نحن تصف طريقة لتتبع تمزق endomembrane التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا<em> الشيجلا الفلكسنرية<em></em</em> و<em<em><em> المتفطرة السلية</em></em</em> على غزو الخلية المضيفة. لدينا فحص يجعل من استخدام CCF4، مجموعة حشوية الحنق التحقيق في الخلايا الحية أو الثابتة. هذا المراسل هو المتدهورة من جراء نشاط إنزيم موجود على سطح البكتيرية.
الشيجلا الفلكسنرية هي البكتيريا المسببة للأمراض التي تغزو الخلايا المضيفة الدخول في فجوة التقامي. وفي وقت لاحق، وتمزق هذا الغشاء المقصورة المغلقة يسمح البكتيريا للتحرك داخل العصارة الخلوية، تتكاثر وتغزو المزيد من الخلايا المجاورة. والمبتلعة المتفطرة السلية من قبل الخلايا المناعية، ولقد ثبت مؤخرا إلى تمزق غشاء phagosomal في الضامة. وضعنا مقايسة قوية لتتبع phagosomal اضطراب الغشاء بعد دخول الخلية المضيفة من الشغيلة الفلكسنرية أو المتفطرة السلية. نهج يجعل من استخدام CCF4، والحنق مراسل حساسة للβ اكتاماز أن equilibrates في العصارة الخلوية للخلايا المضيفة. على غزو الخلايا المضيفة من قبل مسببات الأمراض البكتيرية، لا يزال التحقيق سليمة طالما أن البكتيريا الموجودة في غشاء المقصورات المغلقة. بعد انقطاع فجوة، والنشاط β اكتاماز على سطح يشق الممرض داخل الخلايا CCF4 على الفور تؤديجي إلى فقدان الحنق إشارة والتبديل طيف الانبعاث لها. هذا الاختبار ratiometric قوية تعطي معلومات دقيقة حول توقيت تمزق فجوي الناجمة عن البكتيريا الغازية، وأنه يمكن أن يقترن إلى المجهر الآلي ومعالجة الصور بواسطة خوارزميات المتخصصة للكشف عن الإشارات الانبعاثات من الحنق المانحة ومتقبل. وعلاوة على ذلك، فإنه يسمح التحقيق في ديناميات الاضطراب فجوي التي تسببها البكتيريا داخل الخلايا في الوقت الحقيقي في الخلايا واحد. وأخيرا، هي مناسبة تماما لتحليل الإنتاجية العالية مع قرار المكانية والزمانية تتجاوز الأساليب السابقة. هنا، ونحن نقدم تفاصيل تجريبية من البروتوكولات المثالية لCCF4 فجوي مقايسة تمزق في خلايا هيلا وTHP-1 الضامة للتجارب الوقت الفاصل بين التجارب أو نقطة نهاية باستخدام الشيجلا الفلكسنرية وكذلك سلالات المتفطرات متعددة مثل المتفطرة البحرية، المتفطرة البقرية، والمتفطرة السلية.
يتم إدماج العديد من مسببات الأمراض البكتيرية في المقصورات المغلقة غشاء الخلايا حقيقية النواة خلال مسارها من العدوى. يحدث إدخال خلية إما عن طريق البلعمة بواسطة الخلايا المضيفة المتخصصة، كما هو الحال بالنسبة لالمتفطرة السلية التي يتم تناولها من قبل الضامة، أو مسببات الأمراض تحفز بنشاط امتصاص بهم إلى عادة الخلايا غير البلعمية. في حالة امتصاص يسببها، على سبيل المثال لالشيجلا الفلكسنرية، الممرض بحقن البروتينات المستجيب في العصارة الخلوية المضيف الذي خطف من بين وظائف الخلية الأخرى ينظم بإحكام endomembrane آلات الفرز مما أدى إلى توطين البكتيرية داخل مقصورة 1،2 endosomal. وفي وقت لاحق، الشيجلا يعطل غشاء أرفق مما يؤدي إلى تمزق فجوي والوصول عصاري خلوي من مسببات المرض تتداخل مع المضيف الاتجار غشاء وتجنب التسليم إلى يحلول. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجد تمزق phagolysosomal أيضا باسم شارع العدوىتستخدم ategy بواسطة المتفطرة السلية، الممرض الذي كان يعتقد لفترة طويلة إلى أن تكون مترجمة حصرا داخل مقصورة غشاء محدد 3،17.
للتحقيق في ديناميات الاتجار غشاء التحت خلوية من مسببات الأمراض الغازية، وقد تم تحقيق تحسينات كبيرة منذ المجهر الإلكتروني انتقال (TEM) دراسات من أواخر 1980s 4،5 القائمة. على سبيل المثال، أحاطت طرق الفحص المجهري مضان القائمة على استخدام الأجسام المضادة ضد الأصباغ مكونات سطح البكتيرية، أو علامات لاشتراكهما في توطين التحت خلوية مع مقصورات أكثر من 6،7. ومع ذلك، فإنها لا تزال لا تعطي القرار الزمانية المكانية دقة ومتانة لقياس تمزق فجوي من قبل مسببات الأمراض البكتيرية كميا.
وقد عولجت هذه العقبة مع مقايسة على أساس مستمد CCF4-AM الحنق مراسل السيفالوسبورين الذي استخدم لأول مرة لدراسة التعبير الجيني 8. ثم، تم استخدامه في سياق INFعلم الأحياء ection للتحقيق في إفراز المستجيب ومتابعة امتصاص النيسيري في الخلايا المضيفة 9،10،11. وضعنا مقايسة الاستفادة من هذا المراسل لدراسة تمزق فجوي الناجم عن دوسنتاريا الفلكسنرية 12 و 17 المتفطرة السلية. يوصف مبدأ أسلوب لدينا في الشكل 1 باستخدام الشيجلا الفلكسنرية. أولا، يتم تحميل خلايا المضيف مع الحنق الركيزة CCF4-AM التي يتم محاصرين داخل السيتوبلازم بعد الشق قبالة AM الأنصاف استر. ثم، يصاب الخلايا مع الشغيلة الفلكسنرية. الحاضر β اكتاماز على السطح من البكتيريا قادرة على يلتصق الركيزة CCF4 حالما يحدث تمزق فجوي. وهذا يؤدي إلى فقدان إشارة الحنق التحول ذروة الانبعاثات من 535 نانومتر إلى 450 نانومتر على الإثارة من لجنة التحقيق في 405 نانومتر. قياس ratiometric من شدة نانومتر 450/535 يسلط الضوء على سلامة فجوي: النسب المنخفضة تعكس غشاء ENالبكتيريا مغلق أو خارج الخلية بينما نسب عالية تعكس الاتصال بين البكتيريا والعصارة الخلوية المضيف. نحن أيضا تقريرا للتكيف من هذا الأسلوب لدراسة تمزق phagosomal الناجم عن المتفطرة السلية في THP-1 الضامة. المبادئ التجريبية لا تزال هي نفسها على الرغم من أن التسلسل هو عكسه، يتم تطبيق CCF4-AM تحميل فقط بعد الإصابة البكتيرية.
وهكذا، من خلال القياسات الكمية مضان ratiometric على مستوى خلية واحدة، يمكن تتبع تمزق فجوي من الشغيلة الفلكسنرية في الوقت الحقيقي والثابت في عينات من أنواع مختلفة من الخلايا 12،13،14. وعلاوة على ذلك، يمكن تكييف هذه الطريقة لعدد من مسببات الأمراض الغازية الأخرى كما هو موضح في هذه الدراسة باستخدام المتفطرة البقرية والمتفطرة السلية. وأخيرا، فإن التصغير من بروتوكول لدينا إلى 96 جيدا (أو 384 أيضا) صيغ يسمح فحص ظروف عديدة في إنتاجية عالية.
مقايسة CCF4-AM/β-lactamase هي طريقة مباشرة لتعقب انقطاع فجوي الناجم عن الخلايا الشيجلا الفلكسنرية والمتفطرات في أنواع مختلفة من الخلايا. فإنه يجعل من استخدام اكتاماز الحساسة حشوية الحنق المراسل أن هو المشقوق بواسطة انزيم نشط على سطح البكتيريا.
