Vi beskriver en metod för att spåra endomembrane bristning som framkallas av de intracellulära bakterierna<em> Shigella flexneri<em></em</em> Och<em<em><em> Mycobacterium tuberculosis</em></em</em> Vid värdcell invasion. Vår analys utnyttjar CCF4, en värd cytoplasma FRET sond i levande eller fixerade celler. Denna reporter bryts ned av ett enzym aktivitet finns på bakteriens yta.
Shigella flexneri är patogena bakterier som invaderar värdceller ingå ett endocytic vacuole. Därefter låter bristning av detta membran-sluten avdelning bakterier att flytta inom cytosolen, föröka sig och dessutom invadera angränsande celler. Mycobacterium tuberculosis är fagocyteras av immunceller, och har nyligen visats att brista phagosomal membran i makrofager. Vi utvecklade en robust analys för att spåra phagosomal membransönderdelning efter värdcell inträde Shigella flexneri eller Mycobacterium tuberculosis. Metoden använder sig av CCF4, en FRET reporter känsliga för β-laktamas som jämvikt i cytosolen av värdceller. Efter invasion av värdceller av bakteriella patogener, förblir proben intakt så länge som bakterier bor i membran-slutna fack. Efter avbrott i vakuolen, β-laktamasaktivitet på ytan av de intracellulära patogener klyver CCF4 omedelbart ledaning till en förlust av FRET signal och byter dess emissionsspektrum. Denna robusta ratiometrisk analys ger korrekt information om tidpunkten för vakuolär bristning inducerad av de invaderande bakterier, och det kan kopplas till automatiserad mikroskopering och bildbehandling av specialiserade algoritmer för detektering av utsläpp signaler FRET givare och mottagare. Vidare medger det undersöker dynamiken i vakuolär störningar som framkallas av intracellulära bakterier i realtid i enstaka celler. Slutligen, är det perfekt för high-throughput analys med en spatio-tidsupplösning än tidigare metoder. Här ger vi de experimentella detaljer i exemplifierande protokoll för CCF4 vakuolär bristning analys på HeLa-celler och THP-1 makrofager för tidsförlopp experiment eller slutpunkter experiment med Shigella flexneri liksom flera mykobakteriestammar såsom Mycobacterium Marinum Mycobacterium bovis, och Mycobacterium tuberculosis.
Många bakteriella patogener internaliseras i membran-slutna avdelningar av eukaryota celler under loppet av infektion. Cell inträde sker antingen genom fagocytos av specialiserade värdceller, vilket är fallet för Mycobacterium tuberculosis som intas av makrofager, eller patogenerna aktivt inducera deras upptagning i typiskt icke-fagocytiska celler. I fallet med inducerat upptag, exempelvis för Shigella flexneri, injicerar den patogen effektor proteiner i den mottagande cytosolen som kapa bland andra cellfunktioner den hårt reglerade endomembrane sortering maskiner resulterar i bakteriell lokalisering inom en endosomala utrymmet 1,2. Därefter Shigella stör omslutande membranet leder till vakuolär bristning och cytosolisk åtkomst av patogenen störa värd membran människohandel och undvika leverans till lysosomen. På senare tid har phagolysosomal bristning också funnit som infektion strategy används av Mycobacterium tuberculosis, en patogen som var tänkt för en lång tid att vara uteslutande lokaliserade inom en membranbundna fack 3,17.
För att undersöka dynamiken i subcellulära membran handel med invasiva patogener, har stora förbättringar uppnåtts sedan transmissionselektronmikroskopi (TEM) baserade studier av det sena 1980-talet 4,5. Till exempel, fluorescensmikroskopiska metoder använder färgämnen, tog antikroppar mot bakteriella ytkomponenter, eller markörer för samlokalisering med subcellulära fack över 6,7. Men de fortfarande inte ger exakt Spatiotemporal upplösning och robusthet för att mäta vakuolär bristning av bakteriella patogener kvantitativt.
Detta hinder har behandlats med en analys baserad på cefalosporin härledda CCF4-AM FRET reporter som först användes för att studera genuttryck 8. Därefter användes det inom ramen för infvsnitt biologi att undersöka effek-sekretion och att följa upptaget av Neisseria i värdceller 9,10,11. Vi utvecklade en analys att dra nytta av detta reporter för att studera vakuolär bristning inducerad av Shigella flexneri 12 och Mycobacterium tuberculosis 17. Principen för vår metod beskrivs i figur 1 med användning av Shigella flexneri. Först värdceller laddas med FRET CCF4-AM substrat som är instängd i cytoplasman efter klyvning av AM-estergrupper. Därefter, celler infekterade med Shigella flexneri. β-laktamas närvarande på ytan av bakterierna är i stånd att klyva CCF4 substratet så snart som vakuolär detta skulle inträffa. Detta leder till en förlust av FRET signalen som kastar emissionstoppen från 535 nm till 450 nm vid excitering av sonden, vid 405 nm. Den ratiometrisk mätningen av 450/535 nm intensiteter belyser vakuolär integritet: låga förhållanden avspeglar membran-enslutna eller extracellulära bakterier medan höga förhållanden avspeglar kontakt mellan bakterier och värd cytosolen. Vi rapporterar också en anpassning av denna metod för att studera phagosomal bristning inducerad av Mycobacterium tuberculosis i THP-1 makrofager. De experimentella principer förblir desamma även om sekvensen är omvänd, CCF4-AM belastningen påförs endast efter bakterieinfektion.
