجل التحقق النشاط β اكتاماز على سطح البكتيريا. وينبغي أن يتم ذلك لكل السلالة البكتيرية التي يعتزم استخدامها في مقايسة وصفها. لهذا الغرض، وضعت البكتيريا غسلها في اتصال مع 100 نانومتر CCF4-AM (إينفيتروجن)، 50 ميكروغرام / مل الخنازير مقتطفات الكبد استريز (سيغما) في 1 مل من برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية في الظلام. ذوبان اكتاماز 1 ملغ / مل (إينفيتروجن) يمكن استخدامها كعنصر تحكم إيجابية. ثم، يتم إجراء فحص الانبعاثات في الإثارة 405nm وباستخدام PTI Quantamaster مقياس التألق والكوارت 1 ملZ كفيت. فقدان الحنق عند 535 نانومتر، وظهور ارتفاع ذروة نانومتر 450 هي تصور على البكتيريا بالإضافة إلى التحقيق CCF4.
Representative Results
النهج CCF4-AM/β-lactamase هو وسيلة قوية وحساسة لتتبع تمزق فجوي من مسببات الأمراض داخل الخلايا مثل الشيجلا الفلكسنرية (الشكل 1). وتسمى السلالات الشغيلة التي يتم استخدامها في هذه الدراسة M90T الفجر العالمية وBS176 الفجر العالمية. M90T الفجر العالمية هو الفلكسنرية سلالة الشغيلة التي تعبر عن adhesin AfaE، التي هي قادرة على ربط بكفاءة CD55 على سطح الخلايا الظهارية 15. سلالات التعبير عن ذلك AfaE عرض قدرات غزو أعلى بكثير بالمقارنة مع السلالة M90T من النوع البري في الخلايا الظهارية. BS176 الفجر العالمية هو AfaE معربا عن متحولة الشيجلا الفلكسنرية سلالة خالية من الفوعة الشيجلا البلازميد. هذه السلالة غير قادر على غزو خلايا هيلا. ومع ذلك هذه السلالة قادرة على دخول-1 THP الخلايا منذ امتصاص في هذا الخط الخلية تعتمد فقط على البلعمة الكلاسيكية و لا يتطلب نظام نوع-3 إفراز الوظيفية. كل سلالات التعبير عن β اكتاماز، وعرض آخر β اكتاماز على سطحها بسبب وجود ترميز AfaE البلازميد. عند إصابة الخلية هيلا مع غير الغازية BS176 الفجر العالمية سلالة لمدة 1 ساعة، وCCF4 الحنق لا يزال التحقيق سليمة، كما هو مبين في الشكل 2A بواسطة إشارة خضراء (535 نانومتر). على العكس من ذلك، فإن العدوى مع ضراوة M90T الفجر العالمية سلالة لمدة 1 ساعة يؤدي إلى التحول من إشارة نحو الأزرق (450 نانومتر) وتسليط الضوء على الانقسام لجنة التحقيق في العصارة الخلوية. من أجل تحديد هذا، قمنا بتطوير برنامج نصي لMetamorph وAcapella البرمجيات التي تسمح الكشف الآلي من الخلايا وقياس شدة في القنوات نانومتر 535 و 450 لتحديد إشارة ratiometric. كما هو مبين في الشكل 2B، نوى والعصارة الخلوية من الخلايا هي مجزأة باستخدام قناة Draq5. ثم، الخوارزمية هي قادرة على الكشف عن 450 نانومتر ونانومتر 535 السكان الخلية إيجابية لحساب النسب بين شدة اثنين لكل خلية الفردية التي هيممثلة على النحو الرسم البياني في الشكل 2C. ويتم الحصول على نسب منخفضة لسلالة متحولة مقابل نسب عالية للسلالة فتاكة. في حين تم الاستحواذ هذه التجربة عدوى ممثل باستخدام المجهر متحد البؤر، هي مناسبة المجهري epifluorescence أيضا لهذه المهمة أرقام 3 و 4 أمثلة توضح باستخدام 2 أنواع مختلفة من الخلايا البشرية: الخلايا الظهارية هيلا وTHP-1 خلايا البلاعم الشبيهة. على العدوى مع ضراوة M90T الفجر العالمية الشيجلا سلالة لمدة 1 ساعة و 90 دقيقة للهيلا وTHP-1 خلايا، والتحول من إشارة من الأخضر (535 نانومتر) إلى اللون الأزرق (450 نانومتر) وقد لوحظ مقارنة BS176 الفجر العالمية الخلايا المصابة (أرقام 3A و4A). النصي وضعنا على MetaMorph البرمجيات بالكشف مباشرة السكان إيجابية CCF4 من الخلايا وحساب النسبة بين شدة في 450 و 535 نانومتر قنوات لكل الخلايا الفردية. ثم تصنف الخلايا بوصفها وظيفة من نسبتهم باستخدام develo الماكروPED في Excel، وبالتالي الرضوخ رسوم بيانية تبين توزيع الخلية. كما كان الحال بالنسبة لالنصي المتقدمة الأخرى لAcapella، وتتميز BS176 الفجر العالمية الخلايا المصابة بنسب منخفضة، في حين M90T الفجر العالمية الخلايا المصابة عرض نسب عالية باستخدام خوارزمية MetaMorph على خلايا هيلا وTHP-1 الضامة (أرقام 3B و 4B) . وأخيرا، يظهر للتكيف من هذا الأسلوب لدراسة المتفطرات في الشكل 5. المتفطرة البقرية BCG يقيم في يبلوع لدورة كاملة من التجربة، وهو ما انعكس في 535 نانومتر إشارة قوية الكشف طوال الوقت من التجربة. في المقابل، المتفطرة السلية يتسبب تمزق غشاء phagosomal في THP-1 الضامة بعد أكثر من 3 أيام من العدوى على نحو ما أبرزته إشارة نانومتر 450 في 7 أيام من العدوى (الشكل 5A و 5B). باستخدام نفس الخوارزمية كما لدراسة تمزق فجوي بواسطة الشيجلا المتفطرة السل عرض أعلى 450/535 نانومتر نسب من المتفطرة البقرية BCG بعد 7 أيام من العدوى (أرقام 5C و 5D).
الشكل 1. مخطط يمثل مبدأ مقايسة CCF4-AM/β-lactamase لتتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق. CCF4-AM ينشر بحرية من خلال غشاء البلازما إلى السيتوبلازم حيث المشقوق الأنصاف استر قبالة عن طريق الاسترات عصاري خلوي إنتاج CCF4 الأنيونات. هذا رد فعل يمنع من دخول أي CCF4 غشاء مقصورة المضمنة. في هذه الخطوة، CCF4 يثير الحنق في 535 نانومتر على الإثارة في 405 نانومتر. لا يزال التحقيق قائما حتى البكتيريا معربا عن β اكتاماز rupturE فجوة التقامي. في هذه الخطوة، والحنق يتم فقدان إشارة لأن CCF4 هو المشقوق عن طريق إحداث β اكتاماز التحول في الانبعاثات من 535 نانومتر إلى 450 نانومتر على الإثارة في 405 نانومتر.
الشكل 2. تتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق باستخدام المجهر متحد البؤر. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، يصاب خلية هيلا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة والثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، هي ملطخة النوى مع Draq5 ويتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر متحد البؤر مع الهدف 10X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات المدمجة التالية: تظهر سليمة CCF4 التحقيق في 535 نانومتر (الجشعن)، يظهر المشقوق CCF4 التحقيق في 450 نانومتر (الأزرق). (ب) أمثلة من الصور تسليط الضوء على نظام الكشف عن خوارزمية الآلي لدينا على البرنامج Acapella. يتم الحصول على تجزئة من الخلايا (نوى + العصارة الخلوية) باستخدام قناة Draq5. ويتم الحصول على الخلايا إيجابية CCF4 باستخدام قنوات نانومتر 450 و 535 مجمعة معا. (C) الرسم البياني تظهر نتائج التحليل الآلي لدينا على Acapella باستخدام الشيجلا الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة. نسبة متوسط يمثل النسبة بين كثافة في القنوات نانومتر 450 و 535. اضغط هنا لعرض أكبر شخصية .
الشكل (3). تتبع الشيجلا FLExneri فجوي تمزق في خلايا هيلا باستخدام المجهر epifluorescence. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، يصاب خلايا هيلا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة و ثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence مع الهدف 20X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية:. CCF4 سليمة مسبار 535 نانومتر (الأخضر) وCCF4 المشقوق مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (B) الرسم البياني تمثل نتائج التحليل الآلي لدينا على البرمجيات MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية في وظيفة من نسبتهم من شدة في القنوات نانومتر 450 و 535.
> الشكل 4. تتبع الشيجلا الفلكسنرية فجوي تمزق في THP-1 الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence. (A) وبعد 2 ساعة و 30 دقيقة من CCF4-AM جار، THP-1 يصاب الخلايا مع β اكتاماز معربا عن الشغيلة الفلكسنرية BS176 الفجر العالمية متحولة سلالة أو M90T الفجر العالمية سلالة فتاكة لمدة 1 ساعة و 30 دقيقة وثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 10 دقيقة. ثم، يتم تصوير الخلايا باستخدام المجهر epifluorescence مع الهدف 20X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية:. CCF4 سليمة مسبار 535 نانومتر (الأخضر) وCCF4 المشقوق مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (B) الرسم البياني تمثل نتائج التحليل الآلي لدينا باستخدام برنامج MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية في وظيفة من نسبتهم من شدة في القنوات نانومتر 450 و 535.
ghres.jpg "SRC =" / files/ftp_upload/50116/50116fig5.jpg "/>
الشكل 5. تتبع المتفطرة البقرية BCG والمتفطرة السلية تمزق phagosomal في THP-1 الضامة باستخدام المجهر epifluorescence. (A، B) THP-1 يصاب الخلايا مع β اكتاماز معربا عن المتفطرة البقرية BCG أو المتفطرة السلية لمدة 2 ساعة وتربيتها لمدة 3-7 أيام . بعد الغسيل، يتم تحميل خلايا مع CCF-4-AM لمدة 2 ساعة والثابتة باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة قبل التصوير باستخدام مجهر epifluorescence مع الهدف 40X. وقد تم اختيار الصور مع ممثل القنوات التالية: سليمة CCF4 التحقيق، 535 نانومتر (الأخضر)؛ المشقوق CCF4، مسبار 450 نانومتر (الأزرق) (C، D) المدرج الإحصائي تقديم نتائج التحليل الآلي لدينا باستخدام البرمجيات MetaMorph. وتوزع الخلايا الفردية وظيفة من النسبة بين كثافة في القنوات نانومتر 450 و 535.
Discussion
مقايسة CCF4-AM/β-lactamase هي طريقة مباشرة لتعقب انقطاع فجوي الناجم عن الخلايا الشيجلا الفلكسنرية والمتفطرات في أنواع مختلفة من الخلايا. فإنه يجعل من استخدام اكتاماز الحساسة حشوية الحنق المراسل أن هو المشقوق بواسطة انزيم نشط على سطح البكتيريا.
فقدان الركيزة CCF4-AM يمكن بسهولة تجنبها عن طريق إضافة البروبينسيد إلى جميع الحلول بعد تحميل الركيزة. كما يتبين ذلك، يمكن تكييفها الفحص إلى أنواع خلايا متعددة (الخلايا الظهارية وخلايا البلعمة) والأشكال (96 جيد، 35 مم أطباق أسفل الزجاج، 6/12/24 لوحات جيدة). لاستخدام لوحة جيدا 6/12/24، يتم توزيع coverslips على العقيمة في الجزء السفلي من كل بئر قبل البذر الخلايا. في نهاية التجربة، يتم نقل coverslips على على الشرائح المتوسطة في تصاعد مستمر، مثل إطالة الذهب الكاشف Antifade (إينفيتروجن). بهذه الطريقة إشارة مستقرة لفترات زمنية أطول بعد الفحصمقارنة مع الآبار شكل 96 حيث يتم الاحتفاظ العينات في برنامج تلفزيوني بعد التثبيت. ينبغي أن تؤخذ في ارتفاع تكلفة الركيزة CCF4-AM بعين الاعتبار قبل تحديد حجم العينة. هذا هو السبب في أننا نوصي رفع عليهم. التجارب هي أكثر تكلفة في 6/12/24 شكل جيد ولكن الإشارات مستقرة لعدة أيام. على العكس من ذلك، والتجارب هي أرخص في شكل جيد 96، ولكن العينات يجب أن يتم تحليلها في يوم التجربة. ومن الجدير بالذكر أن التجارب الحية ويمكن أيضا أن يؤديها في البئر 96 أو 384 شكل جيد. وهذا يسمح أداء التجربة الحية باستخدام العشرات من ظروف في نفس الوقت (بكتيريا متحولة، وزارة الداخلية، ترنسفكأيشن البلازميد أو سيرنا، والمواد الكيميائية وغيرها) مع عدد من المواقف لكل بئر. على الرغم من أن مناسبة للدوسنتاريا الفلكسنرية، ونحن نسلط الضوء على أن "الحقيقي" في الوقت الحقيقي أو التجارب مرور الزمن ليست مجدية للدراسات المتفطرات منذ دورة العدوى يتجاوز تركيزات قابلة للقياس من CCF4 التي يمكن الاحتفاظ بها في العصارة الخلوية. إلىهذا السبب، يتم تطبيق الركيزة CCF4-AM على الخلايا فقط بعد تحقيق الغزو.
في حال تم استخدام البرمجيات MetaMorph لاقتناء وتحليل، ونحن نوصي باستخدام الوحدة النمطية "اقتناء شاشة" الذي يسمح الاستحواذ على كامل 96/384 لوحة جيدا مع عدد محدد من الصور لكل بئر. وعلاوة على ذلك، وحدة "البيانات الشاشة الآراء" يسمح (ط) تصور هذه الفسيفساء صورة مخيط من كل بئر لأية قناة في نفس الوقت على "ملصق" كبيرة و(II) حلقات خوارزمية المتخصصة لقياس شدة في 535 و القنوات نانومتر 450. على الرغم من ذلك، كنا قادرين على قياس تمزق فجوي عن طريق البكتيريا واحدة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري، نود أن نحذر من أن النشاط الأنزيمي على سطح البكتيريا الفردية تختلف مما يجعل من الصعب ربط على وجه التحديد عدد من البكتيريا داخل الخلايا وفعالية فجوي تمزق.
نظرا لمتانة للمقايسة، هي مناسبة لمدة ساعةيقترب الإنتاجية IGH في 96 أو 384 صيغ بشكل جيد. نحن أيضا تكيفت بنجاح هذا البروتوكول لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لدراسة إصابة الخلايا في التعليق 16. ويمكن أيضا أن تستخدم الفحص للتحقيق من البكتيريا أو شركات الطيران الأخرى تقديم اكتاماز على سطحها، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، فإن هذا النهج يمكن استخدامها لدراسة تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض الأخرى مثل β-اكتاماز معربا عن البكتيريا المستروحة، المستوحدة الليستيريا أو السالمونيلا التيفية الفأرية 12. منذ المستوحدة الليستيريا لديه دورة العدوى قصيرة مماثلة لالشيجلا الفلكسنرية، تجارب الوقت الفاصل بين ممكنة. في المقابل، لأن البكتيريا والسالمونيلا التيفية الفأرية المستروحة عرض دورات عدوى طويلة، فإننا نقترح على إجراء تجارب نقطة نهاية.
مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة يجعل فحص CCF4-AM/β-lactamase علىطريقة فلوروميتريك مثيرة للاهتمام لتتبع تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا في عينات ثابتة أو في الوقت الحقيقي.
Disclosures
ليس لدينا شيء في الكشف عنها.
Acknowledgments
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية من أجل الديمقراطية وبحوث من قبل مجلس البحوث الأوروبي.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in - 80 ° aliquots |
| Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
| Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
| μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
| 35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
| Probenecid | Sigma | P8761 | |
| β-lactamase | Sigma | P0389 |
References
- van der Goot, F. G., Gruenberg, J. Intra-endosomal membrane traffic. Trends Cell Biol. 16, 514-521 (2006).
- Raposo, G., Marks, M. S., Cutler, D. F. Lysosome-related organelles: driving post-Golgi compartments into specialisation. Curr. Opin. Cell Biol. 19, 394-401 (2007).
- van der Wel, N., et al. M. leprae translocate from the phagolysosome to the cytosol in myeloid cells. Cell. 129, 1287-1298 (2007).
- Sansonetti, P. J., Ryter, A., Clerc, P., Maurelli, A. T., Mounier, J. Multiplication of Shigella flexneri within HeLa cells: lysis of the phagocytic vacuole and plasmid-mediated contact hemolysis. Infect Immun. 51, 461-469 (1986).
- Bobard, A., Mellouk, N., Enninga, J. Spotting the right location- imaging approaches to resolve the intracellular localization of invasive pathogens. Biochim. Biophys. Acta. 1810, 297-307 (2011).
- Beauregard, K. E., Lee, K. D., Collier, R. J., Swanson, J. A. pH-dependent perforation of macrophage phagosomes by listeriolysin O from Listeria monocytogenes. J. Exp. Med. 186, 1159-1163 (1997).
- Shaughnessy, L. M., Hoppe, A. D., Christensen, K. A., Swanson, J. A. Membrane perforations inhibit lysosome fusion by altering pH and calcium in Listeria monocytogenes vacuoles. Cell Microbiol. 8, 781-792 (2006).
- Zlokarnik, G., et al. Quantitation of transcription and clonal selection of single living cells with beta-lactamase as reporter. Science. 279, 84-88 (1998).
- Charpentier, X., Oswald, E. Identification of the secretion and translocation domain of the enteropathogenic and enterohemorrhagic Escherichia coli effector Cif, using TEM-1 beta-lactamase as a new fluorescence-based reporter. J. Bacteriol. 186, 5486-5495 (2004).
- Mills, E., Baruch, K., Charpentier, X., Kobi, S., Rosenshine, I. Real-time analysis of effector translocation by the type III secretion system of enteropathogenic Escherichia coli. Cell Host Microbe. 3, 104-113 (2008).
- Bish, S. E., Song, W., Stein, D. C. Quantification of bacterial internalization by host cells using a beta-lactamase reporter strain: Neisseria gonorrhoeae invasion into cervical epithelial cells requires bacterial viability. Microbes Infect. 10, 1182-1191 (2008).
- Ray, K., et al. Tracking the dynamic interplay between bacterial and host factors during pathogen-induced vacuole rupture in real time. Cell Microbiol. 12, 545-556 (2010).
- Blocker, A., et al. The tripartite type III secreton of Shigella flexneri inserts IpaB and IpaC into host membranes. J. Cell Biol. 147, 683-693 (1999).
- Mounier, J., et al. The IpaC carboxyterminal effector domain mediates Src-dependent actin polymerization during Shigella invasion of epithelial cells. PLoS Pathog. 5, e1000271 (2009).
- Nowicki, B., Hart, A., Coyne, K. E., Lublin, D. M., Nowicki, S. Short consensus repeat-3 domain of recombinant decay-accelerating factor is recognized by Escherichia coli recombinant Dr adhesin in a model of a cell-cell interaction. The Journal of Experimental Medicine. 178, 2115-2121 (1993).
- Nothelfer, K., Dias Rodrigues, C., Bobard, A., Phalipon, A., Enninga, J. Monitoring Shigella flexneri vacuolar escape by flow cytometry. Virulence. 2, 54-57 (2011).
- Simeone, R., et al. Phagosomal rupture by Mycobacterium tuberculosis results in toxicity and host cell death. PLoS Pathog. 8, e1002507 (2012).