فقدان الركيزة CCF4-AM يمكن بسهولة تجنبها عن طريق إضافة البروبينسيد إلى جميع الحلول بعد تحميل الركيزة. كما يتبين ذلك، يمكن تكييفها الفحص إلى أنواع خلايا متعددة (الخلايا الظهارية وخلايا البلعمة) والأشكال (96 جيد، 35 مم أطباق أسفل الزجاج، 6/12/24 لوحات جيدة). لاستخدام لوحة جيدا 6/12/24، يتم توزيع coverslips على العقيمة في الجزء السفلي من كل بئر قبل البذر الخلايا. في نهاية التجربة، يتم نقل coverslips على على الشرائح المتوسطة في تصاعد مستمر، مثل إطالة الذهب الكاشف Antifade (إينفيتروجن). بهذه الطريقة إشارة مستقرة لفترات زمنية أطول بعد الفحصمقارنة مع الآبار شكل 96 حيث يتم الاحتفاظ العينات في برنامج تلفزيوني بعد التثبيت. ينبغي أن تؤخذ في ارتفاع تكلفة الركيزة CCF4-AM بعين الاعتبار قبل تحديد حجم العينة. هذا هو السبب في أننا نوصي رفع عليهم. التجارب هي أكثر تكلفة في 6/12/24 شكل جيد ولكن الإشارات مستقرة لعدة أيام. على العكس من ذلك، والتجارب هي أرخص في شكل جيد 96، ولكن العينات يجب أن يتم تحليلها في يوم التجربة. ومن الجدير بالذكر أن التجارب الحية ويمكن أيضا أن يؤديها في البئر 96 أو 384 شكل جيد. وهذا يسمح أداء التجربة الحية باستخدام العشرات من ظروف في نفس الوقت (بكتيريا متحولة، وزارة الداخلية، ترنسفكأيشن البلازميد أو سيرنا، والمواد الكيميائية وغيرها) مع عدد من المواقف لكل بئر. على الرغم من أن مناسبة للدوسنتاريا الفلكسنرية، ونحن نسلط الضوء على أن "الحقيقي" في الوقت الحقيقي أو التجارب مرور الزمن ليست مجدية للدراسات المتفطرات منذ دورة العدوى يتجاوز تركيزات قابلة للقياس من CCF4 التي يمكن الاحتفاظ بها في العصارة الخلوية. إلىهذا السبب، يتم تطبيق الركيزة CCF4-AM على الخلايا فقط بعد تحقيق الغزو.
في حال تم استخدام البرمجيات MetaMorph لاقتناء وتحليل، ونحن نوصي باستخدام الوحدة النمطية "اقتناء شاشة" الذي يسمح الاستحواذ على كامل 96/384 لوحة جيدا مع عدد محدد من الصور لكل بئر. وعلاوة على ذلك، وحدة "البيانات الشاشة الآراء" يسمح (ط) تصور هذه الفسيفساء صورة مخيط من كل بئر لأية قناة في نفس الوقت على "ملصق" كبيرة و(II) حلقات خوارزمية المتخصصة لقياس شدة في 535 و القنوات نانومتر 450. على الرغم من ذلك، كنا قادرين على قياس تمزق فجوي عن طريق البكتيريا واحدة باستخدام الوقت الفاصل بين المجهري، نود أن نحذر من أن النشاط الأنزيمي على سطح البكتيريا الفردية تختلف مما يجعل من الصعب ربط على وجه التحديد عدد من البكتيريا داخل الخلايا وفعالية فجوي تمزق.
نظرا لمتانة للمقايسة، هي مناسبة لمدة ساعةيقترب الإنتاجية IGH في 96 أو 384 صيغ بشكل جيد. نحن أيضا تكيفت بنجاح هذا البروتوكول لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية لدراسة إصابة الخلايا في التعليق 16. ويمكن أيضا أن تستخدم الفحص للتحقيق من البكتيريا أو شركات الطيران الأخرى تقديم اكتاماز على سطحها، مما يؤدي إلى مجموعة واسعة من التطبيقات. على سبيل المثال، فإن هذا النهج يمكن استخدامها لدراسة تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض الأخرى مثل β-اكتاماز معربا عن البكتيريا المستروحة، المستوحدة الليستيريا أو السالمونيلا التيفية الفأرية 12. منذ المستوحدة الليستيريا لديه دورة العدوى قصيرة مماثلة لالشيجلا الفلكسنرية، تجارب الوقت الفاصل بين ممكنة. في المقابل، لأن البكتيريا والسالمونيلا التيفية الفأرية المستروحة عرض دورات عدوى طويلة، فإننا نقترح على إجراء تجارب نقطة نهاية.
مجموعة متنوعة من التطبيقات الممكنة يجعل فحص CCF4-AM/β-lactamase علىطريقة فلوروميتريك مثيرة للاهتمام لتتبع تمزق فجوي الناجمة عن مسببات الأمراض بين الخلايا في عينات ثابتة أو في الوقت الحقيقي.
The authors have nothing to disclose.
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل الوكالة الوطنية من أجل الديمقراطية وبحوث من قبل مجلس البحوث الأوروبي.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
LiveBlazer FRET-B/G Loading Kit (CCF4-AM) | Invitrogen | K1089 | Protect from light, stock in – 80 ° aliquots |
Draq5 | Biostatus | DR50050 | |
Poly-L-lysine | Sigma | P9155 | |
μCLEAR-PLATE, BLACK, 96 well | Greiner Bio-One | 655090 | |
35 mm glass bottom dishes | MatTek corp. | P35G-1.5-10-C | |
Probenecid | Sigma | P8761 | |
β-lactamase | Sigma | P0389 |