Således, genom kvantitativa ratiometrisk fluorescensmätningar på enskild cellnivå, kan vakuolär bristning av Shigella flexneri spåras i realtid och i fasta prover från olika celltyper 12,13,14. Dessutom kan denna metod anpassas till ett antal andra invasiva patogener, såsom visas i denna studie med hjälp av Mycobacterium bovis och Mycobacterium tuberculosis. Slutligen tillåter miniatyrisering av våra protokoll till 96 väl (eller 384 väl) format screening av många förhållanden med hög genomströmning.
Den CCF4-AM/β-lactamase-analysen är en enkel metod för att spåra vakuolär störningar som induceras av intracellulära Shigella flexneri och mykobakterier i olika celltyper. Den använder sig av en laktamas känslig cytoplasmatisk FRET reporter som klyvs av ett enzym aktivt på ytan av bakterierna.
Förlust av CCF4-AM substrat kan lätt undvikas genom att lägga probenecid till alla lösningar efter laddning av substratet. Såsom visats, kan analysen anpassas till flera celltyper (epitelceller, fagocytiska celler) och format (96 väl, 35 mm glas botten rätter, 6/12/24 brunnar). För användning av den 6/12/24 brunnar används sterila täckglasen fördelade på botten av varje brunn innan sådd av cellerna. Vid slutet av experimentet, är täckglasen överfördes på bilderna i monteringsmedium, såsom Förläng Gold antifade reagens (Invitrogen). Detta sätt att signalen är stabil under längre tidsperioder efter analysenjämfört med 96 brunnar format där prover bevaras i PBS efter fixering. Den höga kostnaden för den CCF4-AM substrat bör beaktas innan bestämning av prowolymen. Det är därför vi rekommenderar att skala ner dem. Experiment är dyrare i 6/12/24 väl format, men signalerna är stabila i flera dagar. Tvärtom experiment är billigare i 96 brunnsformat, men prover måste undersökas på den dagen för experimentet. Det är anmärkningsvärt att levande experiment även kan utföras vid 96 bra eller 384 bra format. Detta låter utföra levande experiment med dussintals villkor samtidigt (muterade bakterier, MOI, plasmid eller siRNA transfektion, kemikalier etc.) med antalet positioner per brunn. Även lämpad för Shigella flexneri, markerar vi att "true" realtid eller tidsförlopp experiment är inte möjligt för mykobakterier studier eftersom infektionen cykeln överskrider mätbara koncentrationer av CCF4 som kan behållas i cytosolen. Fördenna anledning är det CCF4-AM substrat appliceras på celler endast efter invasion uppnås.
I fallet metamorfa programvara används för insamling och analys, rekommenderar vi att du använder modulen "skärm förvärv" som gör att förvärva en hel 96/384 brunnar med ett visst antal bilder per brunn. Vidare modulen "Granskningsskärmen uppgifter" gör (i) att visualisera sydda bilden mosaik av varje brunn för varje kanal samtidigt på en stor "affisch" och (ii) looping en specialiserad algoritm för att mäta intensiteten i 535 och de 450 nm kanaler. Även om, har vi kunnat mäta vakuolär bristning av enskilda bakterier med tidsförlopp mikroskopi, vill vi varna för att den enzymatiska aktiviteten på ytan av enskilda bakterier varierar vilket gör det svårt att exakt korrelera antal intracellulära bakterier och effektivitet vakuolär bristning.
Med tanke på robustheten i analysen, är det lämpligt för high genomströmning närmar på 96 eller 384 och format. Vi har också framgångsrikt anpassat detta protokoll för FACS-analys för att studera infektion av celler i suspension 16. Analysen kan även användas för undersökning av andra bakterier eller bärare presenterar laktamas på sin yta, vilket leder till ett brett spektrum av applikationer. Till exempel, kan detta tillvägagångssätt användas för att studera vakuolär bristning inducerad av andra patogener som β-laktamas uttryckande Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes eller Salmonella typhimurium 12. Eftersom Listeria monocytogenes har en kort infektionscykel jämförbar med Shigella flexneri, tidsförlopp experiment är möjliga. Däremot eftersom Legionella pneumophila och Salmonella typhimurium display långa cykler infektion, föreslår vi att utföra experiment slutpunkt.
Mångfalden av möjliga tillämpningar gör CCF4-AM/β-lactamase analysen enintressant fluorometrisk metod för att spåra vakuolär bristning induceras av intracellulära patogener i fasta prover eller i realtid.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av Agence Nationale pour la Recherche och av Europeiska forskningsrådet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